基于短杆菌肽的荧光检测法；用于测定小分子改变脂双层性质的潜力

摘要

我们介绍一种基于荧光的快速检测方法，通过监测荧光淬灭速率来反映短杆菌肽通道的活性。短杆菌肽通道作为分子力传感器，用于监测跨膜蛋白所感知的脂双层特性的变化。

摘要

许多用于调节生物功能的药物及其他小分子是两亲性化合物，可在双分子层/溶液界面吸附，从而改变脂质双分子层的性质。这一点非常重要，因为膜蛋白通过疏水相互作用与其所在的脂双层在能量上相互耦合。因此，脂双层性质的改变会影响膜蛋白的功能，这为两亲性分子间接调节蛋白质功能提供了途径，也可能是药物“脱靶”效应的潜在机制。我们此前已开发出一种电生理检测方法，利用线性短杆菌肽（gramicidin）通道作为探针来检测脂质双分子层性质的变化^3,12。短杆菌肽通道是由两个非导电性亚基跨双分子层形成二聚体而构成的微型蛋白质。它们对膜环境的变化高度敏感，因此可作为强有力的探针，用于监测跨膜蛋白所感知的脂双层性质的改变。目前，我们展示了一种基于相同通道作为探针的荧光检测方法。该方法通过测量荧光探针标记的大单层囊泡（large unilamellar vesicles）在淬灭剂经由短杆菌肽通道进入后所发生的荧光淬灭动力学过程，来实现检测。我们采用8-氨基-1,3,6-萘三磺酸（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate, ANTS）与Tl⁺作为荧光指示剂/淬灭剂组合，该组合已在其他荧光淬灭实验中成功应用^5,13。Tl⁺穿过脂双层的速度较慢⁸，但可轻易通过导电态的短杆菌肽通道^1,14。该方法具有可扩展性，既适用于机制性研究，也适用于对小分子是否具有扰动脂双层及潜在“脱靶”效应的高通量筛选。我们发现，采用该方法所得结果与此前的电生理实验结果具有良好的一致性¹²。

方案

1. 制备含ANTS的脂质体

1. 第1天，从脂质中去除有机溶剂。
2. 将脂质从冷冻箱中取出，使其平衡至室温。
3. 向一个25 mL圆底烧瓶中加入0.6 mL氯仿溶液，其中含有浓度为25 mg/mL的1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱脂质。
4. 在氮气下持续旋转烧瓶进行干燥，直至所有氯仿完全蒸发，烧瓶下半部分形成一层均匀的白色脂质薄膜。
5. 在真空干燥器中干燥过夜。

1. 第2天，准备将要掺入囊泡中的荧光染料样品。
2. 用100 mM NaNO₃、25 mM ANTS（钠盐）、10 mM HEPES重悬样品。使用HNO₃或NaOH将pH调节至7.0。每个ANTS分子含有2个Na⁺，因此Na⁺总浓度为150 mM。加入1.671 mL电解质溶液，制成10 mM脂质悬浮液。
3. 用Parafilm封口后充分涡旋振荡悬浮液。
4. 用铝箔包裹样品以避光，并在室温下静置过夜。

1. 第3天，制备大单层囊泡，并去除囊泡外的所有荧光染料。
2. 在低功率超声仪中进行超声处理1分钟。
3. 将样品进行5–6次冻融循环，每次在干冰上放置5分钟，随后在约50 °C的温水中放置5分钟。
4. 使用Avanti小型挤出器挤出脂质悬浮液。将小型挤出器装配0.1 μm聚碳酸酯滤膜及滤膜支撑片（具体操作详见挤出器说明书）。将悬浮液来回挤出21次，使最终悬浮液位于相对的注射器中。当挤出多批次样品时，始终使用同一支注射器加样。在挤出过程中，初始浑浊的脂质悬浮液应逐渐变得近乎透明（由于ANTS荧光染料的存在，溶液仍呈黄色）。若挤出时突然变得轻松，推动所需压力减小，可能是滤膜破裂，需更换新滤膜。
5. 通过PD-10脱盐柱（采用重力法）去除囊泡外的ANTS。用20–30 mL Na缓冲液（140 mM NaNO₃，10 mM HEPES，pH 7.0，注意使用HNO₃或NaOH调节pH）平衡脱盐柱。将1.5 mL挤出后的脂质悬浮液加至柱上，待其完全渗入。再加入1 mL Na缓冲液，使样品总体积达到2.5 mL。待缓冲液完全进入柱体且无液体滴出后，用3 mL Na缓冲液洗脱脂质体，并收集洗脱液。所得的ANTS标记大单层囊泡（LUV）储备液脂质浓度约为4–5 mM，呈半透明乳白色。用铝箔包裹样品以避光保存。
6. 若储备液不立即使用，可在13 °C下保存，最长不超过7天。警告：切勿将脂质溶液冷冻或冷却至其液相–晶相转变温度（约12 °C）以下，否则会破坏囊泡完整性，导致荧光染料泄漏。

2. 配制荧光溶液

1. 使用前24小时，将脂质体稀释并与短杆菌肽（gramicidin）孵育（13 °C）。短杆菌肽在脂质体内外单层膜之间的平衡过程较慢，需要长时间孵育。
2. 充分涡旋混合ANTS包载的大单层脂质体（LUV）储备液，因为LUV的密度>1 g/mL，易在溶液中发生沉降。
3. 将ANTS包载的LUV储备液按1:20比例加入Na缓冲液中。将同一天实验所用的所有脂质体在同一个烧瓶中混合，以提高样品的均一性。
4. 取出3/4的脂质体，加入预先用DMSO稀释的260 nM短杆菌肽（500 μg/mL）。
5. 向剩余的1/4脂质体中加入等体积的DMSO（不含短杆菌肽），以保持所有样品中溶剂浓度一致。

3. 设置荧光仪器

1. 我们使用带有温度控制的 Applied Photophysics SX.20 停流光谱荧光仪来测量荧光猝灭速率。
2. 提前一小时开启仪器，使其充分预热。组件包括：计算机、电子控制单元、水浴装置（制冷和加热）、光源电源和氮气罐。
3. 使用 Pro-Data SX 软件设置记录条件。
4. 将单色器激发波长设为 352 nm，激发光狭缝宽度设为 1/1。
5. 使用 λ=455 nm 高通滤光片记录发射光。
6. 使用“压力保持”（Pressure Hold）设置，使仪器在记录过程中维持氮气压力，从而防止最初几毫秒内出现压力振荡（及记录伪影）。
7. 将“时间”设为 1 秒，“数据点数”设为 5000。
8. 使用重复框并调整重复次数，通常缓冲液运行设为 9 次，猝灭剂运行设为 13 次。
9. 水浴温度应设为 25°C；温度需在 SX 软件中进行监测。
10. 将驱动体积设为 120 μL，即每次仪器运行样品时，从两个注射器中各混合 60 μL。在此仪器设置下，120 μL 体积对应的死时间约为 1.2 ms。
11. 调节荧光检测器的高压（增益），使 ANTS-脂质体的输出信号约为 8。对于标准实验混合物，增益应为 400–420 V。某些药物具有荧光，可能导致荧光信号饱和；在此情况下，应降低增益/电压。
12. 始终将荧光样品装入左侧注射器，缓冲液/猝灭剂装入右侧注射器。装样前务必充分涡旋含有脂质体的所有样品，并注意大单层脂质体（LUVs）会随时间在注射器中沉降。

4. 进行实验

1. 准备含有 ANTS 的大单层囊泡（LUVs）样品，分别加入溶剂或待测化合物，并将样品与 Na-缓冲液或 Tl-淬灭剂（50 mM TlNO₃、94 mM NaNO₃、10 mM HEPES，pH 7.0）一同装入荧光分光光度计中。
2. 使用前一天制备的 1.5 mL 稀释 ANTS-LUV 溶液，可含或不含短杆菌肽（gramicidin）。
3. 向样品中加入目标浓度的化合物或对照用溶剂。所有样品中的溶剂浓度应保持最低且恒定。对于任何新的（未知）化合物，需调整其浓度以获得理想的剂量-反应范围。在 25°C 避光条件下孵育 10 分钟。
4. 将 LUV 样品涡旋混匀后装入左侧注射器，将 Na-缓冲液或 Tl-淬灭剂装入右侧注射器。
5. 通过前后推动注射器彻底排除两种样品中的气泡。
6. 关闭阀门前确保两个注射器装载体积相等。装载不均会导致溶液在进入记录室之前发生预混合。
7. 对于第一个样品，先用 Na-缓冲液记录荧光信号，重复 4 次，根据需要调节高压（增益），然后重复记录 5 次。
8. 对于其余样品，使用 Na-缓冲液重复记录 9 次。
9. 将 Na-缓冲液更换为 Tl-淬灭剂，重复记录 13 次。
10. 用水冲洗系统后继续下一个样品。作为对照，我们使用以下样品：不含短杆菌肽且含溶剂、不含短杆菌肽但含最高浓度化合物、同时含有短杆菌肽和溶剂的样品。

5. 数据分析

1. 将结果转移至分析计算机。将所有数据读入 MATLAB 进行分析。对于每个样品，读取所有缓冲液和淬灭剂重复数据，但需排除每组的前四次数据，因其包含混合伪影。假设驱动体积为 120 μL，则需要略少于四次进样即可完全清除停流管路中先前的混合物。
2. 所有样品的缓冲液重复数据应非常相似。若荧光信号出现显著偏移（该信号依赖于化合物浓度），则该化合物本身可能具有荧光性，此时可能需要在归一化样品前先减去这一额外的荧光信号。
3. 手动检查各条曲线，剔除“异常”重复数据：即因混合伪影和/或气泡导致出现尖峰或偏离多指数衰减行为的重复数据。
4. 将每个样品的淬灭剂重复数据归一化至其对应缓冲液重复数据的平均起始值。将所有样品的平均值合并绘制于同一图中以便可视化。
5. 未添加短杆菌肽（gramicidin）的样品曲线应均相似，且几乎不显示荧光淬灭；可能会因 Tl⁺ 缓慢透过囊泡双分子层而出现荧光信号缓慢下降8。若未添加短杆菌肽且无修饰剂的样品表现出显著淬灭，则表明囊泡已降解，不应继续使用。若未添加短杆菌肽但含有修饰剂的样品表现出显著淬灭，则表明该修饰剂严重扰动了囊泡双分子层，致使荧光探针或淬灭剂得以穿越双分子层。
6. 若该化合物改变了由短杆菌肽通道感知的脂双层性质，则荧光时间进程曲线将明显改变。
7. 对于每个样品，采用拉伸指数函数 （例如⁴），拟合归一化后单个重复数据的荧光淬灭曲线前 2–100 ms 的数据，并计算 2 ms 时的速率 ⁴。对给定样品的所有单个重复数据计算其平均值和标准偏差。
8. 最后，通过归一化至时间上最近的、含短杆菌肽但无修饰剂的对照样品，确定淬灭速率的相对变化。

6. 代表性结果

图1：基于荧光淬灭的检测方法用于分析脂双层性质变化的核心原理。 左上方：单个脂质囊泡的放大图，其内部含有 ANTS 和 NaNO₃，外部为 NaNO₃ 和 TlNO₃。右上方：使用（从上到下）不含淬灭剂的 ANTS 填充囊泡、含淬灭剂的囊泡，以及预先掺入 87、260 和 780 nM 短杆菌肽的含淬灭剂囊泡所记录的荧光信号。下方：停流混合室的示意图。

图2：Pro-Data SX 软件的截图，展示了实验设置描述中提到的各个面板。

图3：使用Na缓冲液的ANTS负载LUVs荧光信号的多次重复测定。 前四次重复测量始终被排除，因其包含混合干扰。连接样品注射器与混合池的管路具有固定体积，因此前几次重复测量反映的是管路中先前残留的物质：第1次和第2次为水，第3次为水与样品的混合物，第4次主要为样品，从第5次开始及后续重复测量则仅为样品。

图4：含ANTS的LUVs在Na缓冲液和Tl淬灭剂条件下荧光信号的多次重复测定结果。 两种条件下的前四次重复数据已被剔除。此外，Tl淬灭剂的测量中第8次重复因存在干扰（最可能是气泡所致）也需剔除。

图5：辣椒素（Cap）对 ANTS 荧光淬灭过程时间进程的影响。 （A）1秒内的归一化荧光信号，灰色圆点表示所有重复实验的结果（每种条件下 n > 5）；红线表示所有重复的平均值。（B）前100毫秒，灰色圆点表示每种条件下单次重复的结果；红线为对这些重复数据进行的拉伸指数拟合（2–100毫秒）。蓝色虚线表示2毫秒时间点，即确定淬灭速率的时间点。在A和B中，最上方的曲线表示无 Tl⁺ 条件下的结果；接下来两条曲线表示无 gA 存在时，含 Tl⁺ ± Cap 的结果；下方四条曲线表示含 260 nM gA 和 Tl⁺ 的结果，其中数字表示 Cap 的浓度（单位为 μM）。通过拉伸指数拟合确定的 0、10、30 和 90 μM Cap 条件下的淬灭速率分别为 36±6、69±6、85±8 和 247±27（均值 ± 标准差，n > 8）。

讨论

我们已展示了一种基于荧光的快速检测方法，用于测定药物及其他小分子两亲性化合物对脂双层的调节潜力。能够改变脂双层性质的化合物可能会以间接且非特异性的方式影响膜蛋白功能，这可能与药物的“脱靶”效应有关。该检测方法利用短杆菌肽通道（gramicidin channels）作为探针，检测跨膜蛋白所感知的脂双层性质变化¹²。基于荧光的检测结果与单通道gA实验结果高度一致¹²，表明该方法既可用于机制研究，也可用于化合物库的筛选。采用当前的检测配置，我们每天可测试数十种化合物，通量比单通道方法高出一到两个数量级。基于荧光的检测方法不存在根本性的速率限制步骤，意味着其可进一步扩展为真正的高通量模式。可以调整检测所用的电解质溶液，和/或使用不同脂质组成的LUVs。需要注意的是，某些脂质组成在干燥过程中可能发生相分离，此时需采用快速溶剂交换系统，而非传统的干燥-水化步骤⁷。

目前尚不清楚药物先导物的脂溶性增加与药物研发过程中的淘汰率上升之间是否存在因果关系^10,11,17，如果存在，其潜在的机制是什么？然而，由于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ANTS	Invitrogen	A-350
短杆菌肽	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
微型挤出器试剂盒	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 脱盐柱	Sigma-Aldrich	54805