三层层电纺丝技术模拟天然动脉结构：基于聚己内酯、弹性蛋白和胶原蛋白的初步研究

摘要

本研究旨在模拟动脉壁天然的三层结构。为实现这一目标，采用静电纺丝技术，使用3-1（输入-输出）喷嘴，以及聚己内酯、弹性蛋白和胶原蛋白的混合物。

摘要

在天然动脉中，胶原蛋白和弹性蛋白发挥着重要作用，可提供机械支撑，防止血管破裂，并在脉动变形下促进恢复。本研究旨在通过制备一种多层电纺管状支架来模拟天然动脉的结构，该支架由聚己内酯（PCL）构成，并添加弹性蛋白和胶原蛋白，其组成为PCL-ELAS-COL 45-45-10、55-35-10和65-25-10三种混合比例，以展示出接近天然动脉组织的力学性能，同时保持有利于组织再生的特性。对整体移植物及各单层结构进行了单轴拉伸测试、动态顺应性、缝线保留力和爆破强度分析。顺应性结果表明，中间层（中膜层）的改变会影响移植物的整体行为，整体移植物的顺应性值范围为0.8 - 2.8 % / 100 mmHg，而单轴拉伸结果显示平均模量范围为2.0 - 11.8 MPa。模量和顺应性数据均处于天然动脉的数值范围内。通过数学建模分析了各层刚度变化对整体周向管壁应力的影响，并以此作为设计辅助工具，以获得最佳的材料力学组合。总体而言，结果表明可通过调节各层特性来设计出模拟三层结构的血管移植物。

方案

1. 在进行静电纺丝之前，必须使用乙酸基方法从6个月大的牛皮真皮中提取胶原蛋白。提取后的胶原蛋白再通过一系列溶解、沉淀和透析步骤进行纯化。胶原蛋白经冷冻干燥后，即可开始静电纺丝过程。
2. 称取三种材料：聚己内酯（PCL）、弹性蛋白（ELAS）和胶原蛋白（COL）。这些材料将分别溶解于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFP, TCI America）中，浓度分别为100 mg/ml、200 mg/ml和70 mg/ml。
3. 将上述材料按体积比混合于五个不同的闪烁瓶中，比例分别为98-2-0 PCL-ELAS-COL（内膜层）、45-45-10、55-35-10和65-25-10 PCL-ELAS-COL（中膜层），以及70-0-30 PCL-ELAS-COL（外膜层）。
4. 为进行单轴拉伸测试和各层独立顺应性测试，每种材料均单独进行静电纺丝；而用于爆破压力、缝线保留力和顺应性测试的多层血管移植物则采用3:1的结构进行静电纺丝。单轴拉伸测试用支架为平面矩形（2.5 cm宽 × 10.2 cm长 × 0.3 cm厚），因为用于静电纺丝单层及多层移植物的2 mm直径心轴过小，无法冲裁测试样品。
5. 无论是单层还是多层静电纺丝，均将聚合物溶液装入带有18号钝头针头的3 ml塑料Becton Dickinson注射器中，并置于设定流速的注射泵上。单层静电纺丝的流速设定为4 ml/hr，而多层静电纺丝的流速则根据过渡阶段和各层不同而调整。具体流速与体积如下：内膜层以4 ml/hr的流速纺丝0.5 ml，随后进入过渡阶段，内膜与中膜注射器同时工作，各以2 ml/hr流速共纺0.2 ml。之后关闭内膜注射器，中膜层以4 ml/hr流速继续纺丝0.6 ml，再进入中膜与外膜之间的过渡阶段，两注射器各以2 ml/hr流速共纺0.2 ml聚合物溶液。最后停止中膜层，外膜层以4 ml/hr流速纺丝0.4 ml。
6. 所有样品在测试前均在50 mM EDC中交联18小时¹。
7. 单轴拉伸测试在PBS中水化24小时后的一片静电纺丝材料上取六个样品进行。“狗骨”形样品由静电纺丝膜冲裁获得，并在MTS Bionix 200测试系统上进行测试，配备100 N载荷传感器，拉伸速率为10.0 mm/min。使用TestWorks 4.0版本软件计算最大应力、模量和断裂应变。
8. 缝线保留力测试在六种不同静电纺丝移植物中各取一段内径为2 mm的管状样本上进行，样本在37°C PBS中浸泡24小时后，使用MTS Bionix 200测试系统（MTS Systems Corp.）和50 N载荷传感器，以150.0 mm/min的拉伸速率，按照美国国家标准协会规定的“直线穿过”程序进行测试²。使用5-0商用PDS II紫色单丝缝线，在距样本末端2 mm处穿入，并持续拉伸直至缝线完全穿过移植物。使用TestWorks 4.0版本软件记录峰值载荷，单位为克力（grams-force）。
9. 爆破强度测试在六种不同静电纺丝移植物中各取一个样本进行。长度为2–3 cm的爆破测试管在PBS中水化后，套在设备连接的直径1.5 mm乳头状接头上，并用2-0丝线固定。向系统内通入空气，以5 mmHg/s的速度增加压力，直至管道破裂。结果以管道破裂时的压力（mmHg）表示。
10. 动态顺应性测试在六种不同静电纺丝移植物中各取一段内径为2 mm、长度为3 cm的管状移植物上进行，测试条件模拟生理环境。单层及多层管状结构均在相同条件下进行静电纺丝和测试。样品在Tissue Growth Technologies开发的智能组织工程机械刺激（ITEMS）生物反应器中进行测试，反应器内充满37°C的PBS。生物反应器向移植物内部施加1 Hz的周期性压力变化，研究三种不同的压力水平：90/50、120/80和150/110 mmHg（收缩压/舒张压）^{2, 3}。

代表性结果

如果静电纺丝操作步骤正确执行，最终产物应为一根柔软、无缝的管状物，各层之间无初始分层迹象。当进行单轴拉伸试验、爆破强度试验、缝线保留力试验和顺应性试验时，结果应表明：随着中层刚度增加且弹性蛋白含量减少，相应的力学性能将显示出管状物变得更刚硬。

讨论

本研究最关键的步骤是静电纺丝过程。使用3-1输入-输出喷嘴时，可能会发生电弧放电和电荷损失。一旦发生这种情况，与正在纺丝的聚合物相关的电压将下降，导致纤维熔融粘连、呈现“湿润”状态，并在三层结构之间产生分层现象。因此，保持稳定的电势对于获得理想的多层管状结构至关重要。

顺应性不匹配是小直径血管移植物闭塞的主要原因之一。开发多层结构的血管移植物能够定制移植物的特性，使其更接近天然动脉的生物力学性能和组织结构。随着多层血管移植物制备工艺的逐步推进，本实验室将进一步探究其潜在局限性，包括支架在降解过程中可能发生的层间剥离，以及孔径大小是否足以支持细胞浸润。为验证上述问题，将同时对无细胞和细胞化移植物进行测试 体外 将在静态和动态培养条件下进行降解研究。这些测试将确定支架的迁移能力及其在生理条件下的有效降解情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚己内酯	Sigma-Aldrich
弹性蛋白	Elastin Products Company
胶原蛋白
乙酸	Fisher Scientific
氯化钠	Fisher Scientific
TRIS	Fisher Scientific
6 L Avanti J-HC 离心机	Beckman Coulter Inc.
1,1,1,3,3,3 六氟-2-丙醇	TCI America
3 ml Becton Dickinson 注射器
CZE1000R 机架式电源	Spellman
高压注射泵	Cole-Parmer
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺	Pierce, Thermo Scientific
70 % 乙醇	Sigma-Aldrich
ImageTool 3.0 软件	由 UTHSCSA 提供的共享软件
扫描电子显微镜	Carl Zeiss, Inc.
MTS Bionix 200 材料测试系统	MTS Systems Corp.
TestWorks 版本 4
通过机械刺激实现智能组织工程（ITEMS）生物反应器	Tissue Growth Technologies