研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新共培养方法

摘要

在本方案中，我们描述了一种研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新方法 体外 共培养系统。将大鼠皮层胶质细胞培养至汇合后，与高度纯化的大鼠背根神经节神经元进行共培养。在同一培养体系中直接比较不同胶质细胞对神经元黏附和轴突生长的影响。该方法为直接研究胶质细胞异质性对神经元黏附和轴突生长的影响提供了新途径。

摘要

在所有哺乳动物的中枢神经系统中，损伤后断裂的轴突无法再生至其原始靶点，功能恢复非常有限¹。轴突再生失败是多种因素共同作用的结果，包括不利的胶质细胞环境、抑制性髓鞘相关分子以及神经元自身再生能力的下降²。星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的胶质细胞类型，在生理和病理条件下对轴突功能具有重要作用³。与同源的少突胶质细胞不同，星形胶质细胞是一类异质性细胞群体，由多种具有不同形态和基因表达特征的星形胶质细胞亚群组成⁴。这种异质性的功能意义，例如其对轴突生长的影响，目前仍 largely 未知。

为了研究胶质细胞，特别是星形胶质细胞异质性在神经元行为中的功能，我们建立了一种新方法，即将高度纯化的背根神经节神经元与来自大鼠皮层的胶质细胞进行共培养。通过该技术，我们能够在相同条件下直接比较不同星形胶质细胞亚群上神经元的黏附和轴突生长情况。

在本报告中，我们提供了星形胶质细胞分离与培养、背根神经节神经元的分离与纯化，以及背根神经节神经元与星形胶质细胞共培养的详细实验方案。该方法也可拓展至其他脑区，用于研究神经元与胶质细胞之间的细胞或区域特异性相互作用。

方案

1. 胶质细胞培养

可从中枢神经系统的不同区域培养胶质细胞。整个过程如流程图所示。

第1天 包被培养板和盖玻片

1. 将已灭菌的玻璃显微镜圆形盖玻片在高压灭菌器中干燥。
2. 将灭菌后的盖玻片放入已灭菌的24孔细胞培养板中。
3. 用多聚赖氨酸包被盖玻片，并在室温下孵育2小时。
4. 以与步骤3相同的方式包被6孔细胞培养板。
5. 用蒸馏水清洗盖玻片和6孔培养板各两次，并在生物安全柜中自然晾干。
6. 在24孔板的每孔中加入200 μL DMEM培养基（含10% FBS），在6孔板的每孔中加入2 mL，然后将培养板放入37°C、5% CO₂的培养箱中。

第2天 分离皮层及胶质细胞培养

1. 对正压流解剖罩进行灭菌。
2. 开启紫外灯照射 20 分钟。
3. 用70%乙醇喷洒所有表面，作用15分钟后使用。
4. 将新生大鼠（P2-P6）通过低温麻醉后，使用手术剪在枕骨大孔基底部处断头。
5. 使用虹膜剪沿矢状缝切开颅骨，并剥离颅骨。
6. 去除前脑并置于预冷的L15培养基中，在体视显微镜下仔细清除带有血管的硬脑膜和软脑膜，分离皮层，并用L15培养基反复洗涤数次。
7. 用显微手术剪将皮层切成小块。
8. 将用L15培养基配制的0.125%胰蛋白酶-EDTA加入皮质组织块中，37摄氏度孵育15分钟。
9. 将组织块转移至含有20% FBS的20 mL DMEM培养基中，置于50 mL离心管内，加入DNase储存液至终浓度为10 μg/mL，用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管反复吹打组织悬液20次，收集单细胞悬液。
10. 用DMEM培养基将细胞悬液洗涤一次，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM重悬细胞，在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，以每平方厘米5000–10000个细胞的密度接种细胞²在37°C、5% CO₂培养箱中培养细胞，每周更换两次培养基，每次更换一半。

2. 背根神经节神经元的分离、培养与纯化

第1天 准备培养材料

1. 将灭菌的盖玻片用多聚赖氨酸包被，用蒸馏水洗涤盖玻片两次，室温晾干后放入24孔板中。
2. 每孔加入100μL含2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）的Neurobasal培养基，将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中。

第2天 从胚胎中分离背根神经节（DRGs）

1. 按照胶质细胞培养的相同方法对超净工作台进行灭菌。
2. 通过过量 CO₂ 处死一只妊娠大鼠（E15），用 70% 乙醇消毒腹部，从子宫中分离胚胎并置于预冷的 L15 培养基中。
3. 在体视显微镜下分离带有连接的背根神经节的脊髓，并转移至含有预冷 L15 培养基的 35 mm 培养皿中。
4. 收集单细胞悬液，并用 NBF 培养基（含 2% B27 和 2.5S NGF（50 ng/mL）的 Neurobasal 培养基）洗涤一次。

第3天 纯化背根神经节神经元

1. 神经元接种后18-24小时，向神经元培养物中加入1 mM的FUDR储备液，使其终浓度为20 μM，终体积为200 μL。
2. 72小时后，更换一半培养基为含有2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）但不含FUDR的Neurobasal培养基。此后每隔一天更换一次培养基。

3. 将背根神经节神经元与胶质细胞共培养

1. 当胶质细胞培养达到汇合状态（接种后约20天），即可准备与神经元进行共培养。
2. 在加入纯化神经元前24小时，将胶质细胞的培养基更换为含有2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）的Neurobasal培养基。
3. 从培养孔中收集纯化的神经元，通过火焰抛光的巴斯德移液管进行机械吹打，获得单细胞悬液。
4. 计数后，将神经元以500/cm²的密度接种至汇合的胶质细胞层上，培养基为含有2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）的Neurobasal培养基。
5. 可通过图像分析软件及使用细胞类型特异性抗体的免疫细胞化学方法，在不同时间点记录并分析神经元在胶质细胞上的黏附情况及神经突的生长。

4. 代表性结果

1. 胶质细胞培养： 接种后，胶质细胞约20天达到融合状态。在相差显微镜下可清晰观察到不同形态的胶质细胞亚群形成不同的生长模式亚结构，免疫细胞化学技术显示GFAP阳性星形胶质细胞占比超过90%（图1，图2）。
2. 背根神经节（DRG）神经元培养： 在本方法中，经过72小时FUDR处理后，6天内DRG神经元纯度可达99%。DRG神经元表现出其独特的形态特征，并具有高密度的神经突生长（图3，图4）。
3. 胶质细胞与神经元共培养： DRG神经元接种后4小时内即可在胶质细胞层上迅速黏附并开始神经突延伸。仔细观察发现，神经元的黏附和神经突生长受到胶质细胞亚群所形成的特定生长模式亚结构的影响，该现象可通过相差显微镜及免疫细胞化学方法清晰识别（图5，图6）。

图1. 融合成片的胶质细胞形态学特征。 将皮层胶质细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，培养20天后观察到胶质细胞不同的生长模式，左侧细胞呈放射状排列。

图2. 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体标记的融合胶质细胞。 注意右侧GFAP（红色）阳性细胞呈放射状排列。

图3. 背根神经节神经元生长 体外 未经过FUDR处理。 污染细胞构成了背根神经节神经元的背景。

图4. 背根神经节神经元生长 体外 经FUDR处理后。 背景污染细胞已被完全清除。

图5. 在胶质细胞上培养的背根神经节神经元。 神经元的黏附和神经突生长在呈辐射状排列的细胞上受到抑制，仅在右侧胶质细胞上有所生长。

图6. 在胶质细胞上生长的背根神经节神经元（神经丝抗体标记）。 神经突（绿色）在呈辐射状排列的左侧胶质细胞上受到抑制，而在右侧胶质细胞上生长受限，所有胶质细胞均用GFAP抗体（红色）标记。

讨论

本实验方案旨在实现两个目标，以研究胶质细胞，特别是星形胶质细胞异质性对神经元黏附和神经突生长的影响。第一个目标是尽可能保持星形胶质细胞的异质性。在本实验中，汇合的富含星形胶质细胞的胶质细胞培养物为未经任何化学处理和消化传代的混合原代培养，以避免对细胞造成进一步损伤并诱导星形胶质细胞的损伤反应。最终星形胶质细胞纯度超过90% GFAP阳性，成纤维细胞污染少于1%，经成纤维细胞FN验证。初始接种密度较低，使细胞在达到汇合前经历多轮分裂。在相差显微镜下，可通过不同形态的星形胶质细胞形成的多种亚结构观察到胶质细胞的异质性。第二个目标是获得高纯度的背根神经节（DRG）神经元，并将其与胶质细胞共培养，以研究异质性对神经元行为的影响。背根神经节中存在的污染细胞（如成纤维细胞和施万细胞）在培养条件下会显著影响或改变轴突生长^{5, 6}。为避免这种非预期的影响，DRG神经元在无血清培养基中培养，并用氟脱氧尿苷（FUDR）处理72小时，以清除所有其他类型的细胞。经此处理后，DRG神经元纯度可达99%，比传统方法更为高效，后者需多次处理神经元培养物⁷。通过相差显微镜结合延时成像和图像分析方法，可方便地对单个DRG神经元...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM（高糖）	Invitrogen	10313-039
L15 培养基	Invitrogen	11415-114
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	10437-077
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103-049
多聚赖氨酸（poly-lysine）	Sigma-Aldrich	P4832	细胞培养级
神经生长因子（NGF, 2.5S）	Invitrogen	13257-019
B27 添加剂	Invitrogen	17504-044
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056
氟脱氧尿苷（FUDR）	Sigma-Aldrich	F0503
神经丝蛋白抗体（neurofilament antibody）	Abcam	ab24575