基底硬度对细胞功能的影响可被模拟 体外 使用不同顺应性的聚丙烯酰胺水凝胶。
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摘要
摘要
组织硬度是细胞功能的重要决定因素，组织硬度的改变通常与纤维化、癌症和心血管疾病相关。1-11传统的细胞生物学研究细胞功能的方法通常是在刚性基质（如塑料培养皿或玻璃盖玻片）上培养细胞，这类基质无法模拟弹性细胞外基质（ECM）的影响，也无法反映不同组织间ECM刚度的差异。为模拟 体内 组织顺应性条件 体外我们及其他研究者使用细胞外基质包被的水凝胶。在我们的实验室中，这些水凝胶基于聚丙烯酰胺，可模拟生物学中所见组织顺应性的范围12“反应性”盖玻片通过先用 NaOH 孵育，再加入 3-APTMS 制备而成。使用戊二醛交联 3-APTMS 与聚丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺（AC）、双丙烯酰胺（Bis-AC）和过硫酸铵溶液用于水凝胶的聚合。将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入 AC 溶液中，以实现细胞外基质蛋白与水凝胶的交联。水凝胶聚合完成后，其表面包被选定的细胞外基质蛋白，如纤连蛋白、玻璃体粘连蛋白、胶原蛋白等。
水凝胶的刚度可通过流变学或原子力显微镜（AFM）测定，并通过调整溶液中丙烯酰胺（AC）和/或双丙烯酰胺（bis-AC）的百分比进行调节12。通过这种方法，可使基质的刚度与生物组织的刚度相匹配，而生物组织的刚度也可使用流变学或AFM进行量化。随后可将细胞接种于这些水凝胶上，并根据实验所需条件进行培养。细胞的成像及其用于分子分析的回收过程简便易行。在本文中，我们将弹性模量（E）<3000帕斯卡（Pascal）的基质定义为软基质，将E >20,000帕斯卡的基质/组织定义为硬基质/组织。
方案
制备
- 盖玻片应进行高压灭菌。
- 配制溶液及清洗盖玻片时应使用无菌蒸馏水或去离子水。
- AC（40% w/v）和 bis-AC（1% w/v）溶液通过 0.2 μm 过滤除菌。10% 过硫酸铵（APS；100μg/ml 水）应在使用前临时配制并进行无菌过滤。APS 溶液需每月更换。
- 对于无法高压灭菌的化学试剂，如 3-APTMS、氯仿、戊二醛、NHS 和 SurfaSil，应保存在专用瓶中，仅用于水凝胶的制备。
- 为获得最佳效果，水凝胶应在与适当的细胞外基质（ECM）蛋白过夜孵育后数日内使用。
- 在倾注水凝胶前，先在 50 ml 聚丙烯 Falcon 管中配制 10% SurfaSil 的氯仿溶液（通常 10 ml 可满足 20 片上层盖玻片的需要）。（本实验室通常在 0.5% 戊二醛孵育步骤期间对上层盖玻片进行硅烷化处理。）将盖玻片加入 Falcon 管中，摇动至少 10 分钟。倒出 SurfaSil 溶液，并将盖玻片置于生物安全柜内的 Kimwipe 纸上晾干，该生物安全柜将用于后续水凝胶的制备。
- 热灭活 BSA 溶液的配制方法如下：将不含脂肪酸的 BSA 以 20 mg/ml 的浓度溶于 PBS 中，于 68°C 水浴中孵育 30 分钟，随后进行无菌过滤，并在 4°C 下保存。
实验步骤
- 在150 mm培养皿的下半部分放置一层Parafilm。
- 在Parafilm上最多放置9个25 mm盖玻片，并加入1 ml 0.1 M NaOH覆盖。孵育3分钟，然后用真空管线吸除液体。
- 在化学通风橱中操作，用弯头镊子将0.5 ml 3-APTMS加至每张盖玻片表面。孵育3分钟后吸除APTMS。若等待时间过长，将形成泡沫。
- 在同一培养皿中，用20 ml去离子水冲洗盖玻片一次。用弯头镊子将盖玻片从培养皿中取出，转移至新的150 mm培养皿中，确保处理面朝上。在摇床上用去离子水洗涤盖玻片三次，每次10分钟。若未彻底去除APTMS，其将在下一步与戊二醛反应，产生白色浑浊沉淀（见图1）。
- 在使用前约10分钟解冻戊二醛。
- 用弯头镊子将盖玻片转移至铺有Parafilm的洁净培养皿中，吸除残留液体。根据需要使用真空管线或Kimwipe吸除残留水分。
- 用0.5 ml含0.5%戊二醛的无菌去离子水完全覆盖每张盖玻片，在化学通风橱中孵育30分钟。吸除戊二醛后，按步骤4的方法冲洗并洗涤盖玻片。彻底干燥盖玻片。[可在此处暂停，将盖玻片置于干燥环境中保存数周]。
- 准备水凝胶时，用弯头镊子将盖玻片（反应面朝上）转移至贴附于生物安全柜表面的Parafilm片上。确保盖玻片在Parafilm表面保持平整。
- 在甲苯中配制饱和NHS溶液。（将少量NHS溶于足量甲苯中，用于特定实验。逐量加入NHS直至不再溶解。饱和溶液通常呈浑浊粉红色。）
- 接着，配制丙烯酰胺、双丙烯酰胺、水和APS，以达到所需丙烯酰胺浓度。按以下说明将试剂加入微量离心管中，总体积为0.8 ml。
- 然后依次加入NHS和TEMED至0.8 ml丙烯酰胺溶液中，短暂涡旋混匀，立即在生物安全柜中将3–5个凝胶各加入140 μl溶液至每张盖玻片上。此后所有操作应尽可能在生物安全柜中进行。[注：可根据需要使用不同尺寸的盖玻片。若使用18 mm盖玻片，则每张盖玻片加入约33 μl丙烯酰胺溶液，并使用18 mm硅化上层盖玻片。]
双丙烯酰胺 (%) 0.3（硬） 0.15 0.06 0.03（软） μl μl μl μl 水 402 522 594 618 丙烯酰胺 150 150 150 150 双丙烯酰胺 240 120 48 24 APS 8 8 8 8 TEMED 1 1 1 1 NHS 228 228 228 228 - 在凝胶开始聚合前，迅速将硅化25 mm盖玻片置于每张凝胶上方。上层盖玻片的加入应使丙烯酰胺溶液完全覆盖底层盖玻片。将此“三明治”结构在室温下孵育至丙烯酰胺完全聚合。（可通过观察微量离心管中残留丙烯酰胺溶液的状态判断聚合是否完成。通常硬凝胶需数分钟，软凝胶稍长即可。）
- 小心拿起“三明治”结构（佩戴无菌手套！），将上层盖玻片滑动，使其边缘略微悬出聚合凝胶，然后将其从凝胶上撬起。若未及时移除上层盖玻片，移除时凝胶可能撕裂。
- 弃去上层盖玻片。将底层凝胶-盖玻片（以下简称水凝胶）放入6孔板中，每孔加入2 ml PBS。可在放入水凝胶前或后向各孔加PBS。在摇床上用PBS洗涤水凝胶三次，每次5分钟。
- 重复步骤11–14，直至制备出所需数量的水凝胶。
- 每个水凝胶上覆盖2 ml纤连蛋白溶液（3 μg/ml PBS）或其他细胞外基质蛋白（详见Klein等13）。在4°C下过夜孵育期间，细胞外基质蛋白将共价结合至水凝胶表面。
- 吸除细胞外基质溶液，用含1 mg/ml热灭活、无脂肪酸BSA的无血清培养基在37°C细胞培养箱中封闭未反应的NHS至少30分钟。用无菌PBS或细胞培养基冲洗水凝胶一次。
- 在含FBS的适当培养基中接种细胞。接种至水凝胶上的细胞数量应由使用者根据实验所需的细胞铺展程度和汇合度确定。通常约105个细胞足以用于Western blot和qPCR分析。
- 孵育结束后，可提取细胞蛋白或mRNA。用弯头镊子小心将盖玻片从孔中取出，倒置（细胞面朝下）置于实验台Parafilm片上间隔排列（2–3 cm）的100 μl裂解缓冲液液滴上。（我们分别使用标准SDS样品缓冲液和TRIzol制备用于Western blot和qPCR的RNA样品。）细胞与裂解缓冲液精确孵育1分钟。取出盖玻片，将裂解液转移至微量离心管中。若仅用于RNA提取，使用者也可将每个水凝胶转移至新的6孔板，每孔加入1 ml TRIzol。孵育3分钟后，将TRIzol溶液转移至微量离心管中保存。
有关在水凝胶上接种细胞的免疫荧光、BrdU染色、转染等操作的更多详细信息，请参见Klein等（2007）13。
代表性结果
在加入 APTMS 后彻底清洗盖玻片是制备“活性”盖玻片的重要步骤。如果未能完全去除 APTMS，它将与后续步骤中的戊二醛发生反应，并产生如图 1A 所示的白色浑浊沉淀。图 1B 显示了正确清洗并干燥后的盖玻片。若出现沉淀，则必须从头重新开始整个操作流程，因为该盖玻片已无法继续使用。
水凝胶形成并包被细胞外基质蛋白过夜后，可在次日接种细胞。如图2所示，细胞在硬质与软质水凝胶上的铺展存在明显差异。通过小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的鬼笔环肽染色可见，细胞在硬质水凝胶上的铺展程度明显大于软质水凝胶。事实上，大多数附着于软质水凝胶的细胞将保持较为紧凑的形态，且附着效率较低。
尽管图2仅展示了MEF细胞的形态，但在其他多个测试的细胞系中，细胞铺展的差异也具有一致性11-12,14。
成功的秘诀
- 开始操作后，必须始终将盖玻片的“反应面”朝上放置，并牢记已包被的是哪一侧。
- 整个操作过程中应始终佩戴手套，以尽可能保持无菌的工作环境。
- 初始步骤大多在化学通风橱与实验台之间进行。自去除盖玻片上多余戊二醛起，后续所有操作均应在生物安全柜内执行。
- 由于细胞在不同硬度水凝胶上的铺展程度存在差异（图2），我们建议在软性水凝胶上接种的细胞数量应为硬性水凝胶上的两倍。
- 丙烯酰胺（AC）聚合过程极为迅速。初次使用者可减少溶液中过硫酸铵（APS）或四甲基乙二胺（TEMED）的用量，以延长聚合时间。切勿一次性制备过多盖玻片。
- 在需要将细胞周期同步于G0期的研究中，我们通常先在塑料培养皿中对细胞进行血清饥饿处理，随后用胰蛋白酶消化细胞，并在含有有丝分裂原（胎牛血清FBS和/或生长因子）的条件下将细胞重新接种至不同刚度的水凝胶上。该方法可确保所有样品中起始的G0期同步化细胞群体一致。然而，在许多信号转导研究中，所需的有丝分裂原刺激时间可能不足以支持细胞贴附与铺展。在此情况下，我们直接在水凝胶上对细胞进行血清饥饿处理，随后直接施加有丝分裂原刺激。
图1A. 清洗不当的盖玻片。 在加入APTES后，盖玻片仅被清洗了1-2分钟，随后即加入戊二醛溶液。由于未按照操作步骤进行充分清洗，盖玻片上形成了沉淀物。
图 1B. 正确清洗的盖玻片。 加入 APTMS 后，盖玻片用去离子水清洗三次，每次 10 分钟，然后才加入戊二醛溶液。盖玻片上无沉淀物形成。
图 2. 细胞在不同刚度水凝胶上的形态学特征。 将已建立的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种于纤连蛋白包被的高或低刚度水凝胶上培养9小时。培养结束后，细胞经固定、透化处理，并用与F-肌动蛋白结合的异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽（FITC-phalloidin）染色。在高刚度凝胶上的MEFs表现出明显的应力纤维，且细胞铺展良好，而接种于低刚度水凝胶上的细胞则无此特征。比例尺 = 50 μm。
图3. 小鼠cyclin D1 mRNA水平的代表性定量PCR结果。 将血清饥饿的小鼠胚胎成纤维细胞接种于高刚度（3%丙烯酰胺）或低刚度（0.3%丙烯酰胺）水凝胶上，并用10%胎牛血清（FBS）刺激9小时。提取RNA后，对cyclin D1 mRNA水平进行实时定量PCR分析（以18S RNA为内参进行标准化）。G0代表静止期细胞中的cyclin D1 mRNA水平。在硬质水凝胶上，cyclin D1 mRNA水平显著升高，而在软质水凝胶上则无明显变化。数据为两次PCR反应的均值±标准差。
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讨论
水凝胶聚合过程中的一个关键环节是避免气泡的形成，因为气泡会导致细胞附着在玻璃盖玻片上，而非附着在包被了细胞外基质的水凝胶本身。为防止此问题，可在涡旋振荡后小心地移取聚合溶液，并通过肉眼观察确保没有气泡被困在凝胶中。我们始终建议额外制备一些“活性”盖玻片和水凝胶，以确保实验材料充足。
每次用 PBS 清洗凝胶时都应特别注意。抽吸过程必须避免与水凝胶本身直接接触，以免水凝胶被钩住或撕裂。最安全的抽吸液体而不扰动水凝胶的方法是在抽吸时倾斜培养板。
获得完全水平的水凝胶较为困难，水凝胶厚度的微小差异可能导致表面不平整，从而难以在整个视野范围内清晰对焦成像。可以针对相对较小的区域进行对焦，我们发现这种方法对于大多数相差显微镜和落射荧光显微镜应用已足够，如图2所示。随着放大倍数的增加，该问题会变得更加严重，因此对于蛋白质共定位等高分辨率分析，最好采用共聚焦显微镜获取的光学切片进行分析。共聚焦显微镜操作按照标准流程进行，但为了适应倒置共聚焦显微镜物镜的工作距离，可能需要将水凝胶倒置贴附在盖玻片上，而非载玻片上。
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致谢
本实验室的工作得到了美国国立卫生研究院资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊二醛，70% | Sigma-Aldrich | G7776 | 储存于 -20°C |
| 3-APTMS（3-氨基丙基三甲氧基硅烷，97%） | Sigma-Aldrich | 281778 | 室温储存 |
| SurfaSil 硅化液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | 室温储存 |
| NHS（N-羟基琥珀酰亚胺酯） | Sigma-Aldrich | A-8060 | 储存于 4°C，每月更换 |
| 牛血清白蛋白，基本不含脂肪酸 | Sigma-Aldrich | A6003-100G | 储存于 4°C |
| 盖玻片（25 mm） | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| 盖玻片（18 mm） | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
参考文献
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