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RNAi 筛选参与痘苗病毒（Vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（Drosophila）细胞

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DOI：

10.3791/2137

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2010年8月25日

 ,  , 
1Department of Microbiology, Penn Genome Frontiers Institute, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

通过基于细胞的全基因组功能缺失RNA干扰筛选，可以鉴定出参与病毒感染的新型宿主因子。Drosophila 细胞培养模型特别适用于该方法，因为其RNA干扰操作简便且效率高。本文以痘苗病毒（vaccinia virus）为例，展示该技术的具体应用。

摘要

病毒病原体对公共卫生构成重大威胁；病毒不仅可引发人类疾病的自然流行，还可能被用于生物恐怖主义，令人担忧。深入理解影响病毒感染的细胞因子将有助于开发亟需的治疗手段。近年来，RNA干扰（RNAi）技术的进步，结合多种生物体的全基因组测序，推动了全基因组范围、基于细胞的功能缺失筛选技术的优化。Drosophila细胞因其在该系统中RNAi操作简便且效率高，特别适用于基因组尺度的筛选1。重要的是，多种病毒均可感染Drosophila细胞，其中包括若干具有医学和农业重要性的哺乳动物病毒2,3,4。以往在Drosophila中开展的RNAi筛选已鉴定出在病毒感染多个步骤（如病毒进入、翻译和RNA复制）中所必需的宿主因子5。此外，在Drosophila细胞培养中支持病毒复制的许多细胞因子，在人类细胞感染这些病毒时同样具有限制性作用4,6,7,8,9。因此，鉴定病毒在感染过程中劫持的宿主因子，为抗病毒治疗提供了新的靶点。本文以痘苗病毒（vaccinia virus）为例，介绍一种用于鉴定参与病毒感染的细胞因子的高通量RNAi筛选通用实验方案。

方案

第1部分：384孔板中的RNAi

  1. 用于筛选的试剂标准化至关重要。我们对每一批次的Schneider's培养基、胎牛血清和染色试剂进行单独测试，然后分装并全程使用同一批次的试剂完成整个筛选过程。
  2. 对于任何检测，最好测试多种不同的细胞系，以确定哪种细胞系最适合您的生物学检测读数。我们通常使用S2-DRSC细胞系。
  3. 在25°C条件下，使用完全Schneider's培养基培养果蝇（Drosophila）细胞。
    1. Schneider's培养基
    2. 10% 热灭活FBS
    3. 1X L-谷氨酰胺
    4. 1X 青霉素/链霉素抗生素
  4. 果蝇（Drosophila）细胞为半贴壁细胞，每四天通过移液将细胞从培养瓶中吹打下来，并以1:10比例稀释至新的培养瓶中进行传代，无需使用胰酶消化。实验时应确保细胞处于对数生长期。
  5. 通过使用自动化液体处理系统向多孔板中添加所有液体，可最大限度减少板间和日间差异。我们使用WellMate（Matrix）设备。
  6. 准备WellMate管路。
    1. 用70%乙醇喷洒生物安全柜和WellMate设备。
    2. 从包装中取出管路并用70%乙醇喷洒。
    3. 将管路盒插入WellMate的分配位置。
    4. 用25 mL 70%乙醇预冲洗管路。
    5. 用乙醇对管路灭菌15分钟，再用另外25 mL乙醇预冲洗一次。
    6. 用50 mL无菌PBS预冲洗管路进行润洗。
  7. 从培养瓶中吹打下细胞并计数。离心收集细胞，使其数量比所需量多出25%（300×g，5分钟）。每孔接种的细胞数量需根据实验持续时间进行优化。当进行自动图像分析时，理想的条件是形成单层且无细胞团块的细胞层，以便于图像分割。
  8. 将离心后的细胞重悬于无血清Schneider's培养基中，浓度为1.7×106 个细胞/mL。
  9. 我们在384孔板中进行筛选，每孔已预先分装有市售的dsRNA文库，浓度为250 ng/孔。每块板保留若干孔作为空白对照，手动添加。我们使用靶向荧光素酶的dsRNA作为阴性对照；使用靶向Thread（dIAP）的dsRNA作为RNA干扰效果强的阳性对照，该抗凋亡因子的敲低会导致明显的细胞死亡，可快速通过视觉评估敲低效果；最后，我们使用靶向病毒报告基因（本例中为β-半乳糖苷酶）的dsRNA作为阳性对照，以验证本检测体系能够抑制病毒感染。若在接种细胞时点样dsRNA，应将1 μL dsRNA点于孔的角落以便观察，随后离心使dsRNA沉降至孔底（300×g，1分钟），再加入细胞。
  10. 使用WellMate将上述制备的10 μL细胞悬液加入各孔中。
  11. 将细胞离心沉降至板底（300×g，1分钟）。
  12. 在25°C培养箱中孵育45分钟。
  13. 加入20 μL完全Schneider's培养基，并再次离心（300×g，1分钟）。
  14. 将培养板置于内衬浸湿滤纸的密闭塑料容器（Tupperware）中。由于384孔板的体积较小，蒸发可能对生物学结果产生显著影响，进而导致边缘孔的检测结果出现假象。为避免此问题，应将培养板保持在高湿度环境中。
  15. 孵育三天，以实现充分的基因敲低。在此期间无需更换培养基或打开密闭容器。

第2部分：接种Vaccinia病毒

  1. 将多通道移液器在Quatricide中灭菌15分钟，然后用70%乙醇冲洗。
  2. 按上述方法准备WellMate。
  3. 通过将完全培养基在无血清培养基中按1:5稀释，制备含2% FBS的Schneider培养基用于感染。
  4. 用0.8 μm注射器滤器过滤粗病毒原液以去除细胞碎片，或使用纯化的病毒。
  5. 将vaccinia病毒用含2%血清的Schneider培养基稀释，以获得2的感染复数（MOI）。
  6. 从WellMate管路中移除PBS，并用稀释后的病毒液冲洗管路，直至其中无气泡。
  7. 使用已灭菌的多通道移液器和真空 manifold 装置，轻柔地从经dsRNA处理的Drosophila细胞板中移除培养基。
  8. 使用WellMate向每孔加入30 μL病毒液。
  9. 将细胞板在300×g下离心1分钟。
  10. 对WellMate管路进行灭菌：先用25 mL 10%次氯酸钠冲洗并静置10分钟，再用另外25 mL 10%次氯酸钠冲洗。
  11. 接着用50 mL水冲洗管路，再用50 mL 70%乙醇冲洗，然后将管路放回包装中。
  12. 将细胞板放回加湿的Tupperware容器中，在25°C下孵育48小时。

第3部分：染色平板

  1. 用多通道移液器和真空 manifold 在每步去除液体，将板在 15 μL 4% 多聚甲醛/PBS 中固定 10 分钟。固定完成后，不再需要无菌设备和试剂。
  2. 去除固定液，使用 WellMate 加入 30 μL PBST（PBS + 0.1% Triton-X）。孵育 10 分钟后重复一次。操作 WellMate 的方法同上，但管路无需灭菌。
  3. 为检测 vaccinia 感染，我们使用由早期/晚期 vaccinia 启动子驱动的 β-半乳糖苷酶报告基因。
  4. 去除液体，将细胞在封闭液（含 2% BSA 的 PBST）中孵育 10 分钟。
  5. 在封闭液中稀释一抗，去除液体后使用多通道重复移液器（Matrix）向每孔加入 15 μL 抗体。
  6. 将板离心（300×g，1 分钟），用透明封口膜密封，4°C 过夜孵育。
  7. 去除一抗，使用 WellMate 用 PBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  8. 在封闭液中稀释荧光标记的二抗（FITC）和细胞核染料，使用多通道重复移液器向每孔加入 15 μL。
  9. 在室温避光孵育 1 小时。
  10. 使用 WellMate 用 PBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  11. 用透明封口膜密封板，加盖后可在 4°C 保存最多三周。

第4部分：成像与图像分析

  1. 使用自动显微镜以20倍放大倍数对培养板进行成像。
  2. 拍摄总细胞核（DAPI）和感染细胞（FITC）的图像。针对每个通道分别优化曝光时间，以最大化动态范围。
  3. 通过采集一系列间隔为1 μm的Z轴图像序列，覆盖预期焦平面之上和之下的范围，来精细调整自动对焦功能。确定最佳焦平面后，相应地调整自动对焦设置。
  4. 对整块板进行成像，每个孔至少在Hoechst通道（DAPI）和病毒通道（FITC）中各采集三幅图像。应从每个孔内的多个不同区域选择成像位点，以确保所采集的图像能够代表该孔的整体情况。
  5. 使用 MetaXpress 软件编写流程以分割图像，并利用 Count Nuclei 模块计算每块孔板中细胞核染色阳性（总细胞数）和感染（FITC）的细胞总数。
  6. 计算感染率（100 × FITC阳性细胞数 / 总细胞数），并进行对数转换。
  7. 为筛选候选物，我们采用基于每块板的中位数和四分位距的稳健 Z 分数。该方法对异常值和非对称数据不敏感，因此在识别弱或中等程度的阳性结果时具有更高的检出能力10。对于每块板，首先从经对数转换的数据中减去中位数，然后将所得数值除以 0.74 倍的四分位距（即第 75 百分位数与第 25 百分位数之间的差值）th 百分位数和25th 百分位数）。0.74 系数用于近似标准正态分布。
  8. 稳健Z分数是衡量与平板中位数之间距离的指标，单位为标准差。例如，稳健Z分数为2表示该孔的感染率与平板中位数相差约2个标准差，或p<0.05.
  9. 分析细胞数量以鉴定细胞毒性候选物。计算细胞核计数的稳健Z分数。稳健Z分数<-2 在重复筛选中被视为具有细胞毒性。
  10. 感染百分比具有较强 Z 分数的孔 >2 或 <-2，进行两次重复筛选（p<细胞毒性较低且效果显著（0.0025）的化合物被视为初筛中的潜在候选物。
  11. 使用独立的试剂对阳性候选基因进行验证。针对目的基因的mRNA另一区域设计并生成dsRNA，然后按照上述方法进行测试。
  12. 那些具有两个独立dsRNA产生相同表型的基因可被考虑用于进一步研究。

第5部分：感染率的代表性图像及解读

荧光显微镜：未感染细胞与痘苗病毒感染细胞的比较，病毒感染影响分析，对比研究
图1. 未感染的孔中未显示任何染色 痘苗病毒 病毒蛋白，而一个具有代表性的感染孔中的细胞则呈阳性染色 痘苗病毒表达的β-半乳糖苷酶（βgal）蛋白，通过免疫荧光显微镜检测。病毒=绿色，细胞核=蓝色。

通过荧光显微镜进行细胞分析；细胞核及痘苗病毒感染检测；图像处理结果。
图2. 自动化图像分析软件根据用户设定的参数，对每张图像中的感染情况进行定量分析。在一幅代表性图像中，基于染色强度相对于局部背景染色的大小，对细胞核总数以及表达病毒抗原的细胞数量进行计数。

dsRNA 实验；荧光显微镜图像比较未处理与 thread 处理的结果。
图 3. thread (dIAP) 的敲低可作为目标基因有效 RNAi 耗竭的阳性对照。该抗凋亡因子的敲低可导致显著的细胞死亡。细胞核=蓝色。

荧光显微镜比较未处理与荧光素酶dsRNA处理对细胞样本的影响。
图4. 荧光素酶的敲低用作双链RNA处理对感染影响的阴性对照。与未处理细胞相比，荧光素酶的耗竭对感染无影响。病毒=绿色，细胞核=蓝色。

dsRNA 荧光素酶 vs βgal 实验结果；荧光显微镜图像；基因沉默分析。
图 5. βgal 蛋白的敲低作为感染减少的阳性对照，因为该检测以 βgal 蛋白水平作为感染程度的读数。βgal 的耗竭导致感染细胞百分比下降。病毒=绿色，细胞核=蓝色。

RNA干扰效应；显微镜图像；dsRNA荧光素酶，Rab5；细胞荧光分析。
图6. 细胞因子Rab5的敲低导致感染细胞百分比下降。由于Rab5已知参与内吞作用，该因子可能有助于vaccinia病毒的进入。此结果代表筛选中的一个异常值示例。病毒=绿色，细胞核=蓝色。

讨论

在Drosophila中进行全基因组RNAi筛选，为研究病毒感染的细胞组分提供了一种稳健且高效的方法。多种哺乳动物病毒能够感染Drosophila细胞，这些系统可用于鉴定宿主固有免疫应答的相关组分，以及病毒复制所必需的宿主蛋白因子，后者可能成为新的治疗靶点。在开展筛选之前，必须针对细胞类型、细胞数量和感染水平对检测方法进行仔细优化，并设置良好的对照，包括阳性和阴性的病毒及细胞靶标11。在开始筛选前，应确保阳性对照与阴性对照之间具有足够的区分度，以最大化检测的动态范围。筛选完成后，可将候选基因按功能类别进行分类，以确定哪些宿主机制参与了病毒感染过程。对于如vaccinia病毒等哺乳动物病毒，应在二级分析中通过RNAi验证其哺乳动物同源基因的功能贡献。综上所述，这些稳健的筛选方法将有助于我们深入理解病毒与其宿主细胞相互作用的复杂机制。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究获得了NIAID（R01AI074951、U54AI057168）和宾夕法尼亚基因组前沿研究所对SC的资助；NIH T32HG000046对TSM的资助；以及NIH T32GM07229和T32AI007324对LRS的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞培养
施耐德’s 培养基GIBCO，隶属于 Life Technologies11720
GlutaMAX 100XGIBCO，隶属于 Life Technologies35050
青霉素/链霉素（pen/strep）GIBCO，隶属于 Life Technologies15140
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF6178
<强>筛选
全基因组dsRNA文库Ambion
384孔板，黑色，透明底康宁3712
铝封膜康宁6569
清晰封口德文特科学B1212-4
Well MateMatlab201-10001
24针歧管Drummond Scientific3-000-101
H–chst 33342Sigma-AldrichB2261
荧光标记的二抗Invitrogen
ImageXpressMicro 自动化显微镜Molecular Devices
MetaXpress 图像分析软件Molecular Devices

参考文献

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