通过使用尖端光学纤维在常压下对植物和动物细胞进行取样，利用激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）质谱技术，在单细胞水平上开展质谱分析。
本文内容
摘要
摘要
对单个细胞中的生化物质进行分析，对于理解细胞代谢、细胞周期、适应性以及疾病状态等具有重要意义。即使是同类型的细胞，其生化组成也会因其生理状态及与环境的相互作用不同而表现出异质性。目前用于单细胞生物分子分析的传统质谱（MS）方法通常依赖于复杂的样品前处理过程。将细胞从其天然环境中分离并进行大量样品处理，可能导致细胞成分发生变化。环境电离技术则能够在样品的原始环境中直接进行分析，且无需复杂的样品制备过程1。基于中红外（mid-IR）激光在2.94 μm波长对生物材料进行消融的技术，利用水分子的瞬时激发引发相爆炸效应2。基于中红外激光辐射的环境电离技术，如激光消融电喷雾电离（LAESI）和常压红外基质辅助激光解吸电离（AP IR-MALDI），已成功实现了在常压条件下对富含水分的组织和生物液体的直接分析3-11。在LAESI中，中红外激光消融产生的羽流主要由样品中的中性颗粒物组成，这些颗粒物与高度带电的电喷雾液滴相互作用，从而生成离子。最近，研究人员通过蚀刻光纤传输中红外辐射，实现了对单个细胞的中红外消融，并利用电喷雾对消融产生的羽流进行后续电离，从而通过LAESI-MS技术实现了对单个细胞中多种代谢物的分析12。本文详细描述了使用LAESI-MS进行单细胞分析的实验方案。随文视频展示了对洋葱（Allium cepa）鳞茎表皮中单个细胞的分析过程。图1展示了该系统的示意图，图2则提供了单细胞消融的代表性示例及来自该细胞的LAESI质谱图。
方案
1. 光学组件
- 用于激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）质谱（MS）的激光烧蚀由波长为2.94 μm、脉宽为5 ns的激光脉冲产生。本研究中采用由Nd:YAG激光器驱动的可调谐光学参量振荡器（Opolette 100，Opotek公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）进行烧蚀，重复频率选择在5至100 Hz之间。该激光器属于IV类激光，直接暴露可能对眼睛或皮肤造成严重且永久性的损伤，激光束的漫反射也可能对皮肤或眼睛构成危害。操作时应佩戴合适的激光防护眼镜以确保安全。
- 基于二氧化锗玻璃制成的光纤购自Infrared Fiber Systems, Inc.（美国马里兰州银泉市）。若光纤表面包覆有Hytrel和聚酰亚胺涂层，请按以下步骤去除端部涂层。在通风橱中将1-甲基-2-吡咯烷酮加热至130–150 °C，将需剥除涂层的光纤端部浸入该液体中约1分钟，或直至涂层开始软化并剥落。随后将软化的涂层浸入甲醇或异丙醇中约1分钟，并用无尘纸擦拭去除残留涂层。去除涂层后，使用蓝宝石刀片（KITCO Fiber Optics，美国弗吉尼亚比奇市）通过刻痕并轻轻折断的方式对光纤两端进行切割。
- 为获得所需的尖锐度，使用1%（v/v）硝酸溶液（分析纯）对光纤一端进行化学蚀刻。在初始接触后，将光纤选定端垂直浸入酸液中，深度控制在300至500 μm。蚀刻约15分钟后，光纤尖端将自发从酸液表面脱落，形成曲率半径约为15 μm的尖锐光纤端。随后用去离子水冲洗，以去除任何残留的酸液。
- 将蚀刻后的光纤端固定于微操纵器（MN-151，Narishige，日本东京）上，并将其移至细胞表面附近（约20 μm），以实现高效的能量沉积。
- 使用裸光纤夹具（BFC300，Siskiyou Corporation，美国俄勒冈州格兰茨帕斯市）夹持光纤未蚀刻的一端。为实现光学对准，将光纤夹具安装在五轴位移台（BFT-5，Siskiyou Corporation，美国俄勒冈州格兰茨帕斯市）上。通过平凸氟化钙透镜或抗反射镀膜ZnSe透镜（Infrared Optical Products，美国纽约州法明代尔）将激光能量（0.5至1 mJ）聚焦耦合至光纤未蚀刻端。使用镀金保护镜（PF10-03-M01，Thorlabs，美国新泽西州牛顿市）引导中红外激光束至聚焦透镜。
2. 电喷雾装置设置
- 电喷雾系统可使用以下组件构建：带导电全氟弹性体卡套的金属接头、接头配件、管套、针端口（例如 U-435、M215、F-331Nx、F-242x、9013，分别来自 IDEX Health & Sciences, Oak Harbor, WA）以及熔融石英管（例如 CT360-100-50-5，New Objective Inc., Woburn, MA）。推荐使用的喷雾头为不锈钢材质，具有锥形尖端，内径为 50 μm（例如 MT320-50-5-5，New Objective Inc., Woburn, MA）。
- 配制含 0.1% 乙酸（v/v）的 50% 甲醇溶液用于电喷雾。使用注射泵（例如 Harvard Apparatus, Holliston, MA）和 500 μl 注射器（例如 81222，Hamilton Company, Reno, NV）以每分钟 200 至 300 nl 的流速泵送该溶液。
- 通过稳压电源（PS350，Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA）在金属接头上施加 2,800 至 3,000 V 的高压，以产生稳定的电喷雾。确保所有电气连接牢固，并正确接地屏蔽。直接接触暴露的高压可能导致电击。
3. 样品处理
- 从合适的来源获取活体组织或细胞样本，并在分析前按照推荐条件保存。本演示所用的Allium cepa鳞茎购自当地商店。用外科手术刀将鳞茎纵向切开，取数厘米长的鳞叶切成条状，剥离出完整的内表皮单层组织。
- 利用表皮湿润的表面将其贴附于预先清洁的玻璃载玻片上。将载玻片固定在安装于三轴平移台上的通用载物板夹持器（FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ）中进行定位。样本贴附后应立即采集质谱，以防止细胞降解。
4. 可视化系统
- 使用两台长距离显微镜来选择待分析的细胞，并维持拉制光纤尖端与细胞表面之间的距离。后者以相对于表面15°–30°的角度安装。该系统包括一台长距离视频显微镜（7倍精密变焦光学镜，Edmund Optics，Barrington，NJ），配备5倍无限远校正物镜（M Plan Apo 5x，Mitutoyo Co.，Kanagawa，日本）和CCD相机（Marlin F131，Allied Vision Technologies，Stadtroda，德国），用于监测和图像采集。
- 第二台视频显微镜以垂直于样品表面的角度安装，以便从上方观察细胞。该系统提供视觉反馈，用于将光纤尖端对准选定进行消融和分析的细胞。其组件包括一个7倍精密变焦光学镜（Edmund Optics，Barrington，NJ），配备10倍无限远校正长工作距离物镜（M Plan Apo 10x，Mitutoyo Co.，Kanagawa，日本）和CCD相机。
5. 质谱的采集
- 开启激光器、电喷雾和质谱仪，例如四极杆飞行时间质谱系统（Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA）。通过调节烧蚀点与电喷雾发射器之间的相对位置及其与质谱仪进样口的相对位置，优化LAESI离子源的几何构型，以获得最大的离子强度。
- 利用顶部可视化系统选择目标细胞进行分析。选定后，移动样品台，使所选细胞位于光纤尖端正下方。使用侧向显微镜重新调节光纤尖端与细胞表面的距离至约20 μm。
- 通过刻蚀的光纤尖端向选定细胞发射激光脉冲。这将导致细胞壁穿孔，并以颗粒物形式喷射出细胞质。经电喷雾后电离后，生成的离子被质谱仪采集并记录质谱图。
- 数据采集完成后，将激光器、电喷雾和质谱仪置于待机模式或关闭。保留已烧蚀的A. cepa组织样品，以便后续选择性地进行光学显微镜观察。
6. 代表性结果
单个细胞成功消融后，细胞壁破裂，并可采集到LAESI质谱信号。实验失败通常表现为无消融现象和/或无质谱信号。为演示目的，我们展示了对洋葱（A. cepa）鳞茎中单个包埋表皮细胞进行LAESI-MS分析的结果。图2a显示了取样后具有代表性的光学显微镜图像，可见细胞壁已被穿孔，穿孔范围受限于与邻近细胞的边界，相邻细胞似乎保持完整。图2b展示了由该细胞产生的典型LAESI质谱图。从该A. cepa细胞中检测到多种离子，根据其精确质量、同位素分布模式，以及在某些情况下的串联质谱数据，这些离子被初步归属为内源性代谢物。从单个细胞检测到的离子与通过传统LAESI-MS对多个细胞的相同组织分析所观察到的离子相似13。
图1. LAESI-MS 单细胞分析示意图。一束中红外激光脉冲被耦合至光学纤维中，并传输至置于载玻片上的样品。经过尖端处理的光纤将光聚焦到目标细胞上，沉积的能量使细胞破裂。产生的消融羽流（红色点）与电喷雾羽流（黑色点）合并，液滴融合（绿色点），从而生成具有样品特异性的离子。这些离子由质谱仪（MS）进行分析和检测。两个长距离视频显微镜——显微镜1和显微镜2——分别用于监测光纤尖端与细胞表面之间的距离，以及选择待分析的细胞。
图 2a. 洋葱（A. cepa）鳞茎单个表皮细胞上的消融标记。相邻细胞未表现出可见损伤，因此可分别进行分析。
图 2b. 对单个 A. cepa 表皮细胞进行消融所获得的质谱图，显示了初级和次级代谢物的存在。
讨论
细胞质的含水量以及细胞壁或细胞膜的抗张强度是决定LAESI-MS分析过程中单细胞消融的关键因素。必须调整激光通量以达到不同类型细胞的消融阈值。所传递的激光通量取决于激光脉冲的能量以及光纤尖端与细胞表面之间的距离。在单细胞分析过程中，尽量减少对邻近细胞的干扰至关重要。将激光能量维持在消融阈值水平，可限制分析对相邻细胞造成的影响。
一种潜在的应用是利用单个细胞作为质谱化学成像中的天然体素（voxels）。与在人为设定的通常是矩形的网格上采集数据相比，逐个细胞对组织进行化学成像更有可能保留细胞间生化相互作用的空间组织结构。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢以下机构提供的经费支持：美国国家科学基金会（资助号 0719232）、美国能源部（资助号 DEFG02-01ER15129）、W. M. Keck 基金会（资助号 041904）以及乔治·华盛顿大学研究增强基金。作者感谢红外光纤系统公司（Infrared Fiber Systems，美国马里兰州银泉市）慷慨提供的基于 GeO₂ 的光纤，同时也感谢乔治·华盛顿大学的 Mark E. Reeves 和 Joan A. Hoffmann 就光纤刻蚀方案所进行的初步讨论。作者还感谢 Jessica A. Stolee 在本方案视频拍摄过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Fluka | 45727 | |
| 甲醇 | Fluka | 65548 | |
| 1-甲基-2-吡咯烷酮 | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| 水 | Fluka | 39259 |
参考文献
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重印与许可
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