本方案描述了一种利用电子自旋共振显微技术对活细胞微环境中的氧气浓度进行微米级三维成像的方法。
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摘要
摘要
本方案描述了一种电子自旋共振（ESR）显微成像方法，可用于在微米级分辨率下对活细胞周围微环境中的氧浓度进行三维 Mapping1。氧是生命循环中最重要的分子之一，它在线粒体氧化磷酸化过程中作为末端电子受体，并参与活性氧物种的生成。对氧的测量在研究线粒体与代谢功能、信号通路、不同刺激的影响、膜通透性以及疾病鉴别等方面具有重要意义。因此，耗氧量是反映细胞代谢状态的一个重要指标，广泛适用于从线粒体到细胞乃至完整生物体的各类生物系统。由于其重要性，目前已发展出多种用于活体系统中氧检测的方法。当前实现高分辨率氧成像的尝试主要基于光学荧光和磷光技术，但这些方法所使用的探针往往具有较高的光毒性且对氧的敏感性较低，因而难以获得令人满意的结果。ESR 技术通过检测样品中外源性顺磁性探针产生的信号，被公认为能够非常准确地测定氧浓度。在典型情况下，ESR 测量的是探针谱线展宽和/或弛豫时间缩短现象，这些参数直接与局部氧浓度相关。（氧具有顺磁性，因此当其与外源性顺磁探针发生碰撞时，会缩短探针的弛豫时间。）传统上，此类实验采用的是低分辨率、毫米尺度的 ESR 技术，用于小型动物成像。本文展示了 ESR 成像也可在微米尺度下进行，以用于小型活体样本的检测。ESR 显微成像是一种相对较新的方法，可在室温下实现空间分辨的 ESR 信号采集，分辨率接近 1 微米2。本方案的主要目的是展示如何将这一新技术结合新开发的氧敏感探针，应用于小型活体样本中氧水平的 Mapping。实验中实现了约 30 × 30 × 100 μm 的空间分辨率，氧浓度检测灵敏度接近微摩尔级别，每体素的绝对氧检测灵敏度达到亚飞摩尔水平。利用 ESR 显微成像技术对细胞附近的氧分布进行 Mapping，可作为当前基于微电极或荧光/磷光技术的有力补充。此外，在选用合适的顺磁性探针条件下，该方法还可直接拓展至细胞内氧的显微成像，而这一点是其他方法难以实现的。
方案
1. 电子自旋共振显微成像概述
首先，我们简要介绍电子自旋共振（ESR）、ESR显微镜以及本系统的各个组成部分，然后将描述实际的成像实验。
电子自旋共振是一种光谱技术，其原理是在外加静态磁场中（图1），具有未配对电子自旋的分子会吸收特定频率的电磁辐射。电子自旋共振（ESR）广泛应用于化学、生物学、物理学和材料科学等多个科学领域，用于检测和鉴定自由基及顺磁中心。该技术是研究活体中顺磁性分子环境的有力方法，可提供关于酸度（pH）、黏度、氧气以及活性氧物种浓度的信息3。
对于非均相样品，可通过施加磁场梯度4，以空间分辨的方式（即通过成像）获取电子自旋共振（ESR）谱信息。该方法与更为常见的磁共振成像（MRI）技术类似，后者主要检测质子自旋。迄今为止，此类ESR成像技术主要用于尺寸相对较大（数厘米）、分辨率达到毫米级的活体样本。 （例如参见参考文献5中的图2）。ESR成像技术的一个较新进展是将其能力从毫米级分辨率下对小型动物的观测，拓展至对毫米级和亚毫米级样品在微米级分辨率下的测量。这一领域被称为ESR显微术，目前可提供分辨率接近1微米的三维ESR图像2（参见图3中的代表性示例）。
电子自旋共振（ESR）显微镜本质上与传统的ESR波谱仪相似。它包含用于产生静态磁场的磁体、用于自旋激发和信号检测的微波系统、用于固定样品的探头，以及用于控制数据采集过程和数据处理的计算机化控制台。此外，ESR成像通常所特有的、同时也存在于ESR显微镜中的其他组件包括磁场梯度源（属于电子系统的一部分）以及位于成像探头内的梯度线圈。有关我们特定系统的更多细节在实验方案视频中展示，并在参考文献2中进行了描述。
2. 电子自旋共振显微成像样品制备
本阶段介绍电子自旋共振（ESR）显微成像实验的样品制备方法。在此阶段结束时，细胞与三苯甲基自由基6缓冲溶液一同被置于特制的玻璃ESR显微镜样品容器底部。本方案以蓝细菌细胞的测量为例，对于其他类型的细胞，样品制备阶段可能需要进行相应的调整。
- 首先，取几块大小约为400的吸水纸 400 μm 取样后放入一个Eppendorf管中，随后加入1.2 mL蓝细菌悬液（浓度为40 mg/mL）。
- 将悬液在微型离心机中以6000 RPM转速离心2分钟。
- 随后，除保留约 ~ 外，完全移除上清液缓冲液50 μL 以避免蓝细菌脱水。经过此过程，吸水纸现已被蓝细菌细胞饱和。
- 使用精细镊子从纸张中提取少量纤维，并置于杯状特制玻璃样品台底部7随后，加入3 mM的三苯基在BG-11溶液中8, 9 （见方案1）使用细针注射器将样品加入样品 holder 中。然后使用紫外固化胶密封 holder，留出一个小的通气口。
储备液 4 储备液 3 储备液 2 储备液 1 H3BO3
2.86 克/升K2HPO4 :3H2O
4.0 g/升MgSO₄4 : 7H2O
7.5 克/升Na2Mg EDTA 0.1 g/升 MnCl2 4H2O
1.81 克/升柠檬酸铁铵 0.6 g/升 ZnSO4 : 7H2O
0.222 g/升柠檬酸：1H2O
0.6 克/升CuSO₄4 :5H2O
0.079 g/升CaCl2 2H2O
3.6 g/升COCl2 :6H2O
0.050 g/升NaMoO42H2O
0.391 g/升
图示 1. BG-11 培养基的制备
3. 电子自旋共振显微成像实验
- 开始成像实验时，打开ESR显微成像系统，并将样品插入位于成像探头内部的谐振器中。
- 现在，通过计算机控制软件将系统设置为“调谐”模式，并找到探头的共振微波频率，该频率将用于ESR测量。
- 随后，将静态磁场设定为与所用微波频率相匹配的数值，设定脉冲序列的时间参数，并观察ESR信号，以确保系统正常工作且样品制备良好。
- 然后，将成像参数（如像素数量、梯度强度以及梯度脉冲持续时间）设置为所需值。
- 完成设置后，采用Hahn回波成像脉冲序列（图4），在脉冲间隔分别为500、600和700 ns的条件下，采集三组三维ESR图像。
- 照射到样品上的光根据实验所需条件开启或关闭。
- 采集过程中，数据会自动保存。随后通过Matlab软件脚本对这些原始数据文件进行处理，获得三苯甲基自由基浓度图像以及弛豫时间T2图，并利用预先建立的校准曲线将其转换为氧浓度图像。
4. 代表性结果
实验结果为在不同 τ 值下记录的多个三维电子自旋共振（ESR）显微图像。典型的原始数据图像如图5所示。在暗条件下测得的上方三幅图像非常相似，仅信号强度有所降低。而在光照条件下，由于样品不同区域的弛豫时间不同，图像模式发生了变化。这些数据可经处理1，得到一幅幅度图像（如图6所示）以及弛豫时间 T2 的图像（图7）。通过预先建立的校准曲线，可将 T2 图像转换为氧浓度值，该校准曲线通过以下方程将氧浓度与弛豫时间关联起来：
其中，T20 是探针在无氧条件下自旋-自旋弛豫时间（取决于探针的浓度 C 及其扩散系数 D），k 为比例常数。在大多数情况下，活体样品的扩散系数变化不大（尽管如有需要，原则上也可通过电子自旋共振（ESR）直接测定6, 10），而自旋浓度可在成像过程中获得。因此，该关系可用于直接测量氧浓度。
回到图6，从振幅图像可以明显看出，蓝细菌细胞主要位于样品 holder 的右侧。此外，根据图7可知，光照会启动O2的产生，并导致溶液中O2浓度显著升高，主要发生在靠近蓝细菌的体素区域。
图 1：电子自旋共振中的能级。
图 2：荷瘤小鼠典型的氧浓度图像。左侧图像显示基于 MRI 的解剖结构信息。向小鼠注射一种稳定的有机自由基，其电子自旋共振（ESR）特性可提供该自由基所处环境中的氧浓度信息（右侧）。基于 ESR 的结果叠加于 MRI 解剖图像上。视野范围为 32 mm。
图3： 使用N@C60粉末（左）和LiPc顺磁性晶体（右）通过光刻法制备的样品所获得的两种高分辨率微米级ESR图像示例
图4： 典型的Hahn成像脉冲序列，显示微波（MW）以及梯度Gx、Gy和Gz的脉冲。
图5： 典型的原始ESR显微图像：a、b和c分别为无光照条件下测量的蓝藻样品在τ = 500、600、700 ns时的原始数据。d、e和f与a、b和c相同，但为光照条件下的测量结果。强度以任意单位标度表示（但在每组三个暗态或光态原始数据图像内部保持一致）
图 6： 对应溶液中自由基浓度的振幅图像（任意单位）。
图7： T2 图像及其在暗光（左）和亮光（右）条件下的相应[O2]值。
讨论
本方案展示了如何应用电子自旋共振（ESR）显微成像技术对活体小样本附近的氧浓度进行 Mapping。该方法的空间分辨率达到约 30 × 30 × 100 μm，氧浓度灵敏度接近微摩尔级别，每体素的绝对氧灵敏度达到亚飞摩尔水平。利用 ESR 显微成像对细胞附近的氧分布进行 Mapping，可作为目前基于微电极或荧光/磷光技术的补充手段。此外，通过选用合适的顺磁性探针，该方法可进一步拓展至细胞内氧的显微成像，而这一能力是其他方法难以实现的。在不久的将来，我们计划进一步优化该技术，以实现对活体样本在数微米分辨率下的成像，并提供诸如超氧浓度、酸度（pH）、探针扩散系数以及氧浓度等对比参数。这些功能在对比机制类型和样本特性（例如不透明的厚样本，以及某些情况下的细胞内与细胞外测量）方面，均与当前基于光学的方法形成互补。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到了以色列科学基金会资助项目（编号 213/09）、BSF 基金会资助项目（编号 2005258）、欧洲研究理事会（ERC）资助项目（编号 201665）以及以色列理工学院Russell Berrie纳米科技研究所的支持。我们感谢以色列理工学院Schulich化学学院的Noam Adir教授和Faris Salame在蓝细菌供应与操作方面提供的帮助。同时，我们非常感谢以色列理工学院微纳加工单元Svetlana Yoffis提供的协助与支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| 全氘代三芳基甲基（三苯甲基）自由基 | Novosibirsk | 由中国Novosibirsk机构按照参考文献 6 中所述方法合成。 | |
| BG-11 缓冲液 | 配制说明见方案 1 及参考文献 8、9。 | ||
| 注射器 | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| 紫外光固化胶 | Norland Products, Inc. | NOA63 或 NOA61。 |
参考文献
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- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
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