用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

摘要

从脱细胞组织制备可注射基质凝胶并将其注射入大鼠心肌的方法 体内 如上所述。

摘要

本方案提供了用于心肌组织工程的可注射细胞外基质（ECM）凝胶的制备方法。简言之，脱细胞组织经冷冻干燥、研磨、酶消化后，调节至生理pH值。冷冻干燥可完全去除组织中的水分，得到干燥的ECM，随后可用小型研磨机将其研磨成细粉。研磨后，ECM粉末经胃蛋白酶消化形成可注射基质。调节pH至7.4后，该液态基质材料即可注射入心肌组织。既往表征实验结果表明，由脱细胞心包和心肌组织制备的基质凝胶可保留天然ECM成分，包括多种蛋白质、多肽和糖胺聚糖。鉴于该材料在组织工程中的应用，in vivo表征尤为重要；本文提供了一种在小型动物模型中向左心室（LV）游离壁进行心肌内注射的方法，以分析宿主对基质凝胶的反应。通过膈肌入路进入胸腔，并在心尖稍上方的左心室游离壁进行注射。注射前可通过生物素标记该生物来源的支架材料，随后使用辣根过氧化物酶偶联的中性亲和素对组织切片染色，并通过二氨基联苯胺（DAB）显色进行观察。注射区域的分析也可通过组织学和免疫组织化学染色完成。通过上述方法，既往研究证实心包和心肌基质凝胶可在注射区域形成纤维状多孔网络，并促进血管生成。

方案

1. 组织预处理制备

1. 在使用本方案之前，必须已完成所选组织的脱细胞处理。本示例中，采用去离子水（DI 水）中的低渗和高渗冲洗结合十二烷基硫酸钠（SDS）对新鲜的猪和人的心包组织样本进行脱细胞处理。
2. 具体而言，首先将猪心包组织在去离子水中洗涤 30 分钟，然后在含 1% SDS 的磷酸盐缓冲液（PBS）中持续搅拌 24 小时，接着用去离子水冲洗 5 小时。对于人心包组织，首先在去离子水中冲洗 30 分钟，然后在含 1% SDS 的 PBS 中持续搅拌 60–65 小时，随后进行过夜的去离子水冲洗。将所有样本从最终溶液中取出，并在流动的去离子水中再次冲洗¹。
3. 为验证脱细胞效果，取一小块组织，用 O.C.T. 包埋剂新鲜冷冻，并在整个样本中每隔 100 μm 切取 10 μm 厚的组织切片，用于组织学分析，方法如先前报道^34–36。
4. 使用苏木精和伊红（H&E）染色法检查组织中细胞核的缺失情况。也可使用荧光染料 Hoechst 33342（1.0 μg/mL）对 DNA 进行染色以验证 H&E 染色结果；简要步骤为：固定切片，再水化并用水冲洗，染色 10 分钟，然后充分冲洗并在避光条件下保存。或者，可使用商品化试剂盒（如 Qiagen DNeasy 血液与组织试剂盒），该试剂盒可用于定量样本中的总 DNA 含量。

2. 可注射细胞外基质的制备

1. 冻干
   1. 经适当处理后，使用液氮或于 -80 ℃ 保存使脱细胞样品冷冻 °C. 将样品冻干至完全干燥。根据您的系统及样品的含水量，此过程可能需要12至72小时。
2. 研磨
   1. 完全干燥后，使用Wiley Mini Mill将干燥的ECM研磨成细粉。根据实验需求选择合适的筛网孔径；此处使用40目筛网。当大部分样品通过筛网后，取下收集罐，其中含有研磨后的ECM粉末。若样品量较少，可采用多种方式从研磨机中取出剩余样品；此处使用棉签清除滞留在研磨机固定刀片后的ECM。
   2. 务必确保研磨机清洁且无任何残留物。同时，必须确保研磨机和样品完全干燥；任何残留的水分都会导致细胞外基质（ECM）聚集结块，从而影响研磨效果。由于细胞外基质可能从空气中吸收水分，因此应将其从冻干机直接转移至研磨机进行操作。
3. 消化
   1. 为了制备注射用细胞外基质（ECM），需将粉末用胃蛋白酶消化。以下方案经Freyetes修改而来， 等 (2).
   2. 保持产品尽可能无菌至关重要，因为该产品将被注射使用 体内 污染可能导致并发症。因此，应使用无菌小瓶和称量勺，并在使用前对所有溶液进行过滤。研磨后、消化前进行冻干步骤也有助于维持无菌状态。
   3. 称取所需量的ECM粉末至合适的闪烁瓶中。对于总体积小于1 mL的样品，建议使用2 mL的闪烁瓶；对于较大体积，则使用20 mL的闪烁瓶。这可确保瓶底有足够的液体以实现有效搅拌。
   4. 称取所需量的胃蛋白酶至闪烁瓶中。加入0.1 M HCl，使胃蛋白酶浓度达到1 mg/mL。使用前确保胃蛋白酶完全溶解（无颗粒），可通过涡旋振荡溶液加速溶解。
   5. 将胃蛋白酶/HCl 溶液加入含有 ECM 粉末的闪烁瓶中，使 ECM 的浓度为 10 mg/mL。
   6. 持续搅拌溶液60至65小时，期间定期使用称量勺或刮刀刮下瓶壁上的物质。
4. pH 调节
   1. 此步骤旨在将液态基质材料调节至生理pH值，并使胃蛋白酶失活，防止其进一步降解细胞外基质。同样，务必使用经滤膜过滤的、以Millipore水配制的溶液。
   2. 加入1 M NaOH至原体积的1/10。此时检测pH值，并加入少量（2–10 μl) NaOH 或 HCl，直至达到目标 pH 值（7.4）。记录中和过程中加入或为测定 pH 值而取出的所有少量液体。溶液中和后，加入 10× PBS，使其终体积占总体积的 1/10（即当前体积的 1/9）。测定可注射 ECM 的浓度，然后加入 1× PBS，使其达到目标终浓度，此处为 6 mg/mL。
   3. 可通过SDS-PAGE、Blyscan糖胺聚糖比色法测定和质谱分析对可注射ECM进行表征。
   4. 此时，可将基质材料注入 体内 用于心肌组织工程的支架构建。
5. 生物素标记
   1. 可在注射前用生物素标记细胞外基质，以便于观察注射后的细胞外基质。
   2. 配制10 mM的生物素溶液，并按0.3 mg/mg的比例加入可注射的ECM中。ECM应调整至所需的注射浓度。若注射浓度为6 mg/mL，则加入40 μ每毫升 ECM 中含 L 生物素。注射前，将生物素-ECM 溶液置于冰上至少 1 小时。
6. 所有处理步骤均可在室温下进行。为防止可注射基质发生凝胶化，pH调节步骤可在冰上操作。

3. 心肌注射

1. 注射准备
   1. 对于本实验所用的雌性大鼠（225–250 g），在装有30号针头的0.1 mL注射器中配制75 μL pH 7.4的可注射细胞外基质（ECM）。若使用雄性大鼠（375–400 g），则可注射90 μL。
   2. 所有外科器械应在手术前进行灭菌；本实验使用已高压灭菌的外科器械包，其中包含所有必需工具。
2. 手术当天，使用5%异氟烷对Harlan Sprague-Dawley大鼠进行麻醉，通过耳镜进行气管插管，并在整个手术过程中以2.5%异氟烷维持麻醉状态。
3. 向动物眼部涂抹人工泪液软膏，以防止眼睛干燥和毛发刺激。术中通过皮下注射给予3 mL乳酸林格氏液以维持水化，注射部位为下腹部区域。
4. 将动物仰卧位固定于手术台上，轻轻用胶带固定四肢。使用电动剪毛器去除腹部毛发，并在消毒前用吸尘器清除散落的毛发。
5. 沿胸骨剑突至腹部右下侧的斜线，分次进行一系列小剂量注射（每次约50 μL）2%利多卡因。随后用聚维酮碘自中心向外环形擦拭三次，再以70%乙醇重复擦拭三次。使用带有预制圆形窗口的手术巾覆盖动物体表，必要时用巾钳固定。
6. 使用10号手术刀从剑突至腹部右下侧做3–4 cm长切口。定位剑突后，沿肌肉层向右垂直解剖，注意避开右侧的大血管。穿透肌肉层后，使用剪刀横向剪开肌肉，暴露膈肌，操作时注意避免损伤肝脏。
7. 取一段36英寸长的3-0 Vicryl缝线和一把止血钳，将缝针穿过剑突并拉至一半深度，将缝线两端粘合后固定于动物上方后侧位置，从而抬高剑突并充分暴露膈肌。另取一段36英寸长的3-0 Vicryl缝线，将缝针穿入靠近剑突的肌肉组织，同样拉出并将其两端固定于手术台右侧的支撑点，以完全暴露手术腔隙。
8. 此时应可通过膈肌观察到心脏。使用小型鼠齿显微镊夹住膈肌中央部位，轻轻向外牵拉，并用钝头剪刀做一小切口。必须使用非常钝的剪刀，以防刺破肺组织。完成穿孔后，肺组织会自然回缩，此时可沿垂直方向在膈肌上做2–3 cm切口，以充分暴露心脏。
9. 将一根3英寸棉签插入体腔左侧，推开肺组织，并用巾钳固定棉签位置。再用另一根棉签将右肺移开，以暴露心包膜。使用显微镊和大齿状镊撕开心包膜，暴露心脏心尖部。若动物此前已接受心肌梗死造模手术，则心包膜可能已缺失。
10. 用鼠齿显微镊夹住心脏心尖部，从心尖向上约三分之一处注入液态基质材料。进针方向应与心外膜表面平行，针尖斜面朝左进行注射，注意避开大心静脉。注射后停留数秒再拔出针头。注射部位应可见组织局部变白。
11. 清理体腔内血液，移除固定右肺的巾钳和棉签。使用弯头微血管钳和鼠齿显微镊开始缝合膈肌。先打一个结，随后使用齿状镊和微血管钳配合锥形针，以连续缝合法闭合膈肌。在完全闭合前，插入PE160吸引管，连接10 mL注射器，在收紧缝线的同时抽吸胸腔内空气。
12. 当胸腔充分排气并闭合后，膈肌应呈凹面状。若膈肌呈凸起状，则提示腔内仍有残留气体。
13. 此时可将异氟烷浓度下调至1%。
14. 取出用于牵开体腔的两根3-0 Vicryl缝线。用无菌水润湿肌肉组织，并用棉签或无菌纱布擦去多余液体。使用新的3-0缝线以间断缝合法闭合肌肉层。
15. 此时可关闭异氟烷麻醉。
16. 用无菌水清洁术区，使用皮肤钉合器闭合皮肤切口。若皮肤钉可能干扰后续实验，也可使用5-0普理灵（proline）缝线。此种情况下，应使用反向切割（RC）针以间断缝合法缝合皮肤。无论采用何种方式，均应在闭合切口表面局部涂抹外科粘合胶。
17. 使用棉签将三联抗生素软膏涂抹于切口部位。
18. 让动物在100%氧气环境中恢复。
19. 当动物开始自主呼吸并对抗呼吸机时，拔除气管插管。
20. 待动物恢复胸卧位后，皮下注射0.05 mg/kg盐酸布托啡诺，并将其放回饲养笼中，笼内铺设无菌毛巾。
21. 动物术后应接受持续观察与护理。
22. 在设定的时间点处死动物，取出心脏进行分析。取心脏短轴横切面，可进行苏木精-伊红（H&E）染色以进行大体组织学分析。在早期时间点，注射区域表现为粉红色、呈间质性扩散的纤维状网络。在后期时间点（2–3周后），可观察到细胞浸润及注射基质的逐步降解。若在注射前已用生物素标记ECM，则可通过辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素染色直接可视化生物素信号。免疫组织化学染色可用于识别注射区域内的特定细胞或结构；本实验中切片经双重染色处理：使用FITC标记的异凝集素（isolectin）特异性结合内皮细胞并发出绿色荧光，同时使用抗平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin）一抗与Alexa Fluor标记的二抗进行染色，以红色标记平滑肌细胞（SMCs）。

4. 代表性结果

先前对以该方法制备的基质材料进行的表征表明，多种大分子得以保留。具体而言，通过质谱分析鉴定出多种纤维状蛋白质和糖蛋白（表1）。如果按照本方案处理后的基质材料不再含有复杂的大分子组合，则可能是所采用的脱细胞方案过于剧烈。完全冻干后，干燥的心包ECM外观类似非常坚硬且皱缩的纸张。其他类型的组织则可能形似泡沫填充颗粒。若研磨充分，ECM应能通过筛网并收集于底部容器中。若样品中仍含有水分，ECM会结块并卡在研磨腔内。消化完成后，ECM溶液应呈乳白色，且完全无可见颗粒。其黏度也会略高于单独的HCl溶液。如果ECM消化不充分，离心管中仍会存在较大颗粒；或者ECM可能从溶液中析出沉淀。调节pH后，溶液无明显可见变化，ECM仍为浑浊的均一液体。若溶液开始凝胶化，其黏度将升高，导致难以甚至无法将材料吸入注射器。若出现此情况，应在冰上使用预冷的溶液进行pH调节步骤。制备好的注射液应置于冰上保存直至使用。若注射成功，针尖周围区域会变白，并可见一个小的团块。若未观察到该现象，则注射可能进入了心腔而非心壁。注射后缝合动物体腔时，仔细闭合膈肌是最关键的步骤。若操作正确，膈肌将紧贴肺部并呈凹面状。若肺内残留空气，膈肌将保持凸面，或出现局部膨出。在早期时间点（注射后30分钟至4小时）观察注射区域的组织学切片时，应可见一无细胞的粉红色纤维区域——即注射后重新组装的基质材料（图2）。该网络结构常在间质中扩散，可能出现在多个切片中。若仅观察到极小范围的基质凝胶，可能原因是部分注射未准确到达心肌壁目标位置，而是注入左心室腔内或从注射部位漏出。此外，间质扩散范围还可能因凝胶化时间的不同而有所差异。

图1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结果。（A）分子量标准。（B）大鼠尾部I型胶原（2.5 mg/mL）与溶解的人（C）和猪（D）心包ECM（7 mg/mL）的比较。注意心包基质样品中除胶原外，还存在多种其他蛋白质和多肽。

表1. 通过质谱鉴定的细胞外基质成分。

图2. 心肌注射： 体内 凝胶化。H&人（A）和猪（B）心包基质注射液凝胶化后的伊红染色 体内 45 分钟后。箭头指示基质位置，染色较心肌浅粉。比例尺为 500 μm

图3. 血管细胞浸润。注射后两周，人源（A-C）和猪源（D-F）基质凝胶中血管的荧光染色结果。内皮细胞呈绿色（A，D），平滑肌细胞呈红色（B，E）。C和F为合并图像。比例尺为100 μm。白色虚线表示基质注射区域，该区域由相邻切片的H&E分析确定。

图 4. 基质注射区域内的干细胞。Hoescht 染色显示细胞核（蓝色）和 c-kit（绿色），用于鉴定人（A）和猪（B）基质注射区域中的干细胞。比例尺为 50 μm。

讨论

该方法可用于制备源于生物材料的可注射支架，以用于心肌组织工程。尽管这些方法最初是为心肌基质凝胶的制备及in vivo测试而开发，并在此以心包基质凝胶为例进行展示，但本方案可适用于任何组织类型，前提是该组织能够被适当去细胞化。在应用这些方法之前，应完成去细胞化处理并加以验证，因为基质凝胶中残留的DNA可能引发不必要的免疫反应。去细胞化材料的方法有多种，该领域已有若干优秀的综述文献^{3, 4}。

制备基质凝胶时，必须确保样品完全冻干，因为任何残留的水分都会影响研磨。此外，为避免吸入细胞外基质（ECM）粉末，研磨时应始终佩戴口罩。最后需要注意的是，当基质凝胶用于体内（in vivo）研究时，应尽可能以无菌方式操作，以降低污染导致感染的风险。如果将本方案修改用于不同类型的组织，则需要优化某些参数。例如，可以调整ECM的浓度——某些组织需要较高浓度才能形成凝胶，而另一些组织可能在较低浓度下即可凝胶化。此外，若所用胃蛋白酶的活性强度有显著差异，则所需的消化时间和胃蛋白酶浓度也可能需要相应调整。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂：
胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	p6887-1G	冻干粉
生物素	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
中性亲和素-HRP	Thomas Scientific	21130
设备：
Wiley小型研磨机	Thomas Scientific	3383L10
Labconco冻干机	Labconco Corp.	7670520
手术用品：
聚维酮碘	Purdue Products L.P.	67618-154-16
乳酸林格氏液	MWI Veterinary Supply	003966
KY润滑胶	MWI Veterinary Supply	28658
利多卡因，2%	MWI Veterinary Supply	17767
盐酸丁丙诺啡	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
人工泪液软膏	Fisher Scientific	NC9860843
三重抗生素软膏	Fisher Scientific	19082795
异氟烷	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
耳镜	MWI Veterinary Supply	008699
三通阀	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicril缝线	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Proline缝线	MWI Veterinary Supply	s-1173
反向切割（RC）针	Ethicon Inc.	8684G
微型止血钳	Fine Science Tools	13013-14
鼠齿微型镊	Fine Science Tools	11084-07
10号手术刀	Fine Science Tools	10110-01
钝头剪刀	Fine Science Tools	14108-09
锐利弯头剪刀	Fine Science Tools	14085-08
大型锯齿镊	Fine Science Tools	1106-12
PE160吸引管	BD Biosciences	427430
电动剪毛器	MWI Veterinary Supply	21608
皮肤缝合钉/缝合器	Ethicon Inc.	PRR35
通用耗材：
磁力搅拌器
0.1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70%乙醇
0.1 mL注射器
10 mL注射器
棉签
手术粘合剂
手术单
巾钳
小型手持式真空泵