小鼠胰岛的分离和包膜下肾移植的方法

摘要

分离出胰岛​​移植已被提出，是一个潜在的治疗1型糖尿病。在这里，我们描述的方法，从小鼠胰腺孤立的小岛和移植肾包膜下空间。

摘要

初以来的巴林杰和Reckard开创性的工作证明，胰岛细胞移植到糖尿病老鼠可以正常化，他们的血糖水平，胰岛移植已提议是一个潜在的治疗1型糖尿病^1,2。最近，在人类胰岛移植的进步进一步加强了这种^看法 1,3 。但是，两个主要的限制，防止胰岛移植被广泛的临床现实:（一）要求每名病人的胰岛细胞，这严重降低了潜在的接受者的数量大量，及（b）需要沉重的免疫抑制，从而显着影响小儿患者由于其脆弱性，长期免疫抑制人口。策略，可以克服这些限制有可能提高胰岛移植治疗效用。

小鼠肾囊下的胰岛移植是一种被广泛接受的模型，以探讨各种战略，以改善胰岛移植。这个实验需要高品质的小岛和隔离的胰岛细胞植入糖尿病收件人。这两个程序需要可以得到更好的视频演示手术步骤，不是由文字。在这里，我们通过视频和书面协议文件为这些程序的详细步骤。我们还简要地讨论一下不同的移植模型:，同源，同种，同源性自身免疫性，和异体自身免疫性。

方案

1。 Liberase试剂的制备和校准

1. 该协议利用Liberase TL（罗氏，猫＃05 401 020 001）胰腺消化酶。
2. 一次购买100 - 200毫克，使一大批。冻干粉针剂无菌HPLC级水的浓度是每毫升约26 Wunsch算法单位重新挂起。这应该是约5毫克/毫升。在特定地段中的文施单位的详细信息，请参阅包插入。瓶置于冰上30分钟詹蒂莱纷飞每隔几分钟。检查，以确保粉末完全溶解在30分钟结束。
3. 池全部溶解Liberase一起混合温柔纷飞（不要旋涡或震动）。分装24.3 Wunsch算法单位预冷Eppendorph管，液氮速冻（把它作为任何酶）和储存在-80 ° C这应该是大约每Eppendorph管0.935毫升。每个等份是单使用（11只小鼠足够），不宜存放或重新冻结一旦解冻。在一般情况下，股票是稳定的，至少6个月。
4. 对于每一个新批次，校准的孵育时间。使用冻结的股票，而不是刚解散的股票，校准，尽可能地模仿真实的实验条件。
   1. 校准水浴，你打算使用的正是37℃使用水银温度计。在今后的实验中使用相同的孵化器。
   2. 在使用之前，解冻冰Liberase管（0.935毫升）添加到21.6毫升无血清的RPMI，使得最终工作浓度为单位，每毫升1.08 Wunsch算法。血清，BAS和EDTA抑制Liberase。锌，钙的辅助因子。存放在冰和1.5小时内使用。这是足够的约11小鼠（2ml/mouse）。
   3. 请参阅步骤胰腺灌注2.3。灌注小鼠在1小时尽可能多。然后，使用一个或两个小鼠每个孵化时间和测试10，12，14，16，18分钟的孵育时间。如果可能的话，包括30秒的间隔时间之间的消化的时间是非常重要的。
   4. 完成胰岛隔离协议，并分析每个孵化时间点胰岛的产量和品质。最终的收益率不应该有太大变化之间的高峰时间，但在这些间隔的质量胰岛可能会有所不同。随后的实验中，使用的条件，在隔离后的48小时健康的胰岛细胞数量最多的结果。小鼠的年龄似乎影响孵育时间。因此，使用类似的年龄范围内的小鼠。理想的情况下，使用8-12周龄小鼠;然而，即使8-10月龄小鼠可以产生良好的胰岛细胞。校准的目的，使用年轻小鼠。

2。外科手术

1. 前准备euthanizing胰岛供体小鼠的所有设备和媒体。
   1. 高压灭菌或火焰消毒仪器在使用前。所有的试剂和仪器（触摸样本）应无菌。胰岛的分离和手工采摘可以执行层流罩之外而大大增加了污染的发生。然而，胰脏或胰岛细胞接触到的工具的消毒，避免污染的关键。需要以下工具:
      • 1对腹部手术切口的解剖剪刀。
      • 2双钳。
      • 1止血钳钳胆管。
      • 直径为0.419毫米的铁丝网。
      • 直径0.1毫米的尼龙网。
   2. 弯曲几个27针70度角，使引入针针的长度约为中途下来。针头斜边应该面对肘关节内侧。
   3. 填写喷雾瓶用70％乙醇。
   4. 在解剖显微镜实验室的长椅上，或在引擎盖足够的光源。
   5. 前寒意离心机4 ° C离心机必须有一个摆动桶转子，有能力的900xG，冷藏，并有一个可以被切断的突破。在Sorvall H1000B转子RT6000D一个Sorvall，900xG速度2400RPM。在800RPM较慢的旋转。
   6. 下列试剂置于冰上。
      • RPMI（1公升含10％血清）
      • RPMI（无血清200毫升）
      • 50毫升（1）为每个胰腺锥形管
      • 5ml注射器。
   7. 平衡Histopaque1077房间坦佩rature。
   8. 解冻的单一使用校准冰Liberase等分和淡化22.5毫升血清自由的RPMI。血清，BAS和EDTA抑制Liberase。锌，钙的辅助因子。存放在冰和1.5小时内使用。这是足够的约11小鼠（2ml/mouse）。
   9. 温暖的37℃水浴。
   10. 许多小鼠的手，你可以cannulate在1小时内（约10 - 18小鼠）。
2. 准备插管的鼠标。第一颈椎脱位或CO ₂窒息鼠标安乐死。尽管鼠标是过期的，填写2毫升Liberase工作股票（1.08 Wunsch算法单位/ ml）5ml注射器。
   1. 将鼠标放置在解剖范围的纸巾和喷用70％乙醇与V型切口从丹田腹部开放前两个前腿腹部仰卧位。褶皱的皮肤对胸部露出腹腔。
   2. 朝你指向的位置与鼠标。找到图1突出胆管胆总管十二指肠条目。这是可以做到不看通过解剖范围的目标。
   3. 与止血钳十二指肠开放，如在图2展示了。夹钳位置，是进入肠道阻塞的Liberase流的关键。如果钳过高或过低，Liberase不会灌注胰腺。止血的位置，使压缩后，运行完全沿胰腺/肠道边境。
3. cannulating胆总管之前，它可能需要重新定位按下对隔膜，使整个长度是暴露​​胆总管（图3）肝脏。一旦暴露胆管的长度，使用Liberase充满插管注射器弯曲27 gague针。有两种技术cannulating胆管。
   1. 在第一种技术，或"自由之手"的方法，止血夹住十二指肠被拉到头对尾鼠标，使胆总管变得绷紧。有一个在胆管接近肝脏，胆汁从胆囊和肝脏酶来一起进入肠子之前排水合流。此汇合形成的V内部暴露拉动胆管紧，是一个理想的地方发起的导管插管（图）。如果定位正确，针会下滑，通过V，并直接cannulate管道下部。插入导管前配发的Liberase针数毫米。最佳针的位置是很重要的，以防止回流到肝脏和胆囊。此外，重要的是，针，到目前为止，它阻碍了脾管不会被插入。脾管是很难看到胆总管部门和脾尾水渠的胰腺，胰岛的富人区。如果针幻灯片过去的脾管开放，将会有小于灌注脾尾完成，并可能降低这方面的消化。最佳胰岛产量出现时，进针深度是远远不够，没有Liberase逃脱肝/胆，但至今没有通过脾管，你的。您可以测试成功插管配药少量的Liberase。如果您看到Liberase灌装管道，则免除其他2mls。如果管道周围的区域开始，以填补，停止配药，重新定位针，然后再试一次。
   2. 在第二个技术，或"产钳协助"的方法，止血钳，夹住十二指肠被拉到头对尾鼠标，使胆总管变得绷紧。然后，使用的27 gague针连接5ml注射器，穿刺胆总管肝脏筋膜下方弯曲。使用的针管（图5），以清除筋膜。地方仍然在用针，设置止血，并拿起一双镊子。使用一个开放镊子的手臂抬起胆管针清除筋膜。在镊子的山脊创建一个道，你可以用它来引导到针管。拉向你的风管和镊子，针滑入管逆止器使用镊子。插管测试配药少量的Liberase。如果管道开始填充（图5箭），免除其他2mls。如果管道周围的区域开始，以填补，配药停止，重新定位针，然后再试一次。
4. 由于Liberase 2mls填补胰腺，该地区附近的十二指肠开始扩大，胃上方的区域，最后脾尾（图6）。寻找甚至扩大胰腺（图6）。如果一个区域开始扩大，你看不到白色的组织均匀的扩大和蔓延，它是可能的，胆总管尚未空心，但针内的胰腺囊。与Liberase灌装胶囊不会导致胰岛产量高，作为接触酶的表面积将会很低。如果发生这种情况，停止灌注，并重新定位针。
5. 一旦胰腺已经灌注，它可以从鼠标，拉肠，胃，脾的接触点。开始从十二指肠中取出的止血钳。然后，使用镊子解除十二指肠和胰腺从肠道分离与产钳的第二对（图7a - B）的。这样做是通过举办第二产钳对稳定，拉动腹部的肠子。接下来，拉胰腺，胃的顶部和脾脏（FIG.7C四）免费。最后，解除胰腺腹部和削减它从剩余的筋膜连接（FIG.7E - F）的自由。
6. 放置在一个50ml的锥形管的胰腺和留在冰上，而对其他老鼠工作。启动1个小时的计时器。最大的胰岛产量，将在每个管只有1胰腺。这是不建议离开灌注胰腺上的冰，1个多小时的Liberase将开始降低组织。小时结束，迅速移动到步骤3.0所有被灌注的胰腺。
7. 重复步骤2.3 - 2.6，其余小鼠或直到1小时定时器，在步骤2.6开始已经过期。

3。从灌注胰腺净化胰岛

1. 胰岛之前可以从胰腺中分离纯化，消化组织必须在37 ° C。集团50毫升管，轴承在一个开放的底部机架，适合在37℃水浴灌流胰岛。确保全部大写，以及安全和当前批次的Liberase淹没在37℃水浴精确的时间管预先确定的（见第1.4步）。孵化结束，移动管冰，并添加与10％血清，每管20mls的RPMI1640。含药血清媒体将停止Liberase消化。
2. 晃动试管大力的40倍，在10秒后分离的组织。这一步是最佳恢复胰岛的关键。即使最佳Liberase灌注和高度校准的消化时间，胰岛产量将会很低，如果该组织是不破。在此步骤中样品的咄咄逼人的处理不会出现损害小鼠胰岛细胞，并释放他们从外分泌细胞团是必要的。
3. 要消化胰腺分离的胰岛细胞，完成下列步骤。
   1. 池消化胰腺，以便有大约2.5％，胰腺管。这样，10管媒体每个50mls浓缩到4管。
   2. 离心管2分钟800RPM和4 ° C。
   3. 倒掉上清，重新悬浮在含10％胎牛血清的15 25mls媒体的震荡轻轻几秒钟（调整涡强度最大的约50％）的颗粒。
   4. 通过0.419毫米丝网悬浮浆倒入到一个新的50ml的锥形管和漏斗。分离出来的非消化的组织，脂肪和淋巴结。冲洗媒体含有10％FBS和倒通过丝网的额外10mls的初始管。其余管，重复这个过程。
   5. 离心管2分钟800RPM和4 ° C。
   6. 倒掉上清，仔细倒置在纸巾上的管子。观看，以确保胰岛不滑出。以去除残留的媒体用纸巾擦去管内，小心，不要扰乱细胞沉淀。管返回到直立位置。
   7. 震荡几秒钟，轻轻重悬室温histopaque1077 5mls颗粒。确保暂停均质前加入管内各地histopaque额外5mls。这洗关闭管壁的小岛。
   8. 覆盖histopaque无血清的RPMI 10mls，注意保持histopaque和媒体之间的尖锐接口。新增吹打每10秒1毫升的速度缓慢下来的管方媒体。媒体应在顶部，并在底部histopaque。血清影响介质密度，不应该在这一步。
   9. 旋转平衡离心机样本20 °彗星在2400RPM（900xG）20分钟非常缓慢加速，没有刹车。这一步从外分泌细胞中分离出来的胰岛。胰岛细胞会迁移到无血清媒体和Histopaque之间的接口，外分泌细胞的Wi会在试管底部形成一个颗粒。
   10. 收集从一次性10毫升血清移液器histopaque /媒体接口的小岛。胰岛细胞会粘到玻璃上，因此不应该使用，除非他们已经硅化玻璃吸液管。放入一个新的50ml的锥形管中的小岛。在这一点上，可以集中几个管。填充管至50ml，用含药血清的RPMI。
   11. 离心管2分钟800RPM和4 ° C。
   12. 倒掉上清，重悬在含药血清的RPMI 50mls胰岛轻轻振荡。
   13. 90秒离心管在800RPM和4 ° C。
   14. 倒掉上清，重复洗1更多的时间。
   15. 倒掉上清液，并采取组织培养罩管。添加笔/链球菌的RPMI含10％胎牛血清的终浓度为1％，使胰岛文化传媒。重悬在这种文化媒体5mls中的胰岛。
   16. 反转0.1毫米尼龙细胞过滤器和放在15毫升锥形管。慢慢地通过过滤器通过的悬浮胰岛浆。由过滤器将被保留的胰岛外分泌细胞传递到15毫升锥形管通过。这一步大大增加外分泌细胞污染的胰岛纯度在协议结束。
   17. 与媒体的额外6mls冲洗50ml的锥形管，吸液管通过过滤器。
   18. 广场文化传媒3mls在一个10厘米的培养皿的大幅下降。反转细胞过滤器的右侧，用来捕获的胰岛细胞的表面，使可分为蘸媒体下降。媒体接触的过滤器，将转移到非组织培养处理的培养皿中的胰岛。使用未经处理的培养皿中是至关重要的，以避免胰岛的粘附和扩散板面。自由浮动的胰岛更容易挑选到实验组的分离。
   19. 移液器到培养皿中增加文化传媒5 7mls任何残留胰岛入菜洗滤网，通过过滤器。
   20. 4X目标倒置显微镜下检查胰岛的产量和质量。在紧张的椭圆形旋流菜盘的中心将收集的小岛。如果胰岛好看，他们可以拿起立即实验用或分居4-610厘米培养皿板（每10只小鼠）之间均匀。在同一盘菜太多的培养胰岛，使胰岛坏死和降解。实验中，每6厘米菜2 3mls媒体250-300胰岛不会出现要强调的小岛。
   21. 在15毫升的锥形管，收集0.1mm的尼龙细胞滤网流经会有一些可用的胰岛。这些胰岛细胞可以恢复以下三到四个回合的重力沉降。约4分钟的沉淀后，吸出所有，但大约有媒体1毫升管和填充它与文化传媒的顶部。第管和颠倒混合。多次重复此过程将删除许多单细胞外分泌细胞沉淀速度很慢的，和丰富的内分泌细胞（胰岛）迅速下沉较重的聚合。最终的愿望后，悬浮在文化传媒板块在一个新的培养皿7mls。

4。使用隔离胰岛

1. 隔离的过程是相当对胰岛细胞的压力; histopaque是有毒的，震动和离心步骤诱发剪切应力，并去除宿主的血液供应以及在体外培养，可以诱导缺氧。我们和其他人表明，隔离诱导β细胞死亡^4-5。从这些压力的影响是从外围胰岛细胞的脱落，变黑和驱逐的胰岛核心（中央坏死）。虽然从外围细胞的脱落是可以容忍的，中央坏死的胰岛丧失在实验中使用它。通常情况下，较大的胰岛，中央坏死，就会出现问题的可能性就越大。努力减少胰岛后隔离应激反应会增加可用胰岛的产量。
2. 因此，我们使用了一个22-27 ° C的组织培养孵化器的^孵化胰岛隔离6-8后的第48-72小时以前报道的技术。这种降低温度，抑制了胰岛细胞的应激反应，在体外培养和平滑过渡到。如果一个22-27 ° C的组织培养孵化器不可用，它有可能实现在一个标准的组织培养孵化器所需的温度范围内，关闭热控制和配售约20磅冷冻砖平衡至-80 ° C。降低温度约1624小时在孵化器这个结果。更换-80 ° C冰箱所需要的砖。我们并没有观察到一个额外的孵化好处，在这个较低的温度比72hrs。
3. 除了低温孵化，我们建议改变媒体2​​4-48小时后隔离。强调和死的胰岛分泌的因素积聚在媒体以下隔离，并可以促进胰岛压力。要改变介质，完成下列步骤。
   1. 一个15毫升锥形管，用塑料吸管从培养皿转移媒体和小岛。
   2. 与文化传媒的其他3mls清洗板，收集残余的胰岛细胞。
   3. 加入此额外3mls15毫升锥形管，让胰岛为5分钟的重力沉积物。
   4. 吸干所有，但1毫升15毫升锥形管媒体，然后重新悬浮胰岛，胰岛文化传媒4mls。
   5. 小岛和媒体传送到一个​​新的培养皿板。添加额外3mls文化传媒15毫升锥形管收集任何残留胰岛，并添加到培养皿板。
   6. 此后每隔三至五天变化胰岛媒体。
4. 当选择一个实验的小岛，它不建议混合不同的隔离的小岛。胰岛细胞的分子基线是受很多东西，包括所需的时间，他们在文化和隔离应力变化从预习预习。为了减少可变性，胰岛的实验必须在同一时间中分离出的胰岛。但是，如果这是不可能的，我们强烈建议汇集成一个组的所有胰岛前采摘他们的实验。挑胰岛实验，完成下列步骤。
   1. 如果胰岛细胞培育成一个单一的菜按照以下步骤通过上面列出的4.3.5 4.3.1在一个以​​上的菜，池的所有小岛。如果涉及多个小岛菜，50ml的锥形管应15毫升管来代替。这样可以减少在板块之间的文化条件的细微差别，在隔离后的恢复时期诱导变异。
   2. 在重力沉淀胰岛，成立一个倒置显微镜，配有4倍或10倍的目标。收集P200微管和无菌P200提示框。
   3. 沉淀胰岛细胞转移到一个单盘和移动板显微镜。旋流板收集到中心小岛。取下盖子板和使用的P200移液器选择健康的胰岛细胞。健康的胰岛细胞已顺利寄宿生，没有黑暗的中心区域（图8）。尽量保持胰岛大小均匀分布在整个实验的菜肴，如胰岛的大小可以改变对治疗的反应。
   4. 每个实验组胰岛细胞的数量可以根据实验的需要而变化。我们估计，一个胰岛已约1000-2000细胞，将产生0.3 -1μg总RNA，蛋白质和25ng。 在体外实验中，一个典型的实验组可在35mm或6厘米菜镀介于100和250个小岛，13毫升媒体。每个收件人鼠标移植，将需要150和400之间的几个小岛上根据不同的实验设计（见5.2.2步骤和更多细节的讨论）。
   5. 为了最大限度地减少由手工采摘过程中引入的变化，我们使用的P200 -枪头为指导，以估计胰岛大小的孔。大多数小岛有一个直径约孔口直径的一半，并且我们指望他们每个人作为一个标准的胰岛。任何胰岛大或小于，我们分配相应不同的胰岛计数。我们收集在20-50批次的小岛，并将它们传送到指定的实验菜。如果P200移液器是在180微升的量，可以收集到一个提示多个胰岛细胞（通常超过50胰岛）。因此，即使胰岛采摘一次，一个可以收集在每个P200尖控制pipetman释放机制的许多小岛。这有利于采摘数百甚至超过千为实验所需的胰岛。我们也可以使用这个批次明智的操作，甚至出的胰岛细胞具有类似的质量和大小的分布，以帮助。

5。包膜下肾胰岛移植

1. 诱导移植受体小鼠的糖尿病。
   1. 在4至6小时快速地老鼠。最佳移植受者应在6至10周之间的权衡时间快20至25克。要快的小鼠，取出从feedi食品吴机架，始终放置在一个新的笼子里的老鼠。这可以确保一个真正的快速分​​离小鼠以前可能下跌到他们的笼子的剩余食物的任何位。计划为80％至90％的小鼠成为糖尿病。
   2. 三个小时进入快速，准备柠檬酸钠缓冲液。称量0.735克酶级柠檬酸钠（柠檬酸钠，议员294.10克/摩尔）和溶解在无菌去离子水25mls。用盐酸调节pH值至4.5。这个缓冲区应每一轮实验新鲜。
   3. 广场0.05克链脲佐菌素（STZ米_ř 265.2克/摩尔）成1.5毫升Eppendorph管。这一数额是在大约8只小鼠，足以诱发糖尿病。准备足够数量的1.5毫升管被注入小鼠的数量。菌素是对光敏感，所以用铝箔覆盖每个管。
   4. 经过4个小时的快速，悬浮钠柠檬酸缓冲液新鲜的1毫升菌素管。一旦重悬，STZ - Na的柠檬酸钠溶液在15至20分钟内失去活性，所以这一步只应立即注射的老鼠之前。
   5. 每只小鼠腹腔注射STZ - Na的柠檬酸钠溶液适当体积达到的最终剂量190mg/kg鼠标。这个剂量可能会有所不同的应变和鼠标的年龄，因此它可能有必要进行剂量优化，如果糖尿病的发病率过低，或如果有太多的小鼠在注射后的3至5天死亡。普通剂量150mg/kg鼠标250毫克鼠标使用范围。
   6. 供应的食物和水，一旦所有的老鼠被注射。
   7. 非空腹血糖测试小鼠在注射后2〜4天（> 350mg/kg）。非空腹血糖连续3天的小鼠，证明可用于移植受者。
2. 准备用于移植的胰岛
   1. 隔离中所述的步骤2.0以上通过4.0胰岛。如果有必要，胰岛细胞可以分离出移植或前一天。
   2. 挑入胰岛移植组放入无菌1.5毫升Eppendorph管。置于冰上管。需要恢复正常血糖的胰岛细胞的数量可能会有所不同实验条件（胰岛供体菌，重量和收件人的应变，收件人的任何额外的治疗）的人是采摘胰岛。收件人鼠标的大小是一个主要的变量，影响最小的胰岛数量，较大的老鼠会需要更多的胰岛。我们一贯认为，150至250胰岛只能勉强恢复正常血糖，而300胰岛或以上是在18疗效20克C57BL / 6收件人鼠标。在这些实验中，胰岛供体鼠C57BL / 6或BALB / C。
3. 胰岛移植到包膜下肾袋
   1. 组装下列材料（所有手术器械必须消毒）:
      
      表1。用于移植的设备
      

      25μl汉密尔顿注射器	6 PE软管50"切，一边是斜角
      凝胶装载和P200枪头	无菌Eppendorph管（1每个收件人）
      异氟醚和异氟醚蒸发器	Eppendorph管架
      麦弗逊式Vannas剪刀（1）	屈臂钳（2）
      止血（1）	伤口剪辑与剪辑
      27号针	火焰拉玻璃毛细管探头*
      棉花放倒喷头	50ml的锥形管的无菌PBS
      缝合线	电动剪刀
      70％的乙醇喷雾瓶	圆珠笔
      优碘	透明塑料无菌悬垂

      
      
      *注:准备这些探针时，试图建立一个弧形探头，模仿的小鼠肾脏的角度。此外，确保探头结束，有足够的火焰抛光，没有锋利的边缘存在。
   2. 称重和标签的所有糖尿病受体小鼠。分配每个鼠标，一个实验组移植前，使每个小组都有同样匹配体重。
   3. 配备异氟醚蒸发器的出气口打开前罩内成立一个外科领域。
   4. 麻醉与异氟醚，然​​后用电动剪剃其侧翼收件人鼠标。鼠标移植将执行区域以外的剃须。
   5. 返回麻醉和位置，它躺在直接在玻璃棒轴垂直，使剃光侧翼面临的鼠标。用70％乙醇的喷雾侧翼。鼠标是用优碘和酒精交替反复做三次手术擦洗推广。披风允许访问剃光侧翼有明确的无菌悬垂鼠标。
   6. 当鼠标被麻醉，准备用于移植的胰岛。请完成下列步骤。
      1. 放置到1.5毫升Eppendorph管开幕式无菌凝胶加载提示，以便有一个温柔的弯曲，这使得在尖窄的一端一个U形。开放针尖应朝向直接Eppendorph管。不要介绍凝胶中加载提示点在任何一个扭结，因为这将导致在剪切的胰岛细胞和胰岛移植的数量在减少。
      2. 从冰，轻轻地取出一个步骤5.2.2准备的胰岛管。胰岛应落户在试管底部。使用P200吸管，轻轻地收集从管底的最小量的胰岛细胞。转让这些胰岛细胞，通过大开放的步骤5.3.6.1准备凝胶装载提示。胰岛应融入狭窄的长度或凝胶加载提示狭窄的限制。
      3. 胰岛有沉淀后，取出凝胶加载提示尽​​可能许多媒体。这可以通过使用一个新鲜的凝胶加载提示连接到P200移液器吸媒体，通过大开放的胰岛轴承凝胶加载提示。
      4. 沉淀胰岛细胞转移到50的PE软管（〜15CM的长度）。这可以通过第一连接管非斜面结束胰岛轴承凝胶装载前的提示附加到P200移液器头窄开放。胰岛细胞，然后可以通过管的长度的60％推。
      5. 胰岛轴承PE 50管转移到25μl汉密尔顿注射器。确保注射器推杆已被转移管之前撤回。非斜边50的PE管连接注射器针头。
      6. 直到胰岛远离斜面开放约0.5厘米压下注射器的柱塞。
      7. 设置注射器搁置，而肾正在准备接受胰岛的胰岛细胞可成单质管附近的斜面开放定居。
   7. 用你的手指，本地化肾脏通过鼠标在麻醉状态下的皮肤。圆珠笔轴应直接放在位于肾脏，并垂直于脊髓面积。
   8. 一旦肾脏是局部的，使用麦弗逊式Vannas剪刀，使真皮垂直方向的脊髓直接在它上面的一个2厘米的切口。这个切口暴露腹腔壁。
   9. 随着麦弗逊式Vannas剪刀一个1cm的切口，通过在同一方向通过削减真皮层的腹腔壁。重要的是，此切口创建的开放小于暴露肾。
   10. 使用玻璃棒轴逆止器，强行通过肾脏腹膜开放日上按发送相邻表面。如果开放略高于肾小，肾脏会挤压通过开放和稳定上的鼠标表面的其余部分，无需任何额外的操作或接触。这个定位是最适用于随后的移植步骤。如果开放过大，肾脏将回落进入腹膜腔，使其难以完成后续的步骤。
   11. 湿放倒与冰冷的无菌PBS暴露肾使用浸泡过的棉花表面撒施。重复此步骤，每隔几分钟，或根据需要干燥，以防止肾囊。
   12. 使用27号针头，使整个前表面从左边侧方运动朝着正确的侧方的肾肾囊通过一个0.2厘米的切口。
   13. 使用火焰拉玻璃毛细管探头，创建一个袋之间的肾囊和肾实质。这样做，通过步骤5.3.12切口插入探头，并在后方向移动，沿背侧面肾脏。一个理想的探头将在它的弯曲相匹配的这种肾脏表面自然的弧形。这将允许探头达到肾脏的最后结束，没有撕开一个大的前开放。重要的是使这一袋只要尽可能窄。短而宽的胶套是不理想的，因为它们允许胰岛摆脱胶囊。长而窄袋让胰岛沉积对肾脏后结束，从囊袋的损失降到最低。
   14. 检索步骤5.3.6准备25μl汉密尔顿注射器和胰岛细胞移动到边缘的斜面开放灵活的管。
   15. 插入软管斜边步骤5.3.13编写的包膜囊。斜边应朝上，使长边与肾实质的接触。管移动到最后结束胶囊。
   16. 慢慢地转移到包膜囊胰岛压下注射器的柱塞50的PE管。由于胰岛填补袋慢慢地退了出去软管要存入的胰岛更广阔的空间。确保所有的胰岛细胞是从管转入囊。不要填写与空气或多余的液体袋。
   17. 从袋子取出后PE 50管，使用火焰拉玻璃毛细管探头轻轻地包入囊近端胰岛。在一个前，后方向移动肾外表面沿滑动的玻璃探针。请小心不要包得太紧，可能会破裂的包膜囊后结束胰岛和释放的小岛。这一步，​​最大限度地减少损失的胰岛前开放的肾脏时被放置在腹腔袋。
   18. 使用弯曲的手臂钳解除腹腔的内衬，毗邻为肾所作出的开放，然后使用PBS浸泡棉花放倒撒施，轻轻推入腹腔肾脏。
   19. 关闭应用真皮层缝合腹腔壁及伤口剪辑鼠标。
   20. 5.3.19通过鼠标返回其余小鼠的笼子里，并重复步骤5.3.4。小鼠与下方的笼子里加热垫或加热灯与保护眼睛应保持温暖，直到鼠标完全从麻醉中复苏。 （6毫克/毫升）在水中的动物，应提供acetominophine。
   21. 非空腹血糖水平的24小时后检查。所有小鼠应normoglycemic（血糖<200mg/dl）在手术后一天（POD）1。

6。代表性的成果

在这个协议包括两个主要过程描述:（1）胰岛分离和（2）胰岛移植的肾囊下。在胰岛分离过程中，胰岛产量通常介于100-150胰岛每鼠的年龄和应变。这些胰岛细胞的纯度尊重他们从胰腺的外分泌细胞的分离，可以有很大的不同彼此之间的准备。但通常允许使用在步骤3.3.7和一个步骤3.3.170.1毫米尼龙过滤器的房间温度Histopaque1077为大于99％纯度的胰岛。这纯度达到之前，任何额外的手工采摘的胰岛。胰岛以下隔离的代表图像显示在图8d。在这些图像可以看出，胰岛细胞通常有一个粗略的外围边界后立即隔离。然而，随着时间在文化，健康的胰岛获取和保持一个平稳的边界（图8d）。在一些小岛，中央坏死区域发展，显示为暗区中的核心。这坏死的中心往往是被驱逐的胰岛时间推移成像（补充视频1）抓获。其余的小岛出现空心中心（数据未显示）和推测不能正常工作。因此，我们排除在手工采摘过程中与黑暗的中心小岛。更重要的是，我们发现，低温度孵化后的隔离程序（步骤4.2）可以显着降低，将发展文化，随着时间的推移中央坏死的胰岛。

在胰岛移植过程中，有两个步骤是关键:糖尿病和交付猪腰子胶囊面积的胰岛细胞的化学诱导。诱导的糖尿病，其目标是实现大于90 STZ小鼠注射％的高血糖。这些小鼠移植几个星期没有生存。菌素的最佳剂量为实现这一目标而异，对小鼠品系和年龄而异，应通过试验确定。我们发现，一个小如20mg/kg体重的差异，可以有很大的不同。因此，滴定窄的时间间隔应进行。对于胰岛移植，一个重要的考虑因素是模型，它可以有四个免疫情况:同源，异体，同系自身免疫性疾病，异体自身免疫性。在同源模型，供体菌株作为受体菌株相同。因此，胰岛不会调用从受助人的适应性免疫反应。这使研究人员能够调查的问题，围绕"主要的非功能"一词所指的胰岛功能障碍和由于其他原因，不是具体的受助人的免疫排斥反应的损失。被认为是主要的非功能胰岛失败的主要原因在早期的移植阶段的胰岛细胞的大量（≥2 /胰腺病人），以达到正常血糖的要求。因此，它是胰岛移植的关键问题。在此模型中，边际胰岛质量不完全恢复正常血糖应使用应检查血糖小鼠在移植后的早期阶段，通常之间的POD 1至7 POD。根据我们的经验，一个小岛的边缘质量通常是在150和250的平均大小，每20克收件人使用的C57BL / 6小鼠株的胰岛之间。随着同源模型，可以使用修改胰岛基因或药物，以测试是否一个特定的调制影响胰岛移植后的疗效在早期阶段。

同种异体和自身免疫性模型，胰岛移植是由主机的适应性免疫，其中包括T淋巴细胞，B淋巴细胞和其他免疫细胞暴露于特定的免疫攻击。自适应免疫是一种迟发性免疫反应;检测这种反应，有必要移植移植后的胰岛细胞在早期阶段，有效地恢复正常血糖饱和数量减少主要的非功能的影响。胰岛之前拒绝为正常血糖的损失表示，移植排斥反应的胰岛细胞进行任何修改，以确定的影响，可以监视的时间长度。在我们的经验，每20克鼠标需要大于300胰岛和15日至21日为捐助者和采用BALB / C异体移植排斥反应的时间（H - ^D）的C57BL / 6（H - ^B）收件人。

图1。定位胆总管十二指肠开放。排水从肝脏内源性消化酶，胰和胆囊胆总管通过，然后进入十二指肠肠道。通过这个管道流的方向可以逆转的，如果通过添加外部流体系统施加压力。这将导致胰腺成为全和扩张。

图2。夹紧胆总管十二指肠开放。为了填补与Liberase胰腺，它是必要块胆总管十二指肠开放的。如果这不是正确实现，Liberase将填补，而不是对胰腺的肠子。

图3。重新定位对膈肌肝脏允许胆总管近端区域的可视化。胆总管插管，可以实现最成功的是，如果它是企图近端附近（在2.3.1中所述的V形汇合）。

图4 Cannulating"自由胆总管。手"的方法。时对鼠标的后部拉止血夹在十二指肠，胆总管汇合成为可见。导管插管，可以通过放置在此汇合的27号针头，并通过它驾驶。

图5。Cannulating胆总管"钳协助"的方法。如前所述，在文本中，有时管道周围的筋膜组织使得难以cannulate。 （一）在这种情况下，它是有用的，以清除面部层与27号针头。 （二）管道，然后可以清楚地可视化和一双屈臂钳支持。 （三）使用逆止钳，27号针头可插入管Liberase交付。

图6。甚至扩大胰腺表示最佳针的位置。由于管道和周围的筋膜组织的半透明的性质，在某些情况下它可能会出现管道已插管时，实际上却并非如此。如果发生这种情况和进针穿透胰腺被膜，胰腺十二指肠地区将开始扩大Liberase交付后。然而，整个胰腺不会被灌注，这将导致胰岛产量低。为了避免这个问题，看专找酶进入胃的前壁部分胰腺区域的迹象，甚至扩大胰腺。

图7。卸下灌注胰腺。要删除从小鼠胰腺，接触点与内脏必须打破。 （AB），从肠道分离胰腺。 （三）单独从胃胰腺。 （四）从肠道分离胰腺。 （英）剪切与腹腔任何剩余接触。

图8。胰岛的代表图像。胰岛的相对纯度和质量可以估算微观的隔离程序完成后。 （a）虽然我们的目标是净化的胰腺中的胰岛，外分泌细胞和碎片偶尔存在。 （二）对胰岛隔离的压力可诱发细胞死亡，表现为暗中部地区从胰岛外围细胞和胰岛塌。 （三）当选择一个实验的小岛，避免采摘污染的外分泌细胞。 （四）胰岛细胞的变化在外观上与文化的时间。由于胰岛细胞恢复孤立的，他们获得一个光滑的外表面。偶尔在一个黑暗的中部地区较大的胰岛是可见的。这些细胞染色阳性细胞死亡。

补充视频1。时间后隔离胰岛失效显微镜。在此16hr时间的推移视频胰岛可以看出，发展最终弹出坏死中心。请点击这里视频 。

讨论

在上面的章节中，我们描述了隔离和小鼠胰岛移植的详细步骤。在这里，我们简要地强调程序成功的关键步骤。

1。胰岛隔离

关键的步骤是确定一个最佳的酶消化时间（1.4），定位在十二指肠，胆总管（2.2.3）开放的止血钳，后37 cannulating胆总管（2.3），胰腺剧烈摇晃° C精华（3.2），并拆除外分泌细胞污染（3.3.7和3.3.16）。这些步骤的质量，产量和纯度的胰岛的一个戏剧性的影响。也许是最具技术挑战的第一步是胆总管插管。在许多小鼠，胆总管可很难想象，由于周围的筋膜。因此，它是常见的，试图cannulate胆总管的筋膜组织的渗透管的结果。在这些情况下，Liberase开始，以填补周围结缔组织和不灌注胰腺。如果发生此种情况，停止的Liberase流动和重新定位针，使其渗透进入胆管管腔。通过实践，它是可以快速识别针放置的最佳位置，以不破坏易碎管的情况下完成插管。

2。胰岛移植

关键步骤是STZ诱导的糖尿病（5.1）和胰岛的有效传递到包膜袋（5.3.14-5.3.16）。菌素是一种自然发生的葡萄糖类似物，是有选择性的胰岛素分泌细胞^，胰岛9β-细胞毒性。然而，这种选择性的毒性发生在一个相对狭窄的浓度范围内。菌素高剂量可以导致高血糖的情况下迅速（2-3天）杀伤力的事实证明了这一点。因此，应采取应变和任何大规模实验开始前正在使用的小鼠的年龄，以确定最佳剂量链脲佐菌素。胰岛实物交割的包膜囊也是一个关键的一步。为了达成一致的结果，这是势在必行，以尽量减少损失胰岛期间及其运载工具。是否有缺陷或在肾囊囊的眼泪，或如果注入的体积过大，可能发生这种情况。温柔细心操作，避免使用光滑的玻璃探针准备包膜囊囊的损害，可以。此外，注射量可以减少小心去除上清液中的步骤5.3.6.3。如果上清液去除沉淀胰岛水平，通常有足够的空间，在包膜袋放在400至500胰岛多。但是，如果注射量太大，胰岛更容易泄漏出来的袋子，在移植过程中，影响实验的可重复性。

在这个协议中，它是可以修改的一些步骤，而且还能达到令人满意的成果。这些措施包括以下内容:（一），（b）为胰腺酶的不同方法，使用不同的酶消化胰腺（C）使用一个连续的聚蔗糖 - 钠泛影葡胺（FSD）梯度而不是单一密度Histopaque1077一步，和（D）胰岛移植肾subcapsule以外的地点。

1. 在这个协议中，Liberase是用来削弱内的胰腺细胞与细胞接触。 Liberase本质上是一种高度纯化的胰腺中的胰岛释放已被证明有用胶原酶的混合物。然而，少纯化的胶原酶能够完成了类似的结果。因此，它可以使用不同的商业用酶制剂，消化胰腺，只要消化条件进行了优化，实现高胰岛质量，产量和纯度。
2. 它也可能无导管灌注胰腺酶消化。 Liberase通过胆总管交付允许胰腺表面面积最大的酶接触。甚至更多的胰腺和更完整的胰岛释放的消化这个结果。然而，其他步骤增加胰腺酶的表面积，可以使用。例如，切碎之前在Liberase孵化或直接通过胰腺囊注射Liberase胰腺可用于孤立的小岛。然而，没有Liberase交付的另一种方法是通过胆总管灌注的有效。因此，切碎或直接注射应保留作为最后的手段，如果胆总管损坏，而不是perfusable。
3. 从外分泌细胞的分离胰岛的另一种方法涉及使用了消防处的梯度，而不是Histopaque1077 ^10。从本议定书的外分泌细胞胰岛的高效分离是由于两种类型的细胞之间的密度差的一部分。 Histopaque1077已为1.0771克/毫升的密度在25 ° C。在此温度下，Histopaque是较密集的小岛，但比外分泌细胞密集。因此，在离心，Histopaque1077颗粒的外分泌细胞的力量，同时解除胰岛表面。密度与任何其他物质，可以独立于外分泌细胞胰岛的原则，可以在此步骤中使用和消防处的梯度是一个这样的物质。
4. 关于胰岛移植的位置，在本议定书中所使用的肾囊是几个可能的地点之一。而肾subcapsule是最常报道的网站在小鼠体内移植，移植其他网站都被发现是有效的，它们包括肝门静脉，视网膜下腔，睾丸，附睾脂肪垫，脾，甚至^胰腺 11-14 。这些地区的每个人都有自己的优势和挑战。因此，为胰岛移植部位的选择应解决的问题，并在实验的具体情况确定。

据认为，胰岛移植可以克服的局限性的战略，将极大地提高其治疗的潜力。因此，这个协议的一个小鼠模型的详细使用，提供一个有吸引力的方法，确定这种战略。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640		GIBCO，Life Technologies	31800-022
Liberase TL		试剂 Roche Group	05401020001
胎牛血清	试剂	GIBCO，Life Technologies	10437-028
Histopaque1077试剂		Sigma-Aldrich	10771
霉素链霉素	试剂	GIBCO， by Life Technologies	15140
柠檬酸钠	试剂	Sigma-Aldrich	S4641
链脲佐菌素	试剂	Sigma-Aldrich	S-0130
HCl	试剂	Fisher Scientific	A144-212
异氟醚	试剂	Vedco， Inc.	ISOSOL
玻璃毛细管	设备	Fisher Scientific	22362574
胰岛素注射器	设备	BD Biosciences	329461
27 号注射器针头	设备	BD Biosciences	305109
汉密尔顿注射器 #1702	设备	Fisher Scientific	14813133
10cm 培养皿	设备	Fisher Scientific	0875712
6cm 培养皿	设备	Fisher Scientific	07770212
6-0 缝合	设备	Ethicon Inc.	8726H
PE 50 软管	设备	Fisher Scientific	NC9083963
5ml 一次性注射器	设备	BD Biosciences	309603
50ml 锥形管	设备	BD Biosciences	352098
15ml 锥形管	设备	BD Biosciences	352097
0.1mm 尼龙网	片设备	Fisher Scientific	22363549
0.419mm 金属丝网	设备	纽瓦克金属丝网公司	0300241
水浴培养箱	设备	Fisher Scientific	15-462-5
解剖显微镜	设备	Carl Zeiss， Inc.	Stemi SV6
倒置显微镜	设备	尼康仪器	TMS
组织培养箱	设备	Napco	6300
解剖剪刀	设备	Kent Scientific	INS14393
McPherson-Vannas 剪刀	设备	Kent Scientific	INS500260
弯口钳	设备	Kent Scientific	INS15915
止血钳	设备	Kent Scientific	INS 500451
异氟烷雾化器	设备	Smiths Medical	ISOTech 4 OHMEDA
摆动吊篮离心机	设备	杜邦 –Sorvall	RT6000D
摆动式斗式转子	设备	杜邦–Sorvall	H1000B
pH 计	设备	梅特勒托利多	09313509
凝胶上样吸头设备		Fisher Scientific	05408151
p200 吸头	设备	USA Scientific， Inc.	111-0730