小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

摘要

本文介绍了一种制备小鼠视网膜暗适应切片以进行电生理记录的实验方法。

摘要

我们的视觉体验始于视网膜感光细胞中的视觉色素吸收光子能量，并触发细胞内一系列级联反应，导致细胞膜上的环核苷酸门控通道关闭。由此引起的膜电位变化继而减少了视杆细胞和视锥细胞突触终末释放的神经递质数量。为了研究光诱导的感光细胞膜电位变化如何导致视网膜下游神经活动，数十年来科学家一直采用视网膜切片制备进行电生理记录^1,2。过去，这些切片是将附着于滤纸上的视网膜组织用剃刀手动切割而成；近年来发展出另一种切片方法，即将视网膜组织包埋于低凝胶温度的琼脂中，在低温溶液中使用振动切片机进行切片^3,4。该制备方法获得的视网膜切片表面损伤更小，且能产生非常强健的光诱导反应。本文中，我们记录了如何在红外光下进行该操作，以避免视觉色素的漂白。

方案

1. 制备电极

1. 将记录电极和参考电极均浸入1M NaCl溶液中，并使用1 Hz正弦波在两者之间施加15 V电压，持续约20秒，以制备电极。
2. 使用微电极拉制仪（Sutter Instruments P-97）制备记录电极。用于膜片钳的微电极采用外径1.2 mm、内径0.69 mm的硼硅酸盐玻璃管（Sutter Instruments，货号B120-69-10）。测量电极尖端的串联电阻。根据目标细胞的大小选择合适的电极尖端直径；对于直径约为20 μm的细胞体，选用电阻约为5 MΩ的电极；对于直径约为5 μm的细胞体，选用电阻约为12 MΩ的电极。
3. 制备接地/参考电极。使用注射器将少量聚乙烯管（Intramedic，PE205）填充含3.5%琼脂（Sigma；货号A7002）的1 mM NaCl溶液（琼脂溶于1M NaCl中）。将此琼脂桥置于Ag/AgCl参考电极上方。

2. 配制溶液

1. 外部灌流液，含碳酸氢盐的Ames培养基（1 L）：Ames培养基粉末1瓶（Sigma；货号 A1420），1.9 g NaHCO₃，7 mL 青霉素-链霉素溶液（Sigma；货号 P0781），以抑制细菌生长。调节渗透压至约 280 mOsm。
2. 切片液，含pH缓冲剂HEPES的Ames培养基（1 L）：Ames培养基粉末1瓶，0.887 g NaCl，2.38 g HEPES，7 mL 青霉素-链霉素溶液。使用1 M NaOH和/或1 M HCl调节pH至约7.4。调节渗透压至约280 mOsm。
3. 钾-天冬氨酸（K-Asp）电极内液（单位：mM）：125 K-Aspartate，10 KCl，10 HEPES，5 NMG-HEDTA，0.5 CaCl₂，1 ATP-Mg，0.2 GTP-Mg；用NMG-OH调节pH至约7.3，渗透压调节至约280 mOsm。
4. 用于稳定含视网膜的低凝胶温度琼脂糖的琼脂背衬（质量分数5%）：7.5 g 琼脂（Sigma；货号 A7002）溶于150 mL去离子水（dH₂O）中。

3. 实验当天

1. 从冰箱中取出约 1.5 mL 的 K-Asp 内液以及所选的荧光染料，解冻。将荧光染料稀释至适当浓度，该浓度应通过实验确定。
2. 将含 NaHCO₃ 的 Ames 培养基（约 200 mL）倒入避光储存容器中，放入水浴（30–32°C），并用 5% CO₂/95% O₂ 气体平衡。
3. 用含 HEPES 的 Ames 培养基填充瓶子至约 110 mL，置于冰上，并用 100% O₂ 气体平衡。
4. 将剩余的含 NaHCO₃ 的 Ames 培养基放入法拉第笼顶部的加热储液槽中，并用 5% CO₂/95% O₂ 气体平衡。可使用封口膜（Parafilm）封闭液面上方空间以保留气体。
5. 通过将 0.75 g 低凝胶温度琼脂糖（Sigma；货号 A0701）加入 25 mL 含 HEPES 的 Ames 培养基中，加热至约 115°C 以溶解琼脂糖，配制 3% 琼脂糖溶液。持续搅拌至溶液澄清无气泡，并保存于水浴（约 42°C）中。
6. 用 K-Asp 内液填充记录电极，检查尖端电阻。

4. 开始实验

1. 处死小鼠，并使用弯头剪刀迅速摘除眼球。所有操作步骤均应佩戴红外护目镜，以防止视觉色素被漂白。
2. 将眼球置于滤纸上以防止滚动，用镊子夹住眼球，使用细的双面刀片在角膜上切开一个小口。
3. 眼球一经穿刺，立即将其转移至盛有Ames培养基的培养皿中。
4. 以角膜上的切口为入口，使用小剪刀剪除剩余的角膜组织，随后移除晶状体和玻璃体。注意保持视网膜仍附着于眼杯上，并将眼杯置于经5% CO₂/95% O₂平衡的Ames培养基中，在32°C避光保存。

5. 切片

1. 将其中一个眼杯半切开，分离视网膜与视网膜色素上皮。去除视网膜边缘，使组织能够平铺。
2. 使用带有乳胶球的细玻璃巴斯德吸管，将融化的琼脂填充至35 mm培养皿中，并用镊子在琼脂表面拖动以测试其稠度。
3. 当开始观察到琼脂逐渐凝固时：
   1. 将视网膜转移至琼脂表面。
   2. 使用卷成细条的Kimwipe纸巾吸除视网膜周围的过量液体。
   3. 直接在视网膜上滴加2–3滴琼脂，并迅速将塑料圆筒置于视网膜上方，形成围挡结构。随后，在确保视网膜位于中心位置的同时，沿塑料圆筒壁缓慢滴加额外的熔融琼脂。
   4. 将培养皿转移至冰水浴中冷却。
4. 约45秒后，从冰水浴中取出组织，使用推杆从远离视网膜的一侧推动，将琼脂块从塑料圆筒中推出。
5. 使用单面剃须刀片切出包含视网膜的小块琼脂，并用瞬间胶将该琼脂块固定在样本盘的琼脂挡板上。
6. 将样本盘转移至振动切片机托盘中，并倒入冰冷的Ames HEPES溶液，确保含视网膜的琼脂块完全浸没。
7. 可在最大刀片振动频率下进行切片，前进速度设定为每片切割通过视网膜所需时间为4至5秒，从而获得厚度约为200 μm的视网膜切片。
8. 使用11号手术刀片逐个取出可用的切片。
9. 将含有视网膜的良好切片放入记录室中，并用带有尼龙线穿过的切片锚固定。尼龙线压住视网膜周围的琼脂，使视网膜区域保持暴露，便于记录。
10. 将记录室转移至直立显微镜载物台上，关闭遮光帘并打开红外光源，通过红外敏感相机观察切片。

6. 记录

1. 确定一个良好的视网膜切片（具有完整的感光细胞且切割角度合适）后，开始以超过 5 mL/min 的速度灌注视网膜，使用加热至 35–37°C 并用 5% CO₂/95% O₂ 平衡的 Ames 培养基。
2. 由于切片过程，表面可能出现一定程度的损伤。这一通常较薄的受损细胞层可通过使用尖端断裂的移液管轻轻吸除死亡的细胞体来去除。这通常会暴露出下方存活的细胞。选择一个位于目标层状结构中的健康细胞体。
3. 用 KAsp 内液填充玻璃微电极，并通过电极尖端施加正压（向外压力），然后使用显微操作器将电极尖端移入记录室并下降至细胞所在水平。
4. 移动电极尖端使其轻压细胞膜，施加轻微的负压（向内压力）以形成高阻封接。通过进一步施加负压使电极穿入细胞，从而进入全细胞记录模式。
5. 随后可使用发光二极管（LED）刺激视网膜组织，以诱发光反应。
6. 通过激发微电极内液中的荧光染料产生荧光，对记录所用的细胞进行拍照记录。

7. 代表性结果

图1. 此处显示的是暗适应视网膜神经元对强度递增的光脉冲刺激所诱发的光反应电位。

图 2. 来自视网膜切片的荧光图像，其中细胞已填充荧光染料 Lucifer Yellow。诱发的荧光显示了进行膜片钳记录的细胞形态。

讨论

数十年来，研究人员一直采用脊椎动物视网膜切片进行记录^1,2，并已成功加深了对视网膜神经回路如何编码入射光的理解。与直接使用剃刀刀片切割相比，使用振动切片机进行切片的优势在于可显著减少视网膜切片表面的损伤。通过负压移液管，可轻松去除受损组织，进而靶向切片表面下方仍保持视网膜神经回路连接的健康细胞——这些细胞类型大多已被鉴定^5,6，且对光刺激表现出强烈的反应。因此，对暗适应视网膜切片进行膜片钳记录，可使研究者明确已鉴定的细胞类别在神经计算中所发挥的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微移液管拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
硼硅酸盐玻璃	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
聚乙烯导管	Intramedic	PE205
琼脂	Sigma-Aldrich	A7002
低凝胶温度琼脂糖	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ 培养基	Sigma-Aldrich	A1420
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781