激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）是一种用于质谱分析的常压电离源。在成像模式下，中红外激光用于探测组织切片或生物膜中分子的空间分布。该技术为在接近天然实验条件下开展多种生物分析研究提供了一种新方法。
本文内容
摘要
摘要
质谱中的常压电离方法能够在接近天然条件的实验环境下，直接对组织或生物膜进行分析检测。激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）便是其中一种技术，特别适用于含水样品的分析。LAESI 利用中红外激光束（波长为 2.94 μm）激发样品中的水分子。当烧蚀能量密度超过阈值时，样品材料以颗粒物形式被喷射出来，并可向上飞行至距样品表面数毫米的高度。在 LAESI 中，这些烧蚀羽流被高电荷液滴拦截，从而捕获部分喷出的样品物质，并将其化学组分转化为气相离子。通过配备常压离子源接口的质谱仪，可对来自样品探测区域（像素）所释放离子的组成进行分析和记录。通过对一系列像素点进行系统性扫描，可实现微探针分析模式下的分子成像。LAESI 质谱成像的一个独特之处在于其具备深度剖析能力，结合横向成像，可实现三维（3D）分子成像。目前其横向分辨率和深度分辨率分别约为 100 μm 和 40 μm，LAESI 质谱成像有助于探索生物组织的分子结构。本文综述了 LAESI 系统的主要组成部分，并为成功开展成像实验提供了操作指南。
方案
以下方案描述了激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）实验的主要步骤，并提供了针对动物和植物组织样本进行横向及三维（3D）成像的代表性示例。更多实验和技术细节可参见其他文献1-6。
1. 组织制备与封片
- 若需要切片，使用冷冻切片机在 -10 至 -20 °C 下将组织切成 10–100 μm 厚的切片，除非特定组织类型另有建议。
- 将切片直接贴附到平整表面（例如经化学预清洁的载玻片）上，无需使用化学修饰剂。对于已切片的组织，应进行解冻贴片，并在解冻贴片后立即将样品台固定于帕尔贴冷却台上，以确保分析过程中组织始终处于冷冻状态。此步骤旨在最大限度减少或防止切片中分子的迁移。
- 如有需要，可使用配备低功率风扇的散热器，以促进帕尔贴冷却台的热量散发，维持组织的冷冻状态。
- 在长时间（1–2 小时）的高湿度环境中，需检查组织表面是否出现水或冰的冷凝现象。组织表面的水分冷凝会对 LAESI 实验中的成像性能产生不利影响。1
- 如有需要，可使用室内除湿机，或将冷却后的样品置于充满惰性气体（例如干燥氮气）的环境舱内，以防止冷凝。1
2. LAESI 离子源的优化
LAESI 离子源由一个中红外激光器、一系列用于导光和聚焦的光学元件，以及附加的样品支架、冷却组件、平移台和溶剂输送系统组成。图1展示了这些元件相对于质谱仪常压离子源入口的典型排列方式。
- 如图1所示，将样品置于质谱仪采样锥孔下方15-20 mm处（dOR-FP).
- 操作中红外激光器 2.94 μm 波长和 10 Hz 重复频率。将激光输出衰减至约 ~100 μJ/puls能量。
- 使用金镜组合以及在激光波长下透明的聚焦透镜（例如平凸 CaF₂ 透镜）2 或使用ZnSe透镜）以垂直入射方式将激光脉冲能量耦合到样品中（参见图1中相对于样品表面的右入射角）。
- 将中红外光束轴线置于质谱仪采样锥孔前方5-8 mm处。
- 调节聚焦透镜的位置和激光束的脉冲能量，以在焦点处实现组织去除。被消融体积的尺寸决定了成像应用中像素（或三维成像中的体素）的大小。
- 将纳米喷雾电离源与质谱仪进样口轴线对齐，并使电离源尖端与进样口之间的距离约为 10 mm（见图 1）。
- 对于电喷雾，分别使用含0.1%乙酸或0.1%乙酸铵添加剂的50%甲醇溶液，以适用于正离子模式或负离子模式。根据样品情况，可使用乙腈、异丙醇等其他有机溶剂替代甲醇，浓度应根据分析任务适当调整。电喷雾的稳定性对成功成像至关重要。根据所选溶剂的不同，需调节流速和喷雾电压以获得稳定的喷雾。
- 用于反应性LAESI6 在成像应用中，电喷雾溶液可能含有反应物。
- 使用注射泵以约300 nL/min的流速将电喷雾溶液通过电喷雾发射器输送。
- 如果质谱仪的入口保持在低电压（<500 V 相对于接地点），通过直接向电喷雾发射器施加高电压（例如 3000 V）或经由金属接头产生电喷雾；否则，应将电喷雾发射器直接接地或通过金属接头接地以建立电喷雾。
- 以 LAESI 实现最高效离子生成时，应使电喷雾源在锥-射流喷雾模式下运行。有关操作参数对喷雾模式及其对质谱图影响的讨论，请参见其他文献中的论述。5,7,8
- 仔细调整LAESI装置的相对距离，以优化LAESI离子产率，同时确保激光束、发射器和孔口轴线位于同一平面。详细操作步骤请参见其他资料。5
- 使用光学显微镜测定样品上消融坑的横向尺寸。
- 在三维LAESI成像实验中，使用单个脉冲进行消融，并通过例如光学显微镜的z-stack模式确定体素的深度。3
3. 分子成像与数据分析
在成像实验中，组织样本在激光的焦平面内沿X和Y方向移动，步长等于或大于消融光斑的尺寸。空间分辨率受限于入射激光束的聚焦能力。
- 在样品表面选择感兴趣的区域，并获取相应边界的 (X, Y) 坐标。
- 选择一种光栅化算法（例如自适应网格、选定区域成像、矩形网格、螺旋模式、Z 扫描等），用于在待成像区域内，以每个像素设定的停留时间对样品表面进行逐点扫描。
- 使用三轴平移台及能够按照预设网格对样品进行光栅扫描的软件。
- 计算成像所需的总时间。
- 禁用质谱仪的数据采集时间限制。如果无法禁用，则将数据采集时间限制设置为计算所得的成像时间值。
- 启动中红外激光源，其重复频率应适当，以确保在每个像素的停留时间内产生足够的质谱信噪比，从而进行 LAESI 横向成像实验。对于三维分子成像，应使用高于激光源重复频率的谱图采集速率，以成功对单个激光脉冲产生的离子进行质谱分析。等待 START 信号以启动消融序列。
- 开启电喷雾源。确保溶液量足以支持整个成像过程所需的时间。
- 同时启动质谱采集、中红外激光消融和表面扫描。
- 当成像运行结束后，停止表面扫描、中红外激光发射和数据采集。
- 关闭激光源。
- 关闭高压电源。
- 关闭注射泵。
- 将质谱仪设置为待机（STANDBY）模式。
- 关闭帕尔贴冷却电子设备。
- 若使用了惰性气体，则关闭其气流。
- 使用软件将横向成像中的像素或三维分析中的体素的绝对坐标与相应的质谱数据相关联。
- 绘制选定 m/z 值的离子强度信号随分析绝对坐标的分布图，以获得二维横向和三维分子图像。
4. 代表性结果
图2展示了一些主要组织类型和成像模式的代表性结果。图A显示了一个动物组织切片的案例，该切片在实验过程中被冷冻以防止脱水1。此外，样品被置于干燥的氮气环境中，以避免环境中的水蒸气在样品表面冷凝。使用LAESI对大鼠脑（Rattus norvegicus）的100 μm厚冠状切片进行侧向成像。脑部的解剖区域（见图A中的光学图像）与质荷比（m/z）为728.559的缩醛磷脂PC(O-33:3)和/或PE(O-36:3)的分子成像结果显示出良好的对应关系。
图B展示了斑马植物（Aphelandra squarrosa）叶片组织的三维LAESI成像结果。由于叶片具有天然的抗脱水防御机制，因此可在常温常压环境下直接对样品进行检测3。所获得的三维分子图像揭示了多种初级和次级代谢物的分布模式。其中，质荷比（m/z）为285.076的木犀草素在从顶部数第二层和第三层的黄色区域中离子计数较高，而在其他区域呈均匀分布。该分布模式与光学图像中观察到的斑驳纹路一致。
图1. LAESI系统的示意图（ES，电喷雾发射器尖端；OR，质谱仪采样锥孔；FL，聚焦透镜；FP，焦点；P，帕尔帖冷却台；HS，散热片）。在中红外消融过程中喷出的部分颗粒物（红色点）与电喷雾合并，形成含有样品分子和离子（绿色点）的带电液滴。这些液滴释放的离子由质谱仪进行分析和记录。
图 2. 激光烧蚀电喷雾电离质谱横向与三维成像的代表性结果。 （A）上图展示了大鼠（Rattus norvegicus）冠状脑切片的光学图像，以及针对缩醛磷脂 PC(O-33:3) 和/或 PE(O-36:3) 在 m/z 728.559 处获得的分子图像。白色比例尺代表 1 mm。经许可转载自（参考文献1）。版权所有 © 2010 美国化学会。 （B）下图展示了斑叶珊瑚花（Aphelandra squarrosa）叶片的三维成像结果。在自上而下的第二层和第三层的黄色区域中，检测到 m/z 285.076 的芹菜素离子信号更强，而在其他区域呈均匀分布。经许可转载自（参考文献3）。版权所有 © 2009 美国化学会。
讨论
不同类型的组织具有不同的含水量和抗张强度，这反过来可能影响样品的消融特性。9 在更换主要组织类型时，建议调整激光能量密度、样品处理方法以及分析方案，以减轻这些影响。
对于单细胞或更高分辨率的研究，可将中红外光耦合至一根尖端化的光纤，而非使用聚焦透镜。10 通过将光纤尖端置于组织中选定细胞的附近，即可在单细胞水平上进行LAESI分析。
作为一种用于常压电离质谱的无标记离子源11，LAESI 在组织中生化过程的研究方面展现出巨大潜力。凭借直接分析、横向及三维成像的附加优势，LAESI 正成为一种新兴的生物分析工具，适用于成分分析及成像应用。
致谢
作者感谢美国国家科学基金会（资助号：0719232）、美国能源部（DEFG02-01ER15129）以及Protea Biosciences公司（西弗吉尼亚州摩根敦）对本工作的资金支持。作者还感谢Jessica A. Stolee在本实验方案视频拍摄过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 质谱仪 | Waters | Q-TOF Premier | |
| 中红外激光器 | Opotek Inc. (Carlsbad, CA) | Vibrant IR |
参考文献
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重印与许可
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