双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

摘要

采用三种单波长短脉冲激光的组合来产生相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）。这两种信号的差异可显著增强原本难以检测的相干拉曼信号的灵敏度，从而实现对弱拉曼散射体的成像。

摘要

过去十年中，由于相干拉曼成像技术有望实现具有高分子特异性的无标记光学成像，该领域的研究活动显著增加¹。然而，这些技术的灵敏度比荧光低数个数量级，通常需要毫摩尔级别的分子浓度才能检测^1,2。本文介绍一种可通过利用强信号或高丰度拉曼散射分子的信号来放大弱信号或低浓度拉曼活性分子信号的技术。短脉冲激光与生物样品相互作用时，会产生多种相干拉曼散射信号，每种信号均携带有关样品的独特化学信息。通常仅使用其中一种信号（例如相干反斯托克斯拉曼散射，CARS）生成图像，而其余信号则被舍弃。然而，当收集并比较其他信号（包括三色CARS和四波混频，FWM）与CARS信号时，便可提取原本难以检测的信息³。例如，双共振CARS（DR-CARS）是由两个共振信号之间的相长干涉所产生的结果⁴。我们展示了如何调节产生DR-CARS信号所需的三束激光，使其分别对应脂质中2845 cm^-1的CH伸缩振动和氘代分子（如氘代糖类、脂肪酸等）中2120 cm^-1的CD伸缩振动，从而同时探测这两个拉曼共振。在此条件下，除了来自每个共振的CARS信号外，还会生成一个同时探测两者的组合型DR-CARS信号。我们进一步说明，通过检测DR-CARS信号与来自高丰度分子振动的放大信号之间的差值，可增强对弱信号的探测灵敏度。我们还证明，该方法甚至可扩展至两种信号分别来自不同分子的应用场景，例如利用溶剂的强拉曼信号来增强稀溶液中溶质的弱拉曼信号。

方案

1. 生成CARS和DR-CARS信号

为了同时产生CARS和DR-CARS信号，需要三个可调谐且同步的短脉冲激光光源。

1. 为了获得三个同步的脉冲，我们从一台10 W的激光器（PicoTrain，HighQ Laser, Inc.）开始。该激光器的波长固定为1064 nm，脉冲宽度固定为7 ps，重复频率固定为76 MHz。
2. 通过一系列半波片和偏振分束立方体，将光束分为三部分。结合使用半波片和偏振分束立方体，可调节每束光中的功率，而不会改变其传播方向。通常将两束光的功率分别调节至约4.5 W，第三束光则包含剩余的1 W。
3. 随后将两个高功率光束分别导入两个独立的光学参量振荡器（OPO，Avante，APE GmbH，柏林，德国）。OPO利用差频产生过程，将一个高能光子转换为两个不同波长的低能光子。通过控制实现该效应所用晶体的温度，可将所产生的光子波长控制在0.1 nm范围内。通过对这些信号进行倍频，原本波长为1064 nm的固定波长激光可转变为可在780 nm至910 nm范围内任意调谐的激光束。通过使用同一台1064 nm激光器泵浦两个独立的OPO，我们可获得两个独立可调谐的激光光源，且它们自动与原始泵浦激光同步。
4. 来自1064 nm泵浦激光器的第三束（最低功率）光束通过二向色镜组合绕过OPO，以便后续将三束光（两个来自OPO，一个来自泵浦激光器）重新合并。为了高效产生相干拉曼信号光子，合并后的脉冲必须在时间和空间上完全重叠。由于OPO包含环形谐振腔，使每个激光脉冲在晶体中多次通过，导致经过OPO的光束传播路径更长，相对于原始泵浦光束产生显著延迟。必须通过第三束光补偿这一路径差，即引入额外的反射镜，使该光束在重新合并前传播与另两束光相同的距离。
5. 为了精细调节各光束传播路径的长度，我们在每条光路中引入使用棱镜后向反射器的可调延迟平台。
6. 在每条光路中再添加一组半波片和偏振分束立方体，使我们能够独立调节每束光的功率，而不影响OPO的输入功率。
7. 使用二向色镜首先将两个OPO输出的光束合并，再与1064 nm光束合并。必须确保各光束精确重叠（即共线且发散角相似）。可通过比较光束在靠近（几厘米内）和远离（约1 m）二向色镜位置的重叠情况来检查对准效果。
8. 使用脉冲激光的优势在于，每个脉冲可在样品上实现较高的峰值能量，从而高效产生相干拉曼信号，同时仍保持较低的平均强度。过高的平均强度可能损伤样品。因此，为了在不牺牲峰值能量的前提下进一步控制平均强度，将合并后的三束光通过一个电光调制器（Pockels盒，ConOptics），该调制器作为脉冲选择器，可调节到达样品的脉冲重复频率，从而调节平均强度。
9. 合并后的激光束随后被耦合至一台配备高数值孔径（NA）物镜的倒置显微镜。该物镜通常为60倍水浸物镜，数值孔径（NA）为1.2，并针对OPO可调谐范围及1064 nm光束的色差进行了校正。高NA物镜产生的紧密聚焦可在微米尺度上最有效地激发相干拉曼信号。
10. 为充分填充显微镜物镜的后端口，需对合并后的光束进行扩束。通过充分填充物镜后端口，可实现最佳聚焦条件，从而在显微系统中获得最佳空间分辨率。
11. 显微镜中的物镜安装在XYZ压电平台上，使我们能够通过光束在样品上的逐行扫描获得图像，类似于商用的光束扫描共聚焦显微镜。

2. 三种短脉冲激光的应用

使用三束短脉冲激光会产生多个CARS信号，这些信号来自两两激光组合的各种组合方式，以及三束激光共同作用产生的三色CARS和DR-FWM信号。

1. 信号的波长在光谱上可能彼此非常接近。当信号靠得较近时，使用固定波长带通滤光片和二向色镜难以将其分离以进行分析。因此，我们将信号导入成像光谱仪（SpectraPro 2300i，Acton Research）中，该仪器同时作为高效的单色仪，将不同波长的信号在空间上分离开来。
2. 光谱仪内部装有一个电子驱动的翻转镜，当其处于下降位置时，将信号引导至背照式深耗尽电荷耦合器件（CCD）相机，从而在整个信号范围内获取光谱信息，使我们能够识别并优化各种相干拉曼信号。
3. 为了选择用于成像的信号，我们仅需使用厂商提供的控制与数据采集软件（WinSpec，Princeton Instruments）调节光谱仪内的光栅旋转，使目标信号的峰值对准CCD相机中心，随后改变翻转镜的位置，将该信号重定向至第二个出射口，该出射口连接有一个单光子计数雪崩光电二极管（APD）。
4. 然后通过物镜进行光栅扫描，并利用数据采集软件（SymPhoTime，Picoquant GmbH，柏林，中国台湾）显示每个像素的光子计数率，将APD记录的信号生成图像。
5. 我们对每一个期望的相干拉曼信号重复上述成像过程，以便在后期处理中对不同信号进行比较。

3. 样品制备

为了获得清晰且可重复的图像，在制备样品时必须格外注意。

1. 样品通常制备在约150微米厚的玻璃盖玻片上。这种盖玻片足够薄，可使用通常采用的1.2数值孔径（NA）物镜进行高分辨率成像。
2. 当激光通过微小透明物体发生衍射时，可对介电物体产生光镊效应。使用 tightly focused（高度聚焦）、高峰值功率、短脉冲的激光束可能会拖拽小细胞或细菌，导致图像模糊或拖影。为避免此现象，可通过旋涂法在玻璃盖玻片表面先涂覆一层聚-L-赖氨酸，以将样品固定在盖玻片表面。
3. 对于培养细胞，可使用玻璃底培养皿，从而无需将细胞从原培养皿中分离即可直接成像。
4. 在本研究的演示中，我们首先将经甲醛固定的C. elegans线虫放置于玻璃盖玻片上。
5. 然后向线虫加入20 μL的5 M氘代葡萄糖溶液。氘代葡萄糖溶液可提供独特且强烈的拉曼背景信号。

4. 样品分析

为了充分利用双共振增强效应，必须已知两种拉曼共振物质的拉曼光谱。

1. 样品在盖玻片上制备完成后，使用共聚焦拉曼显微镜进行分析，以获取相关的自发拉曼光谱并识别合适的峰位。
2. 为了执行双共振相干反斯托克斯拉曼散射（DR-CARS），我们确定与脂质相关的CH伸缩振动模式和与氘代葡萄糖相关的CD伸缩振动模式的光谱位置分别为2845 cm^-1和2121 cm^-1。
3. 当两束激光之间的频率差与分子振动频率相匹配时，即可实现相干拉曼散射。通过将一个OPO调谐至817 nm，与1064 nm激光束结合后可探测2845 cm^-1的CH振动模式；将另一个OPO调谐至868 nm，与1064 nm激光束结合后可探测2121 cm^-1的峰位。
4. 通过对样品在CARS显微镜下进行光栅扫描，我们现在可以观察到三个感兴趣的相干拉曼信号：探测CH伸缩振动的CARS信号、探测CD伸缩振动模式的CARS信号，以及同时探测两者的DR-CARS信号。
5. 我们按照第2.3节所述选择每个峰位，并如上所述采集图像。

5. 图像处理

基于这三幅图像提取额外信息现在需要一些相对简单的图像处理。

1. 首先必须对图像进行归一化处理。理论上，可以通过校正每个信号生成过程中所用激光的强度来实现归一化。然而在实际操作中，这种方法并不总是有效，主要原因在于二向色镜、探测器和光栅的光谱响应不均匀。
2. 一种实用的归一化方法基于以下事实：在以纯脂质为主的区域，CD共振不应贡献任何信号；同样，在纯葡萄糖溶液区域，CH共振也不应贡献任何信号。基于此，我们将氘代葡萄糖溶液在CD共振处获得的DR-CARS图像和CARS图像，归一化至C. elegans线虫外部一个应无CH共振的区域。
3. 然后，在CH共振CARS图像中识别线虫体内富含脂质的区域，并将其与归一化后的DR-CARS图像中对应区域进行归一化。为使该方法有效，我们假设在此区域深处不存在氘代葡萄糖，这一假设是合理的，因为脂质具有疏水性，不会与溶液混合。
4. 现在，通过从归一化后的DR-CARS图像中减去归一化后的CH共振CARS图像，即可得到仅放大的CD共振信号。
5. 类似地，通过从归一化后的DR-FWM图像中减去归一化后的CD共振CARS图像，即可得到仅放大的CH共振信号。

6. 代表性结果

图1：如上所述的DR-CARS显微成像系统的示意图。

图2：置于盖玻片上、准备成像的秀丽隐杆线虫（C. elegans）在氘代葡萄糖溶液中的白光图像。

图 3：经过炔基修饰（碳-碳三键基团）的油酸（一种不饱和脂肪酸）的拉曼光谱。 在 2845 cm^-1 处强烈的 CH 振动峰和在 2100 cm^-1 处的炔基振动峰均与指纹区（峰密集区域）良好分离，因此非常适合作为相干拉曼成像的理想标记信号。

图 4：当三束短脉冲激光在样品内重叠时产生的相干拉曼信号的典型光谱。 箭头指向各信号对应的过程，由能级图表示。图中虚线箭头表示来自激光器和光参量振荡器（OPO）的光子，实线箭头表示产生的信号。实线水平线表示拉曼振动的能量，直观地说明在差分相干反斯托克斯拉曼散射（DR-CARS）中，同时混合相同的三个输入光子可探测两种不同的拉曼振动。

图5：利用DR-CARS和CARS对C. elegans线虫成像的典型结果。 第一行使用图4中标示的三种信号对置于氘代葡萄糖溶液中的线虫进行成像。第二行为经过适当归一化处理的图像，第三行为通过从DR-CARS图像中减去各CARS图像得到的差值图像。

讨论

拉曼光谱和基于拉曼的成像技术是生物科学中强大的新兴工具。目前，这些技术尤其适用于在脂质的加工与储存过程中，对细胞代谢及代谢紊乱进行活体（in vivo）和体外（in vitro）研究。大多数生物大分子含有大量相似的、主要是碳基的分子键，因此从细胞和生物体获得的拉曼光谱通常是来自脂质、蛋白质、核酸、糖类等成分贡献的叠加。由于脂质倾向于形成致密的液滴或双分子层，并且含有大量脂肪族CH键的长链结构，因此相对容易从这些复杂的光谱中分离出来。然而，在复杂的细胞环境中，我们对特定蛋白质、氨基酸、RNA或DNA的识别能力却非常有限，特别是当这些目标分子的浓度仅为微摩尔（μM）甚至更低时。在此背景下，利用我们新引入的差分受激拉曼散射（DR-CARS）成像技术探测微弱拉曼共振信号的能力，为这些分子的化学微分析与成像提供了潜在的强大手段。诚然，该实验方案中最复杂的部分在于激光系统的准直与同步。从零开始时，脉冲的同步——即确保脉冲尽管经过不同光路仍能在时间上重叠——可通过使用脉冲自相关仪来简化。一旦实现空间和时间上的重叠，CARS和DR-CARS信号应可被轻易检测到。然而，初次准直通常较为粗糙，导致信号较弱。最佳的系统准直实践是首先产生微弱信号，然后通过轻微调节各光路中的反射镜以及使用延迟装置优化时间重叠，逐步增强信号强度。尽管光谱仪/单色仪能有效屏蔽环境光，但要获得最干净的结果，仍建议在关闭室内照明的条件下操作，并使用窗帘或镜头遮光管，以最大限度减少来自其他光源（如计算机显示器、指示灯、LED等）的背景干扰。

我们特定的实验装置采用单光子计数雪崩光电二极管（APD）探测器和时间相关单光子计数（TCSPC）硬件进行检测⁵。这使我们能够以相对较低的噪声检测到极微弱的信号，但许多研究团队在进行类似测量时发现，使用增益可调的光电倍增管（PMT）更具优势。PMT 的优势在于其增益可调，并且具有更大的探测面积，这可以简化探测器的光路对准。此外，我们的装置利用压电位移台移动物镜，以实现光束扫描。这种方法的优势在于，我们能够以很高的精度返回此前扫描图像中的任意位置，并进行额外测量，包括自发拉曼光谱。其他研究团队已成功采用扫描镜组件，甚至完整的共聚焦扫描系统（如 Olympus FluoView 系统），后者可实现更快的成像速度，但在精确返回图像中任意位置方面能力有限。

将激光器调节至与拉曼共振匹配也是关键步骤，可能需要进行一些优化。尽管拉曼峰的位置可能已知，但由差频拉曼相干反斯托克斯拉曼散射（DR-CARS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）获得的最大光谱峰强度并不一定对应于自发拉曼峰的峰值位置。这是由于四波混频产生的信号存在固有的干涉，导致出现非共振背景信号与CARS信号叠加，从而使CARS光谱相对于自发拉曼光谱发生畸变。CARS信号峰的光谱位置可以计算得出，但更实用的方法是在预期拉曼共振位置附近，以多个较小的光谱步长调节光学参量振荡器（OPO）。该过程应能获得一个明显的信号最大值。事实上，为了从差频四波混频（DR-FWM）中获得最高的灵敏度，必须将两个共振均调节至该最大值处。

还有一点关于DR-CARS方法的潜在问题需要讨论，即DR-CARS信号依赖于拉曼活性放大分子的均匀分布。对于大多数生物样品而言，这种放大分子可能是水中广泛存在且几乎无处不在的宽OH共振峰。然而，水会被细胞内的疏水区域（如脂滴）排除在外，因此若利用水的共振峰来放大脂质振动模式，会导致所获得信号的失真。在我们的示例中，我们使用了氘代葡萄糖溶液，以在生物样品中产生一个易于检测且信号强烈的响应。类似地，也可以使用重水（氘代水）或氘代生物缓冲液（如d-HEPES）。在本例中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内的脂滴足够小，始终能保证在系统聚焦激光光斑范围内同时包含氘代葡萄糖溶液和脂质成分。然而，这种情况并不具有普遍性。一个典型的反例是脂肪细胞，其细胞质内会形成较大的脂滴。这意味着，任何采用DR-CARS技术开展的实验都需要进行仔细的样品制备和对照实验，以验证结果的可靠性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60倍水浸物镜	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
倒置显微镜	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
普克尔斯盒	ConOptics	350-160
皮秒泵浦激光器	HighQ	IC-1064-10000
光学参量振荡器	APE	Levante IR
1.5号玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
半波片	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
偏振分光棱镜立方体	Thorlabs Inc.	PBS052 或 PBS053
光谱仪/单色仪	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD相机	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
雪崩光电二极管	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ压电载物台	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	此为XY载物台与Z轴物镜 holder 的组合
二向色镜	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	这些特定的二向色镜并非关键，任何具备合适透射/反射特性的组合均可满足要求。
二向色镜	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	用于合并不同的近红外激光束
时间相关单光子计数（TCSPC）板卡	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime成像软件	PicoQuant
Matlab	Mathworks