基底硬度对细胞功能的影响可被模拟 体外 使用不同顺应性的聚丙烯酰胺水凝胶。
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摘要
摘要
组织硬度是细胞功能的重要决定因素，组织硬度的改变通常与纤维化、癌症和心血管疾病相关。1-11传统的细胞生物学研究细胞功能的方法通常是在刚性基质（如塑料培养皿或玻璃盖玻片）上培养细胞，这类基质无法模拟弹性细胞外基质（ECM）的影响，也无法反映不同组织间ECM刚度的差异。为模拟 体内 组织顺应性条件 体外我们及其他研究者使用细胞外基质包被的水凝胶。在我们的实验室中，这些水凝胶基于聚丙烯酰胺，可模拟生物学中所见组织顺应性的范围12“反应性”盖玻片通过先用 NaOH 孵育，再加入 3-APTMS 制备而成。使用戊二醛交联 3-APTMS 与聚丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺（AC）、双丙烯酰胺（Bis-AC）和过硫酸铵溶液用于水凝胶的聚合。将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入 AC 溶液中，以实现细胞外基质蛋白与水凝胶的交联。水凝胶聚合完成后，其表面包被选定的细胞外基质蛋白，如纤连蛋白、玻璃体粘连蛋白、胶原蛋白等。
水凝胶的刚度可通过流变学或原子力显微镜（AFM）测定，并通过调整溶液中丙烯酰胺（AC）和/或双丙烯酰胺（bis-AC）的百分比进行调节12。通过这种方法，可使基质的刚度与生物组织的刚度相匹配，而生物组织的刚度也可使用流变学或AFM进行量化。随后可将细胞接种于这些水凝胶上，并根据实验所需条件进行培养。细胞的成像及其用于分子分析的回收过程简便易行。在本文中，我们将弹性模量（E）<3000帕斯卡（Pascal）的基质定义为软基质，将E >20,000帕斯卡的基质/组织定义为硬基质/组织。
方案
制备
- 盖玻片应进行高压灭菌。
- 配制溶液及清洗盖玻片时应使用无菌蒸馏水或去离子水。
- AC（40% w/v）和 bis-AC（1% w/v）溶液通过 0.2 μm 过滤除菌。10% 过硫酸铵（APS；100μg/ml 水）应在使用前临时配制并进行无菌过滤。APS 溶液需每月更换。
- 对于无法高压灭菌的化学试剂，如 3-APTMS、氯仿、戊二醛、NHS 和 SurfaSil，应保存在专用瓶中，仅用于水凝胶的制备。
- 为获得最佳效果，水凝胶应在与适当的细胞外基质（ECM）蛋白过夜孵育后数日内使用。
- 在倾注水凝胶前，先在 50 ml 聚丙烯 Falcon 管中配制 10% SurfaSil 的氯仿溶液（通常 10 ml 可满足 20 片上层盖玻片的需要）。（本实验室通常在 0.5% 戊二醛孵育步骤期间对上层盖玻片进行硅烷化处理。）将盖玻片加入 Falcon 管中，摇动至少 10 分钟。倒出 SurfaSil 溶液，并将盖玻片置于生物安全柜内的 Kimwipe 纸上晾干，该生物安全柜将用于后续水凝胶的制备。
- 热灭活 BSA 溶液的配制方法如下：将不含脂肪酸的 BSA 以 20 mg/ml 的浓度溶于 PBS 中，于 68°C 水浴中孵育 30 分钟，随后进行无菌过滤，并在 4°C 下保存。
实验步骤
- 在150 mm培养皿的下....
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讨论
水凝胶聚合过程中的一个关键环节是避免气泡的形成，因为气泡会导致细胞附着在玻璃盖玻片上，而非附着在包被了细胞外基质的水凝胶本身。为防止此问题，可在涡旋振荡后小心地移取聚合溶液，并通过肉眼观察确保没有气泡被困在凝胶中。我们始终建议额外制备一些“活性”盖玻片和水凝胶，以确保实验材料充足。
每次用 PBS 清洗凝胶时都应特别注意。抽吸过程必须避免与水凝胶本身直接接触，以免水凝胶被钩住或撕裂。最安全的抽吸液体而不扰动水凝胶的方法是在抽吸时倾斜培养板。
获得完全水平的水凝胶较为困难，水凝胶厚度的微小差异可能导致表面不平整，从而难以在整个视野范围内清晰对焦成像。可以针对相对较小的区域进行对焦，我们发现这种方法对于大多数相差显微镜和落射荧光显微镜应用已足够，如图2所示。随着放大倍数的增加，该问题会变得更加严重，因此对于蛋白质共定位等高分辨率分析，最好采用共聚焦显微镜获取的光学切片进行分析。共聚焦显微镜操作按照标准流程进行，但为了适应倒置共聚焦显微镜物镜的工作距离，可能需要将水凝胶倒置贴附在盖玻片上，而非载玻片上。
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致谢
本实验室的工作得到了美国国立卫生研究院资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊二醛，70% | Sigma-Aldrich | G7776 | 储存于 -20°C |
| 3-APTMS（3-氨基丙基三甲氧基硅烷，97%） | Sigma-Aldrich | 281778 | 室温储存 |
| SurfaSil 硅化液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | 室温储存 |
| NHS（N-羟基琥珀酰亚胺酯） | Sigma-Aldrich | A-8060 | 储存于 4°C，每月更换 |
| 牛血清白蛋白，基本不含脂肪酸 | Sigma-Aldrich | A6003-100G | 储存于 4°C |
| 盖玻片（25 mm） | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| 盖玻片（18 mm） | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
参考文献
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
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