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方法文章

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

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DOI：

10.3791/2102

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2010年8月14日

 ,  ,  , 
1Department of Brain and Cognitive Sciences, University of Rochester, 2Center for Visual Science, University of Rochester

本文内容

摘要

本方案涉及一种非放射性方法 原位 一种杂交实验流程，可在脊椎动物脑组织薄切片中以单细胞分辨率同时鉴定两种转录本。

摘要

此处我们描述了一种双荧光的改良版本in situ杂交（dFISH）方法，该方法已针对在新鲜冷冻脑切片中检测两种目标mRNA进行了优化。我们课题组已成功应用此技术研究基因的共调控。更具体而言，我们利用该dFISH方法在单细胞分辨率水平上探究了中枢感觉通路的解剖学组织、神经化学特性以及感觉经验的影响。该实验方案已在小鼠、大鼠和鸣禽的脑组织中得到验证，预期可轻松适用于其他脊椎动物物种以及多种非神经组织。在本视频中，我们将详细演示该实验流程的主要步骤。

方案

本方案基于标准的放射性与非放射性方法开发并不断优化 原位 杂交方法，此前由我们及其他研究者开发，用于检测脑组织中的一种或两种转录本物种 1-7以下所述方案的总时长为2至3天，具体取决于最终使用者选择的程序中断次数。除核糖探针杂交步骤及杂交后洗涤步骤外，所有步骤均在室温下进行。本方法所涉及各步骤所需的溶液与缓冲液详见本方案末尾。

1. 组织制备与切片

  1. 快速断头并取出受试者的大脑，将其放入大小合适的塑料模具中。
  2. 用Tissue-Tek包埋介质覆盖大脑，并迅速将塑料模具置于干冰/酒精浴中进行快速冷冻。冷冻组织可于-80°C保存至使用。
  3. 使用冷冻切片机，将2至3片脑组织切片收集到带电荷的Superfrost Plus载玻片上，切片厚度应为10–12 μm。载玻片可于-80°C保存至使用。

2. 探针纯化用Sephadex G50柱的制备

Sephadex 柱可以从商业渠道购买，但我们在此提供一种低成本的柱制备替代方法，该方法将用于探针的纯化。

  1. 用无RNase、经DEPC处理的水水合适量Sephadex G50粉末（例如，2 g粉末加入100 ml DEPC处理水中），短暂混匀后于室温下静置，使过量Sephadex G50沉淀。
  2. Sephadex G50沉淀后，移除上清液（上层水相）。
  3. 重复上述步骤3–5次。
  4. 最后一次洗涤后，将Sephadex G50沉淀用TE缓冲液重新悬浮（1:1比例），并于4°C保存至使用。
  5. 将已灭菌的玻璃棉放入无菌1 ml注射器中，用推杆压实，在底部形成致密层，然后将注射器放入15 ml Falcon管中。
  6. 充分混匀TE缓冲液中的Sephadex G50溶液，并将该溶液填充至注射器/层析柱中。
  7. 以1000 rpm离心层析柱30秒。
  8. 重复此操作，直至层析柱几乎完全被Sephadex G50珠填充。
  9. 向层析柱中加入200 μl柱洗涤缓冲液，以1000 rpm离心2分钟。弃去穿流液。
  10. 向层析柱中加入200 μl柱封闭缓冲液，以1000 rpm旋转2分钟。重复此步骤4–5次以平衡层析柱。若用Parafilm密封，层析柱可于4°C保存至使用。

3. 核糖探针的标记与纯化

以下详细说明单个核糖探针的制备与纯化过程。对于dFISH，每个探针的制备均采用相同的方法，区别仅在于其中一个探针使用地高辛（DIG）标记的UTP进行标记，而另一个探针则使用生物素标记的UTP进行标记。

  1. 准备高浓度（> 150 ng/μl）且纯化的线性化cDNA溶液，用于生成正义（对照）或反义核糖探针。
  2. 在1.5 ml离心管中加入0.5–1 μg纯化的cDNA模板、2 μl 5X探针标记缓冲液、1 μl 10X DIG（或生物素）标记混合物、0.5 μl RNasin和1 μl相应的RNA聚合酶，再用无RNase的（DEPC处理的）水将溶液终体积调至10 μl。
  3. 将溶液置于37°C水浴中孵育2小时。
  4. 向溶液中加入1 μl tRNA（储备液；20 μg/μl）和39 μl柱阻断缓冲液。
  5. 准备Sephadex G50柱用于探针纯化。为此，向柱中加入50 μl阻断缓冲液，并在1000 rpm下离心10秒。
    重复此步骤2–3次以平衡柱子（即，每次加入的50 μl缓冲液在离心后应全部回收）。
  6. 将探针溶液加至Sephadex G50柱上，在柱底部放置一个新的离心管，于1000 rpm离心3分钟，收集纯化的50 μl核糖探针溶液。
  7. 使用标准甲醛-琼脂糖RNA凝胶电泳或分光光度计评估标记核糖探针的质量和产量。

4. 固定后处理、乙酰化和杂交

  1. 从 -80°C 冰箱中取出切片，置于室温下平衡。随后将切片浸入冰冷的新鲜配制的 3% 多聚甲醛溶液中孵育 5 分钟。
  2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）短暂漂洗切片两次。
  3. 通过标准梯度酒精系列（70%、95% 和 100%；每步 2 分钟）对切片进行脱水，并使其自然风干。
  4. 将切片在乙酰化溶液中孵育 10 分钟。
  5. 用 2X SSPE 缓冲液漂洗切片 3 次。
  6. 再次使用上述标准梯度酒精系列对切片进行脱水，并使其自然风干。
  7. 配制适量的杂交溶液，并将两种核糖探针加入该溶液中（每种探针浓度为 1 ng/μl）。杂交溶液的总体积根据待杂交切片的数量确定（每张切片需 16 μl 杂交溶液）。
  8. 将适量杂交溶液加至组织切片上，盖上盖玻片，确保组织上无气泡产生。
  9. 将载玻片放入金属载片架中，将架浸入设定为 65°C 的石蜡油浴中过夜。确保盖玻片朝上（即载片架的侧面应与石蜡油容器底部接触）。

5. 杂交后洗涤

  1. 次日，小心地将载玻片架从石蜡油浴中取出，并用氯仿短暂冲洗以去除载玻片上的过量油渍。
  2. 将载玻片放入 2X SSPE 溶液中，5–10 分钟。盖玻片应在溶液中从载玻片上脱落。
  3. 将载玻片转移至新的 2X SSPE 溶液中，在室温下放置 1 小时。
  4. 将切片转移至含有 2X SSPE 加 50% 甲酰胺的溶液中。该溶液的温度应与前一晚杂交步骤所用温度一致。将载玻片在此溶液中保持 1.5 小时。
  5. 将切片转移至预热至与杂交步骤相同温度的 0.1X SSPE 溶液中。在该溶液中孵育 30 分钟。重复此步骤再进行一次，每次 30 分钟。

6. 核糖探针的检测与可视化

  1. 将载玻片转移至已添加0.3%过氧化氢的TNT缓冲液中，孵育10分钟。
  2. 用TNT缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤3次。
  3. 使用DAKO笔在含有脑切片的区域周围画出一个封闭圈。重要的是，必须注意避免切片干燥。
  4. 向每张载玻片上加入150 μl TNB缓冲液，并在湿盒中孵育30分钟。
  5. 通过倾斜载玻片去除多余的TNB溶液。
  6. 向每张载玻片上加入150 μl含辣根过氧化物酶标记的抗DIG抗体的TNB溶液，并在湿盒中孵育2小时。抗体浓度应在进行dFISH前针对每种目标转录本单独确定。
  7. 用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。
  8. 向每张载玻片上加入150 μl Alexa 594标记的酪胺工作液，并在湿盒中孵育1小时。该溶液应根据制造商说明进行配制。
  9. 用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。
  10. 将切片在已添加0.3%过氧化氢的TNT缓冲液中孵育10–30分钟。
  11. 用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。
  12. 每张载玻片加入150 μl TNB缓冲液，并在湿盒中孵育30分钟。
  13. 通过倾斜载玻片去除多余的TNB溶液。
  14. 向每张载玻片加入150 μl含辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体的TNB溶液，并在湿盒中孵育2小时。
  15. 用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。
  16. 向载玻片上加入150 μl Alexa 488标记的酪胺工作液，孵育1小时。该溶液应根据制造商推荐方法配制。
  17. 用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。
  18. 向切片上加入150 μl Hoechst溶液（以TNT缓冲液按1:1000稀释），并在湿盒中孵育2分钟。
  19. 用TNT缓冲液洗涤切片；每次5分钟，共3次。
  20. 用适合荧光成像的封片剂（如Vectashield或ProLong抗荧光淬灭封片剂）封片。

7. 典型结果

显示蛋白质表达模式的荧光显微镜图像；细胞中的绿色和红色标记。
图1. 本图展示了在斑胸草雀脑中获得的代表性双荧光原位杂交（dFISH）结果。图中所示为来自尾侧中线新纹状体（NCM）的显微照片，该区域是鸣禽类动物中相当于哺乳动物听觉皮层的脑区。脑切片分别与针对小清蛋白（parvalbumin，A）的生物素标记核糖探针（用于标记一类抑制性神经元亚群）以及针对活性依赖基因zenk（B）的DIG标记核糖探针（该基因是声音刺激诱导神经元活动的可靠标志物）进行杂交。C）A图与B图的叠加显示了一群由听觉经验激活的抑制性神经元。箭头和空心箭头分别指示仅被其中一种核糖探针标记的细胞，星号标示的是同时表达两种目标转录本的代表性神经元。比例尺 = 25 μm。

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讨论

我们已采用该方案研究脊椎动物大脑的神经化学和功能组织方式，并确定与行为相关的感觉刺激如何影响成年大脑中神经元的基因组机制8-10。我们已成功将该方法应用于小鼠、大鼠和鸣禽的脑组织，但预计该方案也可轻松适用于来自多种脊椎动物物种的脑切片，甚至可能适用于非神经组织。有关获得可靠结果和最佳信号所需的关键对照，我们课题组已在其他文献中进行了详细阐述11, 12。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作获得美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）和施密特基金会资助，资助对象为RP。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DEPCVWR 国际公司IC15090225有毒物质
PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
甲醛VWR国际BDH0506-4LP有毒物质
T3 RNA聚合酶罗氏集团11031163001
T7 RNA聚合酶罗氏集团10881767001
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）VWR国际IC816124
MgCl₂2 (1 M)Sigma-Aldrich449172
亚精胺（1 M）Sigma-AldrichS0266
DIG RNA标记混合物罗氏集团NC9380805
生物素RNA标记混合物罗氏集团NC9440104
RNasinPromega Corp.N2111
BSASigma-Aldrich05491
DTTSigma-AldrichD5545
Sephadex G50VWR 国际公司95016-772
EDTAVWR 国际公司101384-758
SDSSigma-AldrichL4390
转运 (t)RNAInvitrogen15401011
10X MOPSVWR 国际公司14221-398有毒物质
多聚甲醛VWR国际AAAL04737-36有毒物质
磷酸二氢钠Sigma-AldrichS3139
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS3264
NaOHVWR 国际公司SX0600-1
三乙醇胺VWR 国际公司IC15216391
乙酸酐VWR 国际公司MK242002有毒物质
亚急性硬化性全脑炎VWR 国际公司82021-488
甲酰胺VWR 国际公司JT4028-1有毒物质
Poly AInvitrogenPOLYA.GF
矿物油VWR 国际公司IC15169491
氯仿VWR 国际公司BDH1109有机溶剂
去离子甲酰胺Sigma-AldrichF9037有毒物质
过氧化氢VWR 国际公司VW36901有毒物质
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Triton X-100JT BakerX198-05
抗DIG-HRP罗氏集团11093274910
抗生物素过氧化物酶Vector LaboratoriesSP3010
TSA Alexa Fluor 594InvitrogenT20935
TSA Alexa Fluor 488InvitrogenT20932
H–chstVWR国际200025-538
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
包埋模具VWR 国际公司15160-157
冷冻切片机徕卡显微系统CM 1850
Superfrost plus 载玻片VWR 国际公司89033-052

溶液

    <李>柱洗涤缓冲液：10 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，0.05 mM EDTA，50 μ克/μl tRNA，50 ml DEPC 处理水中含 0.1% SDS<李>柱层析封闭缓冲液：10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，0.1 mM EDTA，溶于50 ml DEPC处理过的水中。<李>TNT缓冲液：将60 ml 1 M Tris-HCl、18 ml 5 M NaCl和1.8 ml Triton X-100加入600 ml经DEPC处理的水中。<李>TNB缓冲液：100 mM Tris-HCl，8.3 μ克/μl BSA，0.15 M NaCl 和 3% Triton X-100 溶于 DEPC 处理水。<李>TE缓冲液：10 mM Tris-HCl，pH 7.5，含1 mM EDTA，pH 7.5。<李>乙酰化溶液：2.7 ml 三乙醇胺与 0.5 ml 乙酸酐加入 200 ml DEPC 处理水中。<李>杂交溶液：50% 甲酰胺，2X SSPE，2 μ克/μl tRNA，1 μ克/μl BSA 和 1 μ克/μl 聚腺苷酸，溶于经DEPC处理的水中。每张切片需要16 μl。

参考文献

  1. Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
  2. Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
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  4. Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
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  8. Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
  9. Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
  10. Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
  11. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  12. Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).

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