单细胞转染鸡胚

摘要

使用精尖微量注入鸡体节或神经管的子域的质粒DNA。质粒的浓度调整，以产生单一的转染细胞。然后，我们允许的细胞发育成无性系种群。

摘要

发育生物学的一个中心主题是多样化的谱系和澄清的分子机制。这需要一个正常和实验条件下的单细胞的命运的透彻分析。为此，目标单祖细胞的转染方法，是一个先决条件。我们在这里介绍一个简单的方法转染在OVO鸡组织中单个细胞，让可靠的谱系跟踪以及遗传操作技术。体节或神经管内，是针对特定的组织域的DNA直接注入利益的上皮细胞，导致零星的单细胞转染。记者，无性系种群可能因此被追踪长达三天，并与对照相比，无性系种群的基因操纵行为可以。此方法利用鸡胚无障碍的优势，以及与新兴的基因操纵的工具。我们比较，并讨论其优点被广泛使用的电击方法，以及可能的应用，还建议使用额外的体内模型。我们提倡使用这种方法的重要补充和补充现有的谱系追踪和基因干扰工具。

方案

1。准备的微量移液器

我们Narishige PP - 83标准的吸管拉马拉我们的吸液管与热定型为13.5。精确的设置必须校准，目的是在枪头直径8至10微米。我们使用长丝含有硼硅玻璃管，外径1.0毫米，内径0.75-0.78毫米。移液器因此存储在一个塑料菜与菜的边缘接触保护提示。

2。 DNA的制备

利益的质粒转染到大肠杆菌DH5α中使用标准程序的大肠杆菌。从单菌落过夜培养用于纯化质粒最大制备试剂盒（应该做的任何商业套件）。我们使用质粒浓度为1.0微克/μL非克隆注射。高浓度的增加枪头堵塞。对于克隆的应用，质粒浓度要低得多，必须进行调整（见下文）。对于pCAGG - GFP，生产克隆成果的最佳浓度被发现约0.05-0.1微克/μL。 1 - 2μL的质粒通常用于每个实验，在实验开始前，添加少量的快速绿色粉末（坚持干尖，锋利的玻璃吸管）质粒。质粒是在台式离心机最大速度为2分钟离心。这个过程似乎减少吸管堵塞问题。

3。注射胚胎

3.1胚胎的制备

我们使用注射鹌鹑，以及鸡蛋。卵孵化躺在其长轴上，直到所需的发育阶段。鸡蛋是用70％乙醇擦洗，并让其干燥。鸡蛋指出到底是刺穿手术剪（这是必要的，只....

讨论

上面介绍的方法是修改为先前所描述的技术，提供亲脂性染料的小细胞亚^群或3个单祖。它有三个以上的标准电技术的主要优势。首先，它提供了一个标签在靶组织中的信心离散网站的手段，让远远大于电空间分辨率（例如图1B，C）。其次，它允许单一细胞的标签，从而使跟踪的血统^，另有 1 2（图1C，D） ​​的正常条件下在体内。三，基因表达怀念在单细胞水平宗族隔离，调查研究在其他正常的背景下的生长因子或细胞行为上的其他基因的作用的分子机制提供了一个工具等，因此，这种方法的补充广泛应用于电技术，并进一步利用的空间-时间调节增益和体内基因功能丧失的禽流胚胎的机会。

一个日益相关的应用程序是使用新兴的^{实时成像技术4} 5 6 7在单细胞水平（细胞的迁移，轴突的指导下，细胞分裂等）的细胞行为的分析。在这些实验的一些设置，它可能是最好使用一个快速激活记者物种（如金星^GFP）8，以允许可视化注入细胞的早期。

由于这里描述的方法简单，很可能，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
移液管	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
毛细管	Drummond Scientific	2-000-100
昆虫针	Watkins Doncaster	E6871
青霉素-链霉素溶液	Biological Industries	03-031-1B