使用丙烯酰胺水凝胶的细胞功能的研究矩阵刚度的影响

Summary

可以仿照下层刚度对细胞功能的影响在体外使用不同的符合标准的聚丙烯酰胺凝胶。

Abstract

组织刚度，是一个重要的细胞功能因素，并组织刚度的变化通常与纤维化，癌症和心血管^疾病的1-11的关联。传统的细胞研究细胞功能的生物方法涉及一个刚性基质上培养细胞（塑料餐具或盖玻片），它可以不考虑弹性ECM或流脑组织之间的刚度变化的影响。 在体内组织遵守的条件，在体外模型，我们和其他人使用ECM涂水凝胶。在我们的实验室，是基于水凝胶聚丙烯酰胺可以模仿生物¹²见过的组织符合。除了3 APTMS孵化用NaOH产生"反应"的盖玻片。戊二醛是用于交叉连接的3 APTMS和聚丙烯酰胺凝胶。用于水凝胶的聚合丙烯酰胺（AC），双丙烯酰胺（BIS - AC），过硫酸铵溶液。 N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）是纳入交联的ECM蛋白凝胶交流解决方案。聚合凝胶，凝胶表面涂有流脑的首选，如纤维连接蛋白，vitronectin，胶原蛋白等蛋白质

水凝胶的硬度，可以由流变或原子力显微镜（AFM）和由不同的解决方案^中的12的交流和/或双AC百分比调整。在这种方式下，下层刚度可以匹配生物组织的刚度，也可使用流变或AFM量化。细胞可以接种这些水凝胶和培养根据所需的实验条件。成像的细胞和分子生物学分析他们的恢复很简单。在这篇文章中，我们定义为那些有<3000帕斯卡与E和僵硬的组织下层/> 20,000帕斯卡的弹性模量（E）软下层。

Protocol

制备

• 盖玻片应高压灭菌。
• 应使用无菌蒸馏水或去离子水，准备解决方案和洗涤盖玻片。
• AC（40％W / V）和双AC（1％W / V）的解决方案是0.2微米的过滤消毒。不久之前使用无菌过滤，准备10％过硫酸铵（APS;100μg/ml水）。每月更换的APS解决方案。
• 不能进行高压灭菌，如3 APTMS，氯仿，戊二醛，NHS的，并SurfaSil化学试剂均保存在分配瓶仅用于水凝胶的制备。
• 凝胶为了达到最佳效果，应利用适当的ECM蛋白孵育过夜后一两天内。
• 在氯仿（10毫升通常足以供20个顶级盖玻片）的10％SurfaSil解决方案之前准备在50毫升聚丙烯猎鹰管的水凝胶的浇筑。 （我们的实验室通常siliconizes在0.5％戊二醛孵化步骤盖玻片）。添加盖玻片猎鹰管和岩石至少10分钟。倒出SurfaSil解决方案和空气干燥凝胶将准备在生物安全柜的盖玻片上Kimwipes。
• 准备热灭活的BSA溶液如下:PBS中的自由脂肪酸的牛血清白蛋白20毫克/毫升的解决方案是在一个68℃水浴30分钟孵育。解决的办法是无菌过滤，并保存在4 ° C

程序

1. 广场上的一个150毫米的培养皿底部的半层的封口膜。
2. 广场9 25毫米的封口膜顶部盖玻片覆盖1毫升0.1 M的氢氧化钠。孵育3分钟，然后吸真空线。
3. 在化学罩，放....

Discussion

凝胶聚合过程的一个关键因素是，以避免气泡的形成，这将使细胞绑定到ECM涂层凝胶本身，而不是玻璃盖玻片。这是可以预防的仔细吹打后震荡和可视化，确保无气泡已成为被困在凝胶的聚合解决方案。我们始终建议准备额外的"反应"盖玻片和凝胶，以确保有足够的实验。

凝胶用PBS冲洗时，应特别注意支付。吸痰过程中必须避免与水凝胶本身，因为它可能被抓住，撕裂的密切联系。最安全的方式吸出无扰动水凝胶的液体，是给小费的板块，而吸痰。

这是很难获得完全公平的水凝胶，水凝胶厚度的微观差异可能会导致在不平的表面，使很难集中整个视场的图像。可以专注于相对较小的地区，我们发现，这种做法是最相衬epifluorescence应用如图所示足够。 2。随着放大倍数的增加，这个问题就变得更加严重，使高分辨率，如蛋白质的共定位分析是最好的共聚焦显微镜光学切片分析。共聚焦显微镜使用的标准程序进行，但水凝胶，可能需要倒到盖玻片，而不是一个幻灯片，以适应工作的目标，在一个倒置的共聚焦显微镜的距离。

这是在.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
戊二醛，70%	Sigma-Aldrich	G7776	储存在 -20°C
3-APTMS（3-氨基丙基三甲硅烷 97%）	Sigma-Aldrich	281778	在室温下储存
SurfaSil 硅化液	Thermo Fisher Scientific， Inc.	42800	室温储存
NHS （N-羟基琥珀酰亚胺酯）	Sigma-Aldrich	A-8060	储存于 4°C 每月更换白
蛋白、牛血清、基本不含脂肪酸	的 Sigma-Aldrich	A6003-100G	储存在 4°C
盖玻片 （25 mm）	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
盖玻片 （18 mm）	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D