方法文章

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

66.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/2096

⸱

2011年4月13日

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biochemistry, Center for Molecular Neurobiology, The Ohio State University, 2Integrated Biomedical Science Graduate Program, The Ohio State University, 3Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

本文内容

摘要

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。

摘要

自从 Ballinger 和 Reckard 早期的开创性工作表明，将朗格汉斯岛（胰岛）移植到糖尿病啮齿类动物体内可使其血糖水平恢复正常以来，胰岛移植一直被认为是一种治疗 1 型糖尿病的潜在方法1,2。近年来，人胰岛移植技术的进步进一步加强了这一观点1,3。然而，两大主要限制因素阻碍了胰岛移植成为广泛应用的临床现实：（a）每位患者需要大量胰岛，这严重限制了潜在受体的数量；（b）需要强效的免疫抑制治疗，而由于儿童患者对长期免疫抑制的敏感性，这一需求对其影响尤为显著。能够克服这些限制因素的策略有望提高胰岛移植的治疗效用。

将胰岛移植到小鼠肾包膜下是研究改善胰岛移植策略的广泛接受模型。该实验需要分离高质量的胰岛，并将胰岛植入糖尿病受体小鼠体内。这两个过程均涉及手术步骤，而视频演示比文字描述更能清晰展现操作细节。在此，我们通过视频和书面方案详细记录了这些操作的步骤。我们还简要讨论了不同的移植模型：同系移植、同种异体移植、同系自身免疫移植以及同种异体自身免疫移植。

方案

1. Liberase 试剂的准备与校准

  1. 本方案使用 Liberase TL（Roche，货号# 05 401 020 001）酶进行胰腺消化。
  2. 每次购买 100–200 mg 并配制大量批次。将冻干粉末用无菌 HPLC 级水重悬，使浓度约为每毫升 26 Wünsch 单位。该浓度应约为 5 mg/ml。有关特定批次所含 Wünsch 单位的详细信息，请参阅产品说明书。将管子置于冰上 30 分钟，每隔几分钟轻轻旋转混匀。30 分钟后检查，确保粉末已完全溶解。
  3. 将所有溶解的 Liberase 合并，并轻轻旋转混匀（切勿涡旋或剧烈震荡）。按每管 24.3 Wünsch 单位将溶液分装至预冷的 Eppendorf 管中，用液氮速冻（如同处理其他酶类），然后于 -80°C 保存。每管体积应约为 0.935 ml。每份分装仅限一次性使用（足够用于 11 只小鼠），解冻后不得再次冷冻或长期储存。通常情况下，该储备液至少可稳定保存 6 个月。
  4. 每配制一批新溶液，均需校准最佳孵育时间。校准应使用冻存的储备液，而非新近溶解的溶液，以尽可能模拟实际实验条件。
    1. 使用水银温度计将拟用的水浴锅精确校准至 37°C。后续实验应使用同一台孵育设备。
    2. 使用前，将一管 Liberase 在冰上解冻，并将其（0.935 ml）加入 21.6 ml 无血清 RPMI 培养基中，使工作浓度最终为每毫升 1.08 Wünsch 单位。血清、BAS 和 EDTA 会抑制 Liberase 活性，锌和钙为其辅助因子。配制后应置于冰上，并在 1.5 小时内使用完毕。此工作液足够用于约 11 只小鼠（每只 2 ml）。
    3. 参见步骤 2.3 中关于胰腺灌注的操作。尽可能在 1 小时内完成尽可能多只小鼠的灌注。随后分别使用一只或两只小鼠，测试 10、12、14、16 和 18 分钟的孵育时间。若条件允许，各时间点之间应以 30 秒为间隔，因消化时间的精确控制至关重要。
    4. 完成胰岛分离流程后，分析各孵育时间点的胰岛产量与质量。最终，峰值时间点之间的产量不应有显著差异，但这些时间点所获胰岛的质量可能有所不同。后续实验应选择在分离后 48 小时内能获得最多健康胰岛的条件。小鼠年龄似乎会影响最佳孵育时间，因此应使用年龄相近的小鼠。理想情况下使用 8–12 周龄小鼠；然而，即使是 8–10 月龄小鼠也能获得质量良好的胰岛。为校准目的，建议使用较年轻的小鼠。

2. 手术步骤

  1. 在处死胰岛供体小鼠前，准备好所有设备和培养基。
    1. 使用前对器械进行高压灭菌或火焰灭菌。所有试剂和接触样品的器械均应无菌。胰岛的分离与手工挑选可在无层流罩的环境中进行，不会显著增加污染发生率。然而，与胰腺或胰岛接触的工具必须严格灭菌，以避免污染。所需工具包括：
      • 解剖剪刀1把，用于腹部切口。
      • 镊子2对。
      • 止血钳1把，用于夹闭胆管。
      • 直径0.419 mm的金属网筛。
      • 直径0.1 mm的尼龙网筛。
    2. 将数根27号针头弯曲，使其在针体中段形成约70度的折角，针尖斜面应朝向弯折内侧。
    3. 用70%乙醇装满喷雾瓶。
    4. 在实验台或通风橱内设置配有适当光源的解剖显微镜。
    5. 将离心机预冷至4°C。离心机必须配备摆桶转子，能够达到900×g，具备制冷功能，并可关闭刹车。在配备Sorvall H1000B转子的Sorvall RT6000D离心机上，900×g对应转速为2400 RPM。较低转速设为800 RPM。
    6. 将以下试剂置于冰上。
      • RPMI（1升，含10%血清）
      • RPMI（200毫升，无血清）
      • 50毫升锥形管（每只胰腺1支）
      • 5毫升注射器。
    7. 将Histopaque1077平衡至室温。
    8. 在冰上解冻单次使用剂量的校准Liberase，用22.5毫升无血清RPMI稀释。血清、BAS和EDTA会抑制Liberase活性，锌和钙为其辅因子。稀释后置于冰上，1.5小时内使用完毕。此剂量适用于约11只小鼠（每只2毫升）。
    9. 预热37°C水浴锅。
    10. 准备足够数量的小鼠，确保在1小时内完成插管操作（约10–18只）。
  2. 准备小鼠进行插管。首先通过颈椎脱位或CO2窒息法处死小鼠。在小鼠濒死期间，用5毫升注射器吸取2毫升Liberase工作液（1.08 Wünsch单位/毫升）。
    1. 将小鼠仰卧置于解剖显微镜下的纸巾上，用70%乙醇喷洒腹部，然后从耻骨区域向两侧前肢做V形切口打开腹腔。将皮肤向胸部翻折，暴露腹腔。
    2. 将小鼠头部朝向操作者。定位胆总管进入十二指肠的位置，如图1所示。此步骤无需通过解剖显微镜目镜完成。
    3. 用止血钳夹闭十二指肠开口，如图2所示。夹闭位置至关重要，需有效阻止Liberase流入肠道。若夹闭位置过高或过低，Liberase将无法灌注胰腺。止血钳应夹在胰腺与肠道交界处，当夹紧时，钳子应恰好沿此边界走行。
  3. 在插管胆总管前，可能需要将肝脏向上推压至膈肌处，以充分暴露胆总管全长（见图3）。暴露胆总管后，使用连接Liberase注射器的弯曲27号针头进行插管。插管方法有两种：
    1. 第一种为“徒手”法：将夹在十二指肠上的止血钳从鼠头方向向尾部拉动，使胆总管绷紧。在靠近肝脏处，胆总管有一汇合点，来自胆囊的胆汁与来自肝脏的消化酶在此汇合后进入肠道。通过拉紧胆管，可暴露该汇合点形成的“V”形内侧，是插管的理想起始位置（见图4）。若位置正确，针头可顺利穿过“V”形区域，直接进入胆管下段。在注入Liberase前，将针头插入导管数毫米。最佳针头位置可防止Liberase反流至肝脏和胆囊。此外，需避免插入过深而阻塞脾管。脾管是胆总管的一个细小分支，引流胰腺脾尾部——该区域富含胰岛。若针头越过脾管开口，脾尾部灌注不完全，可能导致该区域消化不充分。最佳胰岛产量要求针头插入深度足以防止Liberase流入肝/胆囊，但又不至于越过脾管。可通过注入少量Liberase测试插管是否成功：若观察到Liberase充盈导管，则继续注入剩余2毫升；若导管周围组织开始肿胀，应立即停止注入，调整针头位置后重试。
    2. 第二种为“镊子辅助”法：将夹在十二指肠上的止血钳从鼠头方向向尾部拉动，使胆总管绷紧。然后使用连接5毫升注射器的弯曲27号针头，在靠近肝脏处刺穿胆总管下方的筋膜（见图5）。用针头清除导管周围的筋膜组织。保持针头在位，放下止血钳，取一对镊子。用镊子一臂抬起针头已清理筋膜的胆管部位。镊子的齿状边缘可形成引导通道，便于将针头导入导管。在向操作者方向牵拉胆管和镊子的同时，利用镊子作为后挡，将针头滑入导管。通过注入少量Liberase测试插管效果：若导管开始充盈（见图5箭头），则注入剩余2毫升；若导管周围组织开始肿胀，应停止注入，重新调整针头后重试。
  4. 当2毫升Liberase注入胰腺后，靠近十二指肠的区域首先膨胀，随后是胃上方区域，最后为脾尾部（见图6）。观察胰腺是否均匀膨胀（见图6）。若某区域开始膨胀，但未见白色组织均匀扩展和扩散，可能表明胆总管未成功插管，而针头已进入胰腺包膜内。此时将Liberase注入包膜会导致酶接触表面积小，胰岛产量较低。若发生此情况，应立即停止灌注，重新调整针头位置。
  5. 胰腺灌注完成后，可通过分离其与肠道、胃和脾脏的连接点将其取出。首先移除十二指肠上的止血钳，然后用镊子提起十二指肠，用另一对镊子将胰腺与肠道分离（见图7A-B）。操作时保持第二对镊子固定，同时将肠道从腹腔拉出。接着，将胰腺从胃上方和脾脏处分离（见图7C-D）。最后，将胰腺提起，剪断剩余筋膜连接，完全取出（见图7E-F）。
  6. 将胰腺放入50毫升锥形管中，置于冰上，继续处理其他小鼠。启动1小时计时器。为获得最大胰岛产量，每管仅放置一个胰腺。灌注后的胰腺在冰上保存时间不宜超过1小时，否则Liberase会持续降解组织。1小时后，应立即对所有灌注的胰腺进入第3.0步操作。
  7. 对剩余小鼠重复步骤2.3–2.6，或持续操作直至步骤2.6中启动的1小时计时结束。

3. 从灌注的胰腺中纯化胰岛

  1. 在从胰腺中纯化胰岛之前，必须将组织在 37°C 下进行消化。将装有灌注后胰岛的 50ml 离心管分组，放入适合置于 37°C 水浴中的开口底架中。确保所有管盖均已牢固封闭，然后将离心管浸入 37°C 水浴中，精确孵育预先确定的 Liberase 消化时间（见步骤 1.4）。孵育结束后，将离心管转移至冰上，并向每管中加入含 10% 血清的 RPMI1640 培养基至 20ml。含血清的培养基可终止 Liberase 的消化作用。
  2. 通过剧烈振荡离心管 10 秒内共 40 次，使组织解离。此步骤对胰岛的最佳回收率至关重要。即使 Liberase 灌注充分且消化时间精确校准，若组织未充分破碎，胰岛得率仍会较低。此步骤中对样品的剧烈操作似乎不会损伤小鼠胰岛，且为使胰岛从外分泌细胞团块中释放所必需。
  3. 为将胰岛与消化后的胰腺组织分离，请完成以下步骤。
    1. 将消化后的胰腺组织合并，使每管中约含 2.5 个胰腺。通过此操作，可将十管样品浓缩为四管，每管含 50ml 培养基。
    2. 在 800RPM 和 4°C 条件下离心 2 分钟。
    3. 倒去上清液，通过涡旋振荡数秒（调节涡旋强度至最大值的约 50%），将沉淀物重悬于 15–25ml 含 10% FBS 的培养基中。
    4. 将重悬后的混悬液经 0.419mm 网孔金属筛网和漏斗倒入新的 50ml 圆锥形离心管中。此步骤可分离未消化的组织、脂肪及淋巴组织。用额外 10ml 含 10% FBS 的培养基冲洗初始离心管，并经筛网倒入新管。对剩余离心管重复此过程。
    5. 在 800RPM 和 4°C 条件下离心 2 分钟。
    6. 倒去上清液，小心将离心管倒置于纸巾上。注意观察，确保胰岛未滑落。用纸巾擦拭管内壁以去除残留培养基，注意避免扰动细胞沉淀。将离心管恢复直立位置。
    7. 通过轻柔涡旋数秒，将沉淀物重悬于 5ml 室温 Histopaque1077 中。在沿管壁内侧加入额外 5ml Histopaque 前，确保混悬液均匀。此操作可将胰岛从管壁上冲洗下来。
    8. 在 Histopaque 上层缓慢覆盖 10ml 无血清 RPMI 培养基，注意维持 Histopaque 与培养基之间的清晰界面。沿管壁以每 10 秒 1ml 的速度缓慢加样。培养基应位于上层，Histopaque 位于下层。血清会影响培养基密度，因此此步骤中不应使用含血清培养基。
    9. 将样品置于已平衡至 20°C 的离心机中，以 2400RPM（900xG）离心 20 分钟，加速度极慢且不使用刹车。此步骤可将胰岛与外分泌细胞分离。胰岛将迁移至无血清培养基与 Histopaque 的界面处，而外分泌细胞则在管底形成沉淀。
    10. 使用一次性 10ml 血清学移液管从 Histopaque/培养基界面处收集胰岛。胰岛易黏附于玻璃表面，因此除非经过硅化处理，否则不应使用玻璃移液管。将收集的胰岛转移至新的 50ml 圆锥形离心管中。此时可将多个样品合并。用含血清的 RPMI 培养基将离心管补至 50ml。
    11. 在 800RPM 和 4°C 条件下离心 2 分钟。
    12. 倒去上清液，通过轻柔涡旋将胰岛重悬于 50ml 含血清的 RPMI 培养基中。
    13. 在 800RPM 和 4°C 条件下离心 90 秒。
    14. 倒去上清液，并再重复洗涤一次。
    15. 倒去上清液，将离心管转移至组织培养超净台。向含 10% FBS 的 RPMI 培养基中加入青霉素/链霉素，终浓度为 1%，以制备胰岛培养基。将胰岛重悬于 5ml 该培养基中。
    16. 将 0.1mm 尼龙细胞筛网倒置，置于 15ml 圆锥形离心管上。缓慢将重悬后的胰岛混悬液经筛网过滤。胰岛将被筛网截留，而外分泌细胞则通过筛网进入 15ml 离心管中。此步骤可显著提高实验结束时胰岛相对于外分泌细胞污染的纯度。
    17. 用额外 6ml 培养基冲洗 50ml 离心管，并经筛网移入。
    18. 在 10-cm 培养皿中加入 3ml 培养基，形成一大滴液。将细胞筛网正置，使其用于捕获胰岛的表面可浸入培养基液滴中。将滤膜接触培养基可将大部分胰岛转移至未经组织培养处理的培养皿中。使用未经处理的培养皿至关重要，可避免胰岛黏附和分散至培养皿表面。悬浮的胰岛更易于挑选并分至不同的实验组。
    19. 经筛网向培养皿中再加入 5–7ml 培养基，以冲洗筛网上残留的胰岛进入培养皿。
    20. 在倒置显微镜的 4x 物镜下检查胰岛得率和质量。以小椭圆形轨迹旋转培养皿，可将胰岛聚集于皿中央。若胰岛状态良好，可立即挑选用于实验，或均匀分至 4–6 个 10cm 培养皿中（每 10 只小鼠）。在同一培养皿中培养过多胰岛会导致胰岛坏死和退化。实验中，每 6cm 培养皿中 250–300 个胰岛，加入 2–3ml 培养基，似乎不会对胰岛造成应激。
    21. 在收集 0.1mm 尼龙细胞筛网滤过液的 15ml 圆锥形离心管中，仍会存在部分可用的胰岛。这些胰岛可通过三至四轮重力沉降回收。沉降约 4 分钟后，吸除除约 1ml 外的所有培养基，再用培养基补至管顶。盖紧管盖并倒置混匀。重复此过程数次，可去除沉降较慢的单个外分泌细胞，富集快速沉降的内分泌细胞团块（胰岛）。最后一次吸除后，将沉淀重悬于 7ml 培养基中，并接种至新的培养皿中。

4. 分离胰岛的处理

  1. 分离过程对胰岛会造成相当大的应激；Histopaque 具有毒性，振荡和离心步骤会引发剪切应力，而脱离宿主血液供应以及体外（in vitro）培养均可导致缺氧。我们及其他研究者已证实，分离过程会诱导β细胞死亡4-5。这些应激的影响表现为胰岛周边细胞脱落，以及胰岛中心区域变暗并被排出（中心坏死）。尽管周边细胞脱落尚可耐受，但胰岛的中心坏死会使其无法用于实验。通常，胰岛体积越大，发生中心坏死的可能性越高。因此，采取措施减轻胰岛在分离后的应激反应，有助于提高可用胰岛的产量。
  2. 因此，我们采用一种已有报道的方法，即在分离后的最初48–72小时内，将胰岛置于22–27°C的组织培养箱中孵育6-8。该较低温度可抑制胰岛的应激反应，使其更平稳地过渡到体外（in vitro）培养环境。若无22–27°C的组织培养箱，也可通过关闭标准组织培养箱的加热控制，并放入约20磅已平衡至-80°C的冷冻砖，来实现目标温度范围。此方法可在培养箱内维持约16–24小时的低温环境。根据需要更换-80°C的冷冻砖。我们未观察到在更低温度下孵育超过72小时能带来额外益处。
  3. 除低温孵育外，我们还建议在分离后24–48小时内更换培养基。应激和死亡胰岛所分泌的因子会在分离后积聚于培养基中，可能进一步加剧胰岛的应激。更换培养基时，请按以下步骤操作：
    1. 使用塑料移液管将培养皿中的培养基和胰岛转移至15 ml锥形管中。
    2. 用额外3 ml培养基冲洗培养皿，以收集残留的胰岛。
    3. 将此3 ml培养基加入15 ml锥形管中，静置5分钟，使胰岛依靠重力自然沉降。
    4. 从15 ml锥形管中吸除除1 ml外的所有培养基，然后将胰岛重悬于4 ml胰岛培养基中。
    5. 将胰岛和培养基转移至新的培养皿中。向15 ml锥形管中加入额外3 ml培养基，以收集任何残留胰岛，并将此液体加入培养皿中。
    6. 此后每三至五天更换一次胰岛培养基。
  4. 在为实验挑选胰岛时，不建议混合来自不同分离批次的胰岛。胰岛的分子基础受多种因素影响，包括其在培养中的时间长短以及不同制备批次间差异化的分离应激。为减少变异性，实验所用胰岛应来自同一批次的分离。然而，若无法实现，我们强烈建议在用于实验前，先将所有胰岛混合为一个群体。为实验挑选胰岛时，请按以下步骤操作：
    1. 若胰岛分置于多个培养皿中，应按照上述步骤4.3.1至4.3.5将所有胰岛合并至单一培养皿中。若涉及多个培养皿的胰岛，应使用50 ml锥形管代替15 ml管。此举可减少胰岛在分离后恢复期间因不同培养皿间微小培养条件差异所导致的变异性。
    2. 在胰岛依靠重力沉降期间，准备一台配备4x或10x物镜的倒置显微镜。准备一支p200微量移液器及一盒无菌p200吸头。
    3. 将沉降后的胰岛转移至单一培养皿，并将培养皿移至显微镜下。轻轻旋转培养皿，使胰岛聚集于中央。打开培养皿盖，使用p200移液器挑选健康的胰岛。健康的胰岛边界清晰、光滑，无中心暗区（图8）。实验组间应尽量保持胰岛大小分布均匀，因为胰岛大小可能影响其对处理的反应。
    4. 每实验组所需的胰岛数量可根据实验需求而定。我们估计，一个胰岛约含1000–2000个细胞，可提取0.3–1 μg蛋白和25 ng总RNA。对于体外（in vitro）检测，典型的实验组可将100至250个胰岛接种于35 mm或6 cm培养皿中，加入1–3 ml培养基。对于移植实验，每只受体小鼠所需胰岛数量为150至400个，具体取决于实验设计（详见步骤5.2.2及讨论部分）。
    5. 为尽量减少手工挑选过程引入的变异，我们使用p200移液器吸头的孔径作为参考，以估算胰岛大小。大多数胰岛的直径约为吸头孔径的一半，我们将此类胰岛计为一个标准胰岛。对于明显更大或更小的胰岛，相应调整胰岛计数。我们以20–50个为一批次收集胰岛，并转移至指定的实验培养皿中。若将p200移液器设定为180微升体积，可在单个吸头中收集多个胰岛（通常超过50个）。因此，尽管胰岛为逐个挑选，但通过控制移液器的释放机制，可在每个p200吸头中收集多个胰岛，从而高效完成数百甚至上千个胰岛的挑选。我们还利用这种分批操作，帮助均衡分配质量与大小相似的胰岛。

5. 肾包膜下胰岛移植

  1. 诱导移植受体小鼠的糖尿病。
    1. 使小鼠禁食4至6小时。理想的移植受体小鼠应在6至10周龄之间，禁食时体重为20至25克。为实现禁食，需从喂食架中移除食物，并始终将小鼠放入新笼中。这可确保小鼠与先前可能掉落至笼中的食物残渣分离，从而实现真正的禁食。预计80%至90%的小鼠将发展为糖尿病。
    2. 禁食开始3小时后，配制柠檬酸钠缓冲液。称取0.735 g酶级柠檬酸钠（Na Citrate，Mr 294.10 g/mol），溶于25 ml无菌去离子水中，用HCl调节pH至4.5。该缓冲液应每次实验前新鲜配制。
    3. 将0.05 g链脲佐菌素（STZ，Mr 265.2 g/mol）放入1.5 ml Eppendorph管中。此剂量足以诱导约8只小鼠发生糖尿病。根据需注射的小鼠数量，准备足够数量的1.5 ml离心管。STZ对光敏感，因此每管均需用铝箔包裹。
    4. 禁食4小时后，用1 ml新鲜配制的柠檬酸钠缓冲液重悬一管STZ。STZ-柠檬酸钠溶液在重悬后15至20分钟内即失去活性，因此该步骤仅应在注射前立即进行。
    5. 通过腹腔注射方式，向每只小鼠注射适量体积的STZ-柠檬酸钠溶液，以达到190 mg/kg小鼠的终剂量。该剂量可能因小鼠品系和年龄而异；因此，若糖尿病发生率过低或注射后3至5天内死亡小鼠过多，则可能需要进行剂量优化。常用的剂量范围为150 mg/kg小鼠至250 mg/kg小鼠。
    6. 所有小鼠注射完毕后，恢复其食物和饮水供应。
    7. 注射后2至4天检测小鼠非禁食状态下的高血糖（>350 mg/kg）。连续3天表现出非禁食高血糖的小鼠可作为移植受体使用。
  2. 准备用于移植的胰岛
    1. 按照前述步骤2.0至4.0所述方法分离胰岛。如有必要，可在移植当天或之前完成胰岛分离。
    2. 将胰岛分组并转移至无菌1.5 ml Eppendorph管中，用于后续移植。保持离心管置于冰上。恢复正常血糖所需的胰岛数量可能因实验条件（胰岛供体品系、受体体重与品系、受体是否接受其他处理）以及操作人员而异。受体小鼠的体型是影响所需最小胰岛数的主要变量之一，体型较大的小鼠需要更多胰岛。我们一致发现，150至250个胰岛仅能轻微恢复C57BL/6受体小鼠（体重18至20克）的正常血糖，而300个或更多胰岛则具有治疗效果。在这些实验中，胰岛供体小鼠为C57BL/6或Balb/c品系。
  3. 将胰岛移植至肾包膜下囊袋
    1. 准备以下材料（所有外科器械必须灭菌）：

      表1. 移植所需设备
      25μl Hamilton注射器6" 长PE 50软管，一端切割成斜面
      凝胶上样枪头和p200移液枪头无菌Eppendorph管（每只受体1支）
      异氟烷及异氟烷挥发器Eppendorph管架
      McPherson-Vannas剪刀（1把）弯臂镊（2把）
      止血钳（1把）伤口夹及夹子
      27号针头火焰拉制的玻璃毛细管探针*
      棉签50 ml锥形管装无菌PBS
      缝合线电动剪刀
      70%乙醇喷雾瓶圆珠笔
      聚维酮碘（Betadine）透明无菌塑料铺巾


      * 注：制备这些探针时，应尝试使探针形成与小鼠肾脏自然弧度相匹配的弧形。此外，确保探针末端经过充分火焰抛光，避免存在任何锐边。
    2. 称重并标记所有糖尿病受体小鼠。在移植前将每只小鼠分配至实验组，确保各组间体重匹配。
    3. 在配备异氟烷挥发器排气装置的开放式通风橱内设置手术区域。
    4. 使用异氟烷麻醉一只受体小鼠，然后用电动剪刀剃除其侧腹部毛发。剃毛操作应在移植操作区域之外进行。
    5. 将小鼠重新置于麻醉状态，使其侧卧并垂直于玻璃棒轴线，剃毛侧朝上。用70%乙醇喷洒侧腹部。以聚维酮碘和酒精交替进行外科消毒，重复三次。用透明无菌铺巾覆盖小鼠，仅暴露剃毛区域。
    6. 在小鼠麻醉期间准备用于移植的胰岛，具体步骤如下：
      1. 将一支无菌凝胶上样枪头插入1.5 ml Eppendorph管开口，使其在枪头窄端形成轻柔的U形弯曲。枪头开口应垂直向上伸出离心管。切勿在凝胶上样枪头任何部位形成折痕，否则会导致胰岛剪切损伤，并减少成功移植的胰岛数量。
      2. 轻柔地从冰上取出在步骤5.2.2中准备好的一管胰岛。所有胰岛应已沉降至管底。使用p200移液器，从管底以最小体积轻柔吸取胰岛。将这些胰岛通过步骤5.3.6.1中准备好的凝胶上样枪头的大口端转移。胰岛应沉降至枪头窄段或狭窄区域。
      3. 待胰岛沉降后，尽可能去除凝胶上样枪头中的培养基。可通过将新的凝胶上样枪头连接至p200移液器，从含胰岛的凝胶上样枪头大口端吸取培养基来完成。
      4. 将沉降后的胰岛转移至PE 50软管（约15 cm长）。操作时，先将软管非斜面端连接至含胰岛的凝胶上样枪头窄口端，再将枪头连接至p200移液器。随后将胰岛推入软管约60%长度处。
      5. 将含胰岛的PE 50软管转移至25 μl Hamilton注射器。转移前确保注射器活塞已拉出。将PE 50软管的非斜面端连接至注射器针头。
      6. 推动注射器活塞，使胰岛移至距离斜面开口约0.5 cm处。
      7. 将注射器暂放一旁，使胰岛在软管斜面开口附近聚集成单一团块，同时准备肾脏以接受移植。
    7. 用手指在麻醉小鼠皮肤下定位肾脏。圆珠笔轴线应正位于肾脏所在区域下方，并与脊髓垂直。
    8. 确定肾脏位置后，使用McPherson-Vannas剪刀在皮肤真皮层上方垂直于脊髓方向做2 cm切口。此切口将暴露腹膜壁。
    9. 使用McPherson-Vannas剪刀沿与皮肤切口相同方向，在腹膜壁上做1 cm切口。重要的是，此切口形成的开口应小于待暴露的肾脏。
    10. 以玻璃棒轴线作为支撑，按压邻近表面，使肾脏通过腹膜开口突出。若开口略小于肾脏，则肾脏会挤压通过开口并稳定停留在小鼠体表，无需额外操作或接触。此位置最有利于后续移植操作。若开口过大，肾脏将回缩至腹腔内，使后续操作难以完成。
    11. 使用浸有冰浴无菌PBS的棉签润湿暴露的肾脏表面。每隔几分钟或根据需要重复此步骤，以防止肾包膜干燥。
    12. 使用27号针头，在肾脏前表面从左侧向右侧横向穿过肾包膜做0.2 cm切口。
    13. 使用火焰拉制的玻璃毛细管探针，在肾包膜与肾实质之间创建囊袋。操作时，将探针通过步骤5.3.12所做切口插入，并沿肾脏背外侧面向后推进。理想的探针应具有与肾脏表面自然弧度相匹配的弯曲，以便探针在不撕裂较大前部开口的情况下到达肾脏最远端。应尽可能使囊袋长而窄。短而宽的囊袋不理想，因其易导致胰岛从包膜逸出；长而窄的囊袋可使胰岛沉积于肾脏远端，最大限度减少从包膜囊袋中丢失。
    14. 取步骤5.3.6中准备好的25 μl Hamilton注射器，将胰岛移至软管斜面开口的最边缘。
    15. 将软管斜面端插入步骤5.3.13中制备的肾包膜下囊袋。斜面应朝上，使长边与肾实质接触。将软管推送至包膜最远端。
    16. 通过推动注射器活塞，缓慢将胰岛从PE 50管转移至包膜下囊袋。随着胰岛逐渐填充囊袋，缓慢后撤软管，为更多胰岛留出空间。确保所有胰岛均从管中转移至囊袋。切勿向囊袋中注入空气或过量液体。
    17. 将PE 50管从囊袋中取出后，使用火焰拉制的玻璃毛细管探针轻柔地将胰岛压实至囊袋近端。操作时，沿肾脏外表面从前向后滑动玻璃探针。注意不要过度压实，以免包膜下囊袋远端破裂并释放胰岛。此步骤可最大限度减少肾脏放回腹腔时胰岛从前部开口丢失。
    18. 使用弯臂镊提起腹膜切口旁的腹膜组织，再用PBS浸湿的棉签轻柔地将肾脏推回腹腔内。
    19. 使用缝合线缝合腹膜壁，使用伤口夹闭合皮肤层。
    20. 将小鼠放回笼中，并对剩余小鼠重复步骤5.3.4至5.3.19。小鼠应置于加热垫上或使用带眼部保护的加热灯保温，直至完全从麻醉中恢复。动物应通过饮水给予对乙酰氨基酚（6 mg/mL）。
    21. 术后24小时检测非禁食血糖水平。所有小鼠在术后第1天（POD 1）应恢复为正常血糖（血糖 <200 mg/dl）。

6. 典型结果

本方案中描述了两个主要步骤：（1）胰岛分离和（2）肾包膜下胰岛移植。在胰岛分离过程中，每只小鼠获得的胰岛数量通常在100–150个之间，具体数量取决于小鼠的品系和年龄。这些胰岛与胰腺外分泌细胞分离的纯度在不同制备样本之间可能存在较大差异。然而，在步骤3.3.7中使用室温的Histopaque1077，以及在步骤3.3.17中使用0.1 mm尼龙滤膜，通常可使胰岛纯度超过99%。该纯度水平在未进行任何人工挑选胰岛操作前即可达到。分离后胰岛的代表性图像见图8D。如图所示，胰岛在刚分离后通常具有粗糙的边缘。然而，随着体外培养时间的延长，健康的胰岛会逐渐形成并维持光滑的边缘（图8D）。部分胰岛中心区域可能出现坏死，表现为中央的暗区。该坏死核心常通过延时成像被观察到从胰岛中排出（补充视频1）。剩余的胰岛在中心呈现中空状态（数据未显示），推测其功能已丧失。因此，在人工挑选过程中，我们会剔除具有暗色中心的胰岛。重要的是，我们发现分离后采用低温孵育（步骤4.2）可显著减少随培养时间推移而发生中心坏死的胰岛数量。

在胰岛移植手术中，有两个关键步骤：化学诱导糖尿病以及将胰岛移植至肾包膜下区域。对于糖尿病的诱导，目标是使超过90%接受链脲佐菌素（STZ）注射的小鼠出现高血糖。这些小鼠在未进行移植的情况下可存活数周。实现该目标所需的STZ最佳剂量因小鼠品系和年龄而异，需通过实验确定。我们发现，剂量差异小至20 mg/kg体重即可产生显著影响。因此，应采用较小梯度间隔进行剂量滴定实验。对于胰岛移植，一个关键因素是实验模型的选择，其可包含四种免疫学背景：同系移植、同种异体移植、同系自身免疫模型以及同种异体自身免疫模型。在同系移植模型中，供体品系与受体品系相同，因此胰岛不会引发受体的适应性免疫反应。这使得研究人员能够研究“原发性无功能”相关问题，“原发性无功能”指胰岛功能障碍和丢失，其原因并非受体特异性免疫排斥所致。目前认为，原发性无功能是胰岛移植早期阶段移植失败的主要原因，也是临床上需要移植大量胰岛（≥2个供体/患者）才能实现正常血糖的主要原因，因此是胰岛移植中的关键问题。在此模型中，应使用亚治疗剂量的胰岛数量，即不足以完全恢复血糖正常的胰岛数量，并在移植后早期阶段（通常为术后第1天至第7天）监测小鼠的血糖水平。根据我们的经验，使用C57BL/6品系小鼠时，每20克体重受体所使用的边缘胰岛数量通常在150至250个平均大小的胰岛之间。利用同系移植模型，研究人员可使用经过基因修饰或药物处理的胰岛，以检测特定调控是否会影响胰岛在移植后早期的治疗效果。

在同种异体移植和自身免疫模型中，胰岛移植物会受到宿主适应性免疫系统的特异性攻击，该过程涉及T淋巴细胞、B淋巴细胞及其他免疫细胞。适应性免疫是一种延迟发生的免疫反应；为了检测这一反应，必须移植足够数量的胰岛，以在移植后早期有效恢复血糖正常水平，从而最大限度地减少原发性功能丧失的影响。随后可通过监测胰岛因血糖正常水平丧失而被排斥所需的时间，来评估任何胰岛修饰对移植物排斥反应的影响。根据我们的经验，每20克小鼠需要移植超过300个胰岛，而在使用Balb/c（H-2d）作为供体、C57BL/6（H-2b）作为受体的同种异体移植中，排斥时间通常为15至21天。

解剖显微镜图像中的十二指肠入口和胆总管，消化系统研究。
图1. 定位胆总管在十二指肠的开口。来自肝脏、胰腺和胆囊的内源性消化酶经由胆总管排出，随后在十二指肠处进入肠道。若通过外加液体对系统施加压力，则可使胆总管内的流向发生逆转。这将导致胰腺充盈并膨胀。

使用手术钳进行软组织夹闭技术；用于教学研究的特写示意图。
图 2. 夹闭胆总管的十二指肠开口。为了使Liberase能够灌注胰腺，必须阻断胆总管的十二指肠开口。如果此步骤未正确完成，Liberase将进入肠道而非胰腺。

肝脏解剖结构，内窥镜图像中标注的胆管；内脏器官识别，医学研究。
图 3. 将肝脏复位至紧贴膈肌，可使胆总管近端区域得以清晰显影。若在胆总管近端（如 2.3.1 中所述的 V 形汇合处）进行插管操作，则成功率最高。

显微外科技术；放大视野下显示手术器械对组织的精细操作。
图 4. 采用“徒手”法插管胆总管。当夹住十二指肠的止血钳被拉向小鼠后端时，胆总管汇合处即变得可见。可通过将27号针头置于该汇合处并穿刺进入实现插管。

唾液腺导管插管；操作步骤；外科技术；内镜插入法。
图5. 采用“钳子辅助法”对胆总管进行插管。如文中所述，有时导管周围的筋膜组织会增加插管难度。(A) 此时，使用27号针头清除表面筋膜层较为有效。(B) 随后可清晰观察导管，并用一对弯臂钳夹持固定以提供支撑。(C) 利用弯臂钳作为支点，将27号针头插入导管，以注入Liberase。

显示胃部解剖结构并标注用于教学的手术示意图。
图6. 胰腺的均匀膨胀表明针头位置理想。由于导管及周围筋膜组织呈半透明状，有时可能误判导管已被成功插管，而实际上并未进入。若发生此情况且针头刺入胰腺被膜，当注入Liberase时，胰腺的十二指肠区域将开始膨胀。然而，整个胰腺将无法得到充分灌注，导致胰岛产量偏低。为避免此问题，应仔细观察胰腺与胃前壁相连区域是否有酶液进入的迹象，以确认胰腺是否均匀膨胀。

手术步骤；解剖、组织处理；解剖学、医学教育。
图 7. 取出灌注后的胰腺。为从小鼠体内取出胰腺，需切断胰腺与内脏的多个连接部位。(A-B) 将胰腺与肠道分离。(C) 将胰腺与胃部分离。(D) 将胰腺与肠道进一步分离。(E-F) 切断胰腺与腹腔之间任何残留的连接。

胰岛显微镜图像、外分泌细胞污染、细胞聚集和中央坏死。
图8. 胰岛的代表性图像。在胰岛分离操作完成后，可通过显微镜评估胰岛的相对纯度和质量。(A) 尽管目标是从胰腺中纯化胰岛，但偶尔仍会存在外分泌细胞和碎片。(B) 胰岛分离过程中的应激可导致细胞死亡，表现为胰岛中央出现深色区域以及胰岛周边细胞脱落。(C) 在为实验挑选胰岛时，应避免挑选混杂的外分泌细胞。(D) 胰岛在培养过程中外观会随时间发生变化。随着胰岛从分离过程中恢复，其表面逐渐变得光滑。偶尔在较大的胰岛中可见中央深色区域，这些细胞经染色可显示细胞死亡阳性。

补充视频 1。 分离后胰岛的延时显微镜观察。在此段持续 16 小时的延时视频中，可见胰岛形成坏死中心，最终被排出。请点击此处观看视频。

讨论

在上述章节中，我们详细描述了分离和移植小鼠胰岛的步骤。此处，我们简要强调对实验成功至关重要的关键步骤。

1. 胰岛分离

关键步骤包括确定最佳的酶消化时间（1.4）、将止血钳夹置于胆总管的十二指肠开口处（2.2.3）、插管胆总管（2.3）、在37°C消化后剧烈震荡胰腺（3.2），以及去除外分泌细胞污染（3.3.7 和 3.3.16）。这些步骤对胰岛的质量、产量和纯度具有显著影响。其中技术上最具挑战性的步骤可能是胆总管插管。在许多小鼠中，由于周围筋膜组织的遮挡，胆总管难以清晰辨认。因此，尝试插管时常仅穿入筋膜组织而非胆总管本身。在这种情况下，Liberase 将开始填充周围结缔组织，而无法灌注胰腺。一旦观察到此现象，应立即停止 Liberase 的灌注，重新调整针头位置，使其准确进入胆总管管腔内。通过练习，可迅速掌握针头放置的最佳位置，并在不损伤脆弱胆管的前提下完成插管操作。

2. 胰岛移植

关键步骤包括链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病（5.1）以及将胰岛高效递送至肾包膜下囊腔（5.3.14–5.3.16）。STZ 是一种天然存在的葡萄糖类似物，对胰岛中分泌胰岛素的β细胞具有选择性毒性9。然而，这种选择性毒性仅在相对较窄的浓度范围内发生。这一点可通过以下事实得到证实：高剂量的 STZ 可能在无高血糖的情况下导致小鼠在 2–3 天内迅速死亡。因此，在开展大规模实验之前，必须仔细确定所用小鼠品系和年龄对应的 STZ 最佳剂量。将胰岛物理递送至肾包膜下囊腔同样是关键步骤。为了获得一致的结果，必须尽量减少胰岛在递送过程中的损失。若覆盖囊腔的肾包膜存在缺陷或撕裂，或注射体积过大，则可能发生胰岛丢失。通过轻柔谨慎的操作以及使用光滑的玻璃探针制备肾包膜下囊腔，可避免对包膜造成损伤。此外，在步骤 5.3.6.3 中仔细去除上清液可进一步减小注射体积。若将上清液去除至沉淀胰岛的水平，肾包膜下囊腔通常足以容纳 400 至 500 个胰岛。然而，若注射体积过大，在移植过程中胰岛更易从囊腔中漏出，从而影响实验的可重复性。

在本方案中，可以对某些步骤进行修改，同时仍可获得满意的结果。这些修改包括：(a) 使用不同的酶消化胰腺，(b) 采用不同的方法将酶输送至胰腺，(c) 使用连续的泛影葡胺-二碘异酞酸钠（FSD）梯度替代单一密度的Histopaque1077步骤，以及(d) 将胰岛移植至肾包膜以外的其他部位。

  1. 在本实验方案中，使用Liberase来削弱胰腺内的细胞间连接。Liberase本质上是高度纯化的胶原酶混合物，已被证实可用于从胰腺中有效释放胰岛。然而，纯度较低的胶原酶也能实现类似效果。因此，只要优化消化条件以获得高质量、高产量和高纯度的胰岛，即可使用不同商业来源的酶制剂进行胰腺消化。
  2. 也可在不通过导管灌注酶液的情况下消化胰腺。通过胆总管输送Liberase可使胰腺表面积最大程度地暴露于酶液中，从而实现更均匀的消化并更有效地释放完整的胰岛。然而，也可采用其他方法增加胰腺与酶液接触的表面积。例如，在将胰腺组织剪碎后置于Liberase中孵育，或直接通过胰腺包膜注射Liberase，均可用于胰岛分离。但这些方法在Liberase递送效率上均不及经胆总管灌注。因此，仅当胆总管受损无法灌注时，才应将剪碎组织或直接注射作为备选方案。
  3. 另一种分离胰岛与外分泌细胞的方法是使用FSD梯度，而非Histopaque107710。本方案中胰岛与外分泌细胞的有效分离部分依赖于两类细胞之间的密度差异。Histopaque1077在25°C时的密度为1.0771 g/ml。在此温度下，Histopaque的密度高于胰岛但低于外分泌细胞。因此，在离心力作用下，Histopaque1077会将外分泌细胞沉淀至管底，而使胰岛上浮至液面。原则上，任何具有适当密度、能够实现胰岛与外分泌细胞分离的介质均可用于此步骤，FSD梯度即为其中一种可行替代物。
  4. 关于胰岛移植的部位，本方案所采用的肾包膜是少数可行位点之一。尽管在小鼠中，肾被膜下是最常报道的移植部位，但其他位点也被证实有效，包括肝门静脉、视网膜下腔、睾丸、附睾脂肪垫、脾脏，甚至胰腺本身11-14。每个移植位点均有其各自的优势与挑战。因此，胰岛移植位点的选择应根据研究所针对的科学问题及实验的具体条件而定。

人们认为，能够克服胰岛移植局限性的策略将显著增强其治疗潜力。因此，采用本方案中详细描述的小鼠模型为识别此类策略提供了一种可行的方法。

致谢

本工作由 RO1 DK064938（资助对象：T.H.）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640试剂GIBCO, by Life Technologies31800-022
Liberase TL试剂Roche Group05401020001
胎牛血清试剂GIBCO, by Life Technologies10437-028
Histopaque1077试剂Sigma-Aldrich10771
青霉素-链霉素试剂GIBCO, by Life Technologies15140
柠檬酸钠试剂Sigma-AldrichS4641
链脲佐菌素试剂Sigma-AldrichS-0130
HCl试剂Fisher ScientificA144-212
异氟烷试剂Vedco, Inc.ISOSOL
玻璃毛细管设备Fisher Scientific22362574
胰岛素注射器设备BD Biosciences329461
27号注射针头设备BD Biosciences305109
Hamilton 注射器 #1702设备Fisher Scientific14813133
10 cm 培养皿设备Fisher Scientific0875712
6 cm 培养皿设备Fisher Scientific07770212
6-0 缝合线设备Ethicon Inc.8726H
PE 50 柔性导管设备Fisher ScientificNC9083963
5 ml 一次性注射器设备BD Biosciences309603
50 ml 锥形管设备BD Biosciences352098
15 ml 锥形管设备BD Biosciences352097
0.1 mm 尼龙网设备Fisher Scientific22363549
0.419 mm 金属网设备Newark Wire Cloth Company0300241
水浴培养箱设备Fisher Scientific15-462-5
解剖显微镜设备Carl Zeiss, Inc.Stemi SV6
倒置显微镜设备Nikon InstrumentsTMS
组织培养箱设备Napco6300
解剖剪刀设备Kent ScientificINS14393
McPherson-Vannas 剪刀设备Kent ScientificINS500260
弯头镊子设备Kent ScientificINS15915
止血钳设备Kent ScientificINS 500451
异氟烷雾化器设备Smiths MedicalISOTech 4 OHMEDA
水平转子离心机设备Dupont – SorvallRT6000D
水平转子设备Dupont – SorvallH1000B
pH计设备Mettler Toledo09313509
加样枪头设备Fisher Scientific05408151
p200 枪头设备USA Scientific, Inc.111-0730

参考文献

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Islet transplantation as a treatment for diabetes. J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).
  3. Gangemi, A. Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol. Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).
  4. Zmuda, E. Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model. Diabetologia. , Forthcoming (2010).
  5. Bottino, R. Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment. Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).
  6. Markmann, J. F. The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression. Transplantation. 49, 272-277 (1990).
  7. Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts. Diabetes. 35, 83-88 (1986).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).
  9. Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells. Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).
  10. Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets. Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).
  11. Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts. Transplantation. 43, 747-749 (1987).
  12. Nasr, I. W. Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells. J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).
  13. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).
  14. Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats. Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).

重印与许可

标签

Histopaque
小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。