鸡胚中的单细胞转染

摘要

使用细尖微量移液器，我们将质粒DNA注射到鸡胚体节或神经管的亚区域中。通过调整质粒浓度以获得单个转染细胞。随后，我们让这些细胞发育形成克隆群体。

摘要

发育生物学的一个核心主题是细胞谱系的多样化及其潜在分子机制的阐明。这需要对单个细胞在正常和实验条件下的命运进行深入分析。为此，靶向单个前体细胞的转染方法是先决条件。本文介绍一种技术上简便的方法，可在鸡胚体内（in-ovo）对组织中的单个细胞进行转染，从而实现可靠的谱系示踪以及基因操作。该方法可特异性靶向体节或神经管内的特定组织区域，并将DNA直接注射到目标上皮组织中，从而实现单个细胞的随机转染。通过使用报告基因，可对克隆细胞群体进行长达三天的追踪，并可将经基因操作的克隆群体行为与对照组进行比较。该方法充分利用了鸡胚易于操作的特点，以及新兴的基因操作工具。我们比较并讨论了该方法相较于广泛使用的电穿孔技术的优势，同时提出了其可能的应用前景及在其他体内（in-vivo）模型中的适用性。我们主张将该方法作为现有谱系示踪和基因干扰工具的重要补充和扩展。

方案

1. 微量移液器的制备

我们使用标准的Narishige pp-83拉针仪来制备玻璃微电极，加热设定值为13.5。该参数需精确校准，以获得直径在8至10微米之间的电极尖端。我们采用含丝的硼硅酸盐玻璃管，其外径为1.0 mm，内径为0.75–0.78 mm。制备后的微电极应存放于塑料培养皿中，并确保电极尖端避免接触培养皿边缘，以保护其不受损伤。

2. DNA 制备

将目标质粒通过标准方法转染至DH5α E. coli中。使用单克隆过夜培养物，采用大提试剂盒（任何商业试剂盒均可）纯化质粒。对于非克隆注射，我们使用的质粒浓度为1.0 μg/μL。浓度过高会增加移液枪头堵塞的风险。对于克隆实验，质粒浓度需显著降低，并应进行相应调整（见下文）。对于pCAGG-GFP，获得克隆结果的最佳浓度约为0.05–0.1 μg/μL。每次实验通常使用1至2 μL质粒，并在实验开始前向质粒中加入极少量快绿染料粉末（附着于干燥、尖锐玻璃移液管尖端即可）。随后将质粒在台式离心机中以最大速度离心2分钟。该步骤似乎可减少移液管头堵塞的问题。

3. 胚胎注射

3.1 胚胎的制备

我们使用鹌鹑蛋和鸡蛋进行注射。将鸡蛋平放在长....

讨论

上述方法是对先前描述的技术的一种改进，用于将脂溶性染料递送至少量细胞亚群或单个前体细胞 ³与标准的电穿孔技术相比，它具有三个主要优势。第一，它能够可靠地标记目标组织中的特定部位，从而实现比电穿孔更高的空间分辨率（例如见图1B、C）。第二，它可实现单个细胞的标记，进而能够追踪其谱系 体内 在其他条件正常的情况下 ^{1 2} （图1C，D）。第三，在单细胞水平上进行基因的异常表达为研究谱系分离的分子机制、探究生长因子或其他基因在正常背景下对细胞行为的作用等提供了工具。因此，该方法是对广泛应用的电穿孔技术的补充，并进一步利用了禽类胚胎在时空上调控基因功能获得与缺失的可操作性。 体内.

一个日益重要的应用是利用新兴的活体成像技术，在单细胞水平上分析细胞行为（如细胞迁移、轴突导向、细胞分裂等）^{4 5 6 7}。在某些实验条件下，使用快速激活的报告分子（例如 Venus-GFP）⁸ 可能更为理想，以便更早地观察被注射的细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
移液管	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
毛细管	Drummond Scientific	2-000-100
昆虫针	Watkins Doncaster	E6871
青霉素-链霉素溶液	Biological Industries	03-031-1B