Drosophila melanogaster 幼虫为研究幼虫体节神经中轴突运输的机制提供了一个理想的模型系统。通过该实验流程，可将携带各种突变的3rd 龄幼虫与野生型幼虫进行比较。
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摘要
摘要
Drosophila melanogaster 正成为研究神经系统发育与功能的有力模型系统，尤其得益于其便利的遗传操作性和已完成全基因组测序的优势。此外，幼虫神经系统是研究轴突运输机制的理想模型系统，因为幼虫的体节神经包含成束的轴突，其胞体位于脑内，而神经末梢则沿身体长度分布。本文描述了在幼虫体节神经中可视化突触囊泡蛋白的操作流程。若操作得当，神经系统的所有组分以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）均能保持完整、无损伤，并可用于后续观察。携带不同突变的3rd 龄幼虫经解剖、固定、与突触囊泡抗体孵育后，与野生型幼虫一同进行观察和比较。该流程可适用于多种不同的突触或神经元抗体，便于在幼虫体节神经中直观观察多种蛋白分布的变化。
方案
1. 试剂的准备
- 使用 128 mM NaCl、4 mM CaCl2、4 mM MgCl2、2 mM KCl、5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖配制 1× 解剖缓冲液。将溶液 pH 调至 7.2，并过滤除菌。
- 用 16% 甲醛与 1× 解剖缓冲液按 1:1 比例稀释配制固定液。
- 将 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）与 Triton X-100 按 1:100 比例混合，配制 1× PBT。
- 在 1× PBS 中配制含 0.01% 叠氮化钠的 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液。
2. 解剖前的准备
- 使用Sylgard培养皿进行解剖。通过将Sylgard 184硅弹性体基质与固化剂混合物倒入培养皿中来制备培养皿。待混合物完全固化并干燥后方可使用。
- 解剖前，准备一把洁净的#5镊子、一把洁净的直刃Vannas剪刀以及固定用针。
3. 3的解剖rd 龄期幼虫
- 收集游走的3rd 将特定基因型的龄期幼虫置于培养皿中。
- 用去离子水清洗幼虫以去除食物残渣。
- 将幼虫置于Sylgard培养皿中，腹面朝上，在幼虫的前端和后端分别用针固定。
- 在固定好的幼虫上滴加一滴1x解剖缓冲液。用精细剪刀在幼虫后端背侧中线处剪开一小口，然后沿背侧中线从后端向前端剪开幼虫体壁。
- 在已解剖的幼虫上滴加一滴新鲜的1x解剖缓冲液。用一枚解剖针夹住幼虫中部附近体壁的一侧边缘，并将体壁固定；用另一枚解剖针固定体壁的另一侧边缘，如图所示。每侧使用两枚解剖针。参见下图。
- 小心移除肠道、脂肪体和气管，仅保留带有两个视叶以及附着有节段神经的腹神经节的脑组织。后续操作均在硅胶培养皿中进行。
4. 解剖后幼虫的固定
- 将解剖后的幼虫放入固定液中，每15分钟更换一次固定液，共孵育30分钟。
- 固定后，用1× PBT缓冲液冲洗幼虫30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。需要注意的是，幼虫应始终置于缓冲液中。
5. 解剖后幼虫的抗体染色
- 用含叠氮化钠的5% BSA溶液将一抗稀释至适当浓度，溶剂为1× PBT。不同抗体的最佳浓度可能有所不同。
- 用配制好的一抗溶液替换最后一次的1× PBT清洗液，在4°C湿盒中避光孵育过夜。湿盒可通过在塑料培养皿内铺上浸湿的无尘纸（kim-wipes）来制备。
- 次日，用1× PBT对解剖后的幼虫进行30分钟清洗，每10分钟更换一次缓冲液。
- 用含叠氮化钠的5% BSA溶液将二抗稀释至适当浓度，溶剂为1× PBT，然后在25°C下用二抗溶液孵育幼虫1小时。将湿盒用铝箔包裹以避光，因为二抗对光敏感。
- 孵育结束后，用1× PBT对幼虫进行30分钟清洗，每10分钟更换一次缓冲液。
6. 解剖后幼虫的封片与观察
- 在将幼虫放置到载玻片上之前，先在载玻片中央涂抹两条垂直的指甲油线，中间留出足以放置盖玻片的空间（见示意图）。待指甲油完全干燥。
- 在载玻片上两条垂直指甲油线之间的空隙处滴加一滴封片缓冲液（见示意图）。此时载玻片已准备好用于样品放置。
- 完成最后一次1× PBT漂洗后，轻轻移除侧向固定针。注意不要撕裂角质层。
- 小心移除剩余的两根固定针，用镊子夹起幼虫，并将其水平放置在已准备好的载玻片上。确保幼虫未被翻转，腹面朝上。
- 轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘（见示意图）。此时幼虫样品已准备好用于荧光显微镜观察。
7. 代表性结果
图1：利用抗突触囊泡蛋白cysteine string protein的抗体标记的野生型幼虫节段神经的代表性图像 （CSP，Zinsmaier 等1994）。请注意，节段神经染色均匀平滑。比例尺=20μm
图 2：使用抗突触囊泡蛋白半胱氨酸串蛋白（CSP）抗体标记的运动蛋白突变体幼虫节段神经的代表性图像（CSP）。请注意，节段神经显示出大量强烈染色的CSP聚集物（箭头所示）。
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讨论
该 果蝇 幼虫节段神经是研究轴突运输机制的有力系统。如果3rd 若正确进行幼虫龄期解剖，可在单个幼虫中观察中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）。本实验方案改编自Hurd和Saxton（1996）发表的方法。该方案亦可适用于其他神经元抗体的检测，但需对抗体条件进行优化。一抗和二抗的孵育时间可作调整，也可增加封闭步骤。我们已成功应用此方案研究淀粉样前体蛋白的功能 1 和亨廷顿蛋白 2 在轴突运输中。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
SG 获得了纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具公司 | 11252-20 | |
| 微型不锈钢固定针 | 精细科学工具公司 | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas 直刃剪刀，8 cm | 费舍尔科技公司 | 50822236 | |
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories 公司 | H-1000 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体 | 道康宁公司 | 4026148 | |
| 甲醛，16% | 电子显微镜科学公司 | 15710 | |
| dCSP3 | 发育研究杂交瘤库 | ||
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG | 英杰公司 | A-11004 |
参考文献
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
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