3rd 龄 Drosophila 幼虫制备中幼虫节段神经的可视化

摘要

Drosophila melanogaster 幼虫为研究幼虫体节神经中轴突运输的机制提供了一个理想的模型系统。通过该实验流程，可将携带各种突变的3^rd 龄幼虫与野生型幼虫进行比较。

摘要

Drosophila melanogaster 正成为研究神经系统发育与功能的有力模型系统，尤其得益于其便利的遗传操作性和已完成全基因组测序的优势。此外，幼虫神经系统是研究轴突运输机制的理想模型系统，因为幼虫的体节神经包含成束的轴突，其胞体位于脑内，而神经末梢则沿身体长度分布。本文描述了在幼虫体节神经中可视化突触囊泡蛋白的操作流程。若操作得当，神经系统的所有组分以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）均能保持完整、无损伤，并可用于后续观察。携带不同突变的3^rd 龄幼虫经解剖、固定、与突触囊泡抗体孵育后，与野生型幼虫一同进行观察和比较。该流程可适用于多种不同的突触或神经元抗体，便于在幼虫体节神经中直观观察多种蛋白分布的变化。

方案

1. 试剂的准备

1. 使用 128 mM NaCl、4 mM CaCl₂、4 mM MgCl₂、2 mM KCl、5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖配制 1× 解剖缓冲液。将溶液 pH 调至 7.2，并过滤除菌。
2. 用 16% 甲醛与 1× 解剖缓冲液按 1:1 比例稀释配制固定液。
3. 将 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）与 Triton X-100 按 1:100 比例混合，配制 1× PBT。
4. 在 1× PBS 中配制含 0.01% 叠氮化钠的 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液。

2. 解剖前的准备

1. 使用Sylgard培养皿进行解剖。通过将Sylgard 184硅弹性体基质与固化剂混合物倒入培养皿中来制备培养皿。待混合物完全固化并干燥后方可使用。
2. 解剖前，准备一把洁净的#5镊子、一把洁净的直刃Vannas剪刀以及固定用针。

3. 3的解剖^rd 龄期幼虫

1. 将特定基因型的游走期3^rd 龄幼虫收集到培养皿中。
2. 用去离子水清洗幼虫，去除食物残留。
3. 将一只幼虫背侧朝上放置于硅胶培养皿中，用大头针在幼虫的前端和后端固定。
4. 在固定好的幼虫上滴加一滴1×解剖缓冲液。使用精细剪刀在靠近后端的背侧中线处剪开幼虫体壁，然后沿背中线从前端至后端剪开幼虫表皮。
5. 在解剖后的幼虫上再滴加一滴新的1×解剖缓冲液。用大头针挑起幼虫中部附近的一侧表皮边缘并固定，再用另一根大头针固定另一侧表皮边缘，如图所示。每侧使用两根大头针。见下图。
6. 小心移除肠道、脂肪体和气管，仅保留带有两个视叶以及附着有节段神经的腹神经节的脑组织。后续操作均在硅胶培养皿中进行。

4. 解剖后幼虫的固定

1. 将解剖后的幼虫放入固定液中孵育30分钟，每15分钟更换一次固定液。
2. 固定完成后，用1×PBT缓冲液冲洗幼虫30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。需要注意的是，幼虫应始终置于缓冲液中。

5. 解剖后幼虫的抗体染色

1. 将一抗用含5% BSA和叠氮化钠的1× PBT缓冲液稀释至适当浓度，配制一抗溶液。不同抗体的最佳浓度可能有所不同。
2. 用配制好的一抗溶液替代最后一次的1× PBT清洗液，在4°C湿盒中孵育过夜。湿盒可通过在塑料皿内铺上浸湿的擦镜纸（kim-wipes）并加水制成。
3. 次日，用1× PBT缓冲液清洗解剖后的幼虫，共30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。
4. 将二抗用含5% BSA和叠氮化钠的1× PBT缓冲液稀释至适当浓度，配制成二抗溶液，并在25°C下孵育幼虫1小时。用铝箔包裹湿盒以避光，因为二抗对光敏感。
5. 孵育结束后，用1× PBT缓冲液清洗幼虫30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。

6. 解剖后幼虫的封片与观察

1. 在将幼虫放置到载玻片上之前，先在载玻片中央涂抹两条垂直的指甲油，两条之间留出足以容纳盖玻片的空间（见示意图）。待指甲油完全干燥。
2. 在载玻片上两条垂直指甲油之间的空隙处滴加一滴封片缓冲液（见示意图）。此时载玻片已准备好用于样品封片。
   
   
3. 完成最后一次1×PBT漂洗后，轻轻移除侧向大头针。注意不要撕裂角质层。
4. 小心移除剩余的两根大头针，用镊子夹起幼虫，并将其水平放置在已准备好的载玻片上。确保幼虫未被翻转，且腹面朝上。
5. 轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘（见示意图）。此时幼虫样品已准备好用于荧光显微镜观察。
   

7. 代表性结果

图1：利用抗突触囊泡蛋白cysteine string protein的抗体标记野生型幼虫的节段神经的代表性图像 （CSP，Zinsmaier 等1994）。注意节段神经染色均匀。标尺=20μm

图2：利用针对突触囊泡蛋白半胱氨酸串蛋白（CSP）的抗体标记的运动蛋白突变体幼虫的代表性幼虫节段神经图像。请注意，节段神经中出现大量强荧光染色的CSP聚集物（箭头所示）。

讨论

该 果蝇 幼虫节段神经是研究轴突运输机制的有力系统。如果3^rd 若正确进行幼虫龄期解剖，可在单个幼虫中观察中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）。本实验方案改编自Hurd和Saxton（1996）发表的方法。该方案亦可适用于其他神经元抗体的检测，但需对抗体条件进行优化。一抗和二抗的孵育时间可作调整，也可增加封闭步骤。我们已成功应用此方案研究淀粉样前体蛋白的功能 ¹ 和亨廷顿蛋白 ² 在轴突运输中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont #5 镊子	精细科学工具公司	11252-20
微型不锈钢固定针	精细科学工具公司	26002-10
Mcpherson-Vannas 直刃剪刀，8 cm	费舍尔科技公司	50822236
Vectashield 封片介质	Vector Laboratories 公司	H-1000
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	道康宁公司	4026148
甲醛，16%	电子显微镜科学公司	15710
dCSP3	发育研究杂交瘤库
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG	英杰公司	A-11004