小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

摘要

本文介绍了一种制备小鼠视网膜暗适应切片以进行电生理记录的实验方法。

摘要

我们的视觉体验始于视网膜感光细胞中的视觉色素吸收光子能量，并触发细胞内一系列级联反应，导致细胞膜上的环核苷酸门控通道关闭。由此引起的膜电位变化继而减少了视杆细胞和视锥细胞突触终末释放的神经递质数量。为了研究光诱导的感光细胞膜电位变化如何导致视网膜下游神经活动，数十年来科学家一直采用视网膜切片制备进行电生理记录^1,2。过去，这些切片是将附着于滤纸上的视网膜组织用剃刀手动切割而成；近年来发展出另一种切片方法，即将视网膜组织包埋于低凝胶温度的琼脂中，在低温溶液中使用振动切片机进行切片^3,4。该制备方法获得的视网膜切片表面损伤更小，且能产生非常强健的光诱导反应。本文中，我们记录了如何在红外光下进行该操作，以避免视觉色素的漂白。

方案

1. 制备电极

1. 将记录电极和参考电极均浸入1M NaCl溶液中，并使用1 Hz正弦波在两者之间施加15 V电压，持续约20秒，以制备电极。
2. 使用微电极拉制仪（Sutter Instruments P-97）制备记录电极。用于膜片钳的微电极采用外径1.2 mm、内径0.69 mm的硼硅酸盐玻璃管（Sutter Instruments，货号B120-69-10）。测量电极尖端的串联电阻。根据目标细胞的大小选择合适的电极尖端直径；对于直径约为20 μm的细胞体，选用电阻约为5 MΩ的电极；对于直径约为5 μm的细胞体，选用电阻约为12 MΩ的电极。
3. 制备接地/参考电极。使用注射器将少量聚乙烯管（Intramedic，PE205）填充含3.5%琼脂（Sigma；货号A7002）的1 mM NaCl溶液（琼脂溶于1M NaCl中）。将此琼脂桥置于Ag/AgCl参考电极上方。

2. 配制溶液

1. 外部灌流液，含碳酸氢盐的Ames培养基（1 L）：Ames培养基粉末1瓶（Sigma；货号 A1420），1.9 g NaHCO₃，7 mL 青霉素-链霉素溶液（Sigma；货号 P0781），以抑制细菌生长。调节渗透压至约 280 mOsm。
2. 切片液，含pH缓冲剂HEPES的Ames培养基（1 L）：Ames培养基粉末1瓶，0.887 g NaCl，....

讨论

数十年来，研究人员一直采用脊椎动物视网膜切片进行记录^1,2，并已成功加深了对视网膜神经回路如何编码入射光的理解。与直接使用剃刀刀片切割相比，使用振动切片机进行切片的优势在于可显著减少视网膜切片表面的损伤。通过负压移液管，可轻松去除受损组织，进而靶向切片表面下方仍保持视网膜神经回路连接的健康细胞——这些细胞类型大多已被鉴定^5,6，且对光刺激表现出强烈的反应。因此，对暗适应视网膜切片进行膜片钳记录，可使研究者明确已鉴定的细胞类别在神经计算中所发挥的作用。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微移液管拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
硼硅酸盐玻璃	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
聚乙烯导管	Intramedic	PE205
琼脂	Sigma-Aldrich	A7002
低凝胶温度琼脂糖	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ 培养基	Sigma-Aldrich	A1420
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781