利用含RNA寡核苷酸转化法在基因组DNA中生成RNA/DNA杂交体

摘要

本研究展示了如何在染色体水平上形成RNA/DNA杂交体，并揭示遗传信息从RNA向酵母细胞基因组DNA的转移过程。

摘要

合成的短核酸聚合物——寡核苷酸（oligos）——是分子生物学中最常用且应用最广泛的研究工具。寡核苷酸可被合成为包含任意指定的 DNA 或 RNA 序列，并可引入多种碱基和糖基修饰。此外，寡核苷酸还可被设计用于模拟特定的核酸改变，从而作为研究 DNA 损伤效应及修复机制的重要工具。我们发现，长度在 50 至 80 个核苷酸之间的赛默飞世尔科技 Dharmacon 品牌含 RNA 寡核苷酸，特别适用于在活体（in vivo）条件下研究染色体上 RNA/DNA 杂交体以及嵌入 DNA 中的核糖核苷酸的功能与后果。RNA/DNA 杂交体可在 DNA 复制、修复和转录过程中容易形成，然而目前对于细胞内 RNA/DNA 杂交体的稳定性及其对细胞遗传完整性的潜在影响仍知之甚少。因此，含 RNA 的寡核苷酸成为将核糖核苷酸引入染色体 DNA 并生成特定长度和碱基组成的 RNA/DNA 杂交体的理想载体。本文介绍了将核糖核苷酸整合到真核模式生物酵母/Saccharomyces cerevisiae/基因组中的实验方案。然而，我们实验室已利用赛默飞世尔科技 Dharmacon 的含 RNA 寡核苷酸，在从细菌到人类细胞的多种细胞系统中实现了染色体水平上 RNA/DNA 杂交体的构建。

方案

原理

利用赛默飞世尔科技 Dharmacon 寡核苷酸（50 至 80 个核苷酸长度），本文介绍一种基于基因校正检测的实验流程，该方法通过寡核苷酸与靶向染色体 DNA 退火，将遗传信息导入酵母细胞的基因组 DNA 中。寡核苷酸成功靶向的结果可通过出现具有预期表型的酵母菌落进行评估。若所需的遗传修饰包含在寡核苷酸序列中掺入的一个或多个核糖核苷酸内，则遗传信息直接从 RNA 片段传递至染色体靶标 DNA，从而在靶向过程中于染色体水平形成 RNA/DNA 杂交体。赛默飞世尔科技 Dharmacon 含 RNA 寡核苷酸中的核糖核苷酸可作为 DNA 修复合成介导的基因靶向的模板，也可嵌入 DNA 并在 DNA 复制过程中充当模板。本实验采用真核模式生物酵母/Saccharomyces cerevisiae/；然而，类似的方法也可应用于其他生物体或细胞类型。在本视频中，我们使用一条赛默飞世尔科技 Dharmacon 设计的含一个中心位置核糖核苷酸、且与靶向酵母基因组位点具有同源性的寡核苷酸，用于校正靶基因中的突变。在将含 RNA 的寡核苷酸转化入酵母细胞后，我们观察到靶位点在一定频率下发生校正，表明该寡核苷酸的 RNA 片段已整合至染色体 DNA 中，并在 DNA 复制过程中的 DNA 合成阶段发挥了模板作用。RNA 片段所携带的遗传信息可稳定地传递给后续细胞世代。本文详细描述了利用赛默飞世尔科技 Dharmacon 含 RNA 寡核苷酸进行酵母细胞转化的步骤，以及检测 RNA 遗传信息向染色体 DNA 转移的方法。

A. 本实验所用含RNA寡核苷酸的设计

我们设计了一种含RNA的寡核苷酸，用于在酵母S. cerevisiae染色体DNA的trp5位点上校正遗传缺陷。本实验方案所用的酵母菌株在trp5基因中含有一段双碱基缺失和一个无义突变（图1A）。该酵母菌株为色氨酸营养缺陷型突变体，在不含色氨酸的培养基上无法形成菌落。TRP5基因的DNA序列可在酿酒酵母基因组数据库中获取（http://www.yeastgenome.org/）。本实验方案中使用的赛默飞世尔科技Dharmacon含RNA寡核苷酸为65聚体，包含一个双碱基DNA插入序列，用于校正缺失突变，以及一个核糖核苷酸，用于校正trp5等位基因的无义突变（图1A）。该寡核苷酸的序列为：
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT。该寡核苷酸由赛默飞世尔科技Dharmacon公司（科罗拉多州拉法叶）以200 nM规模合成，经过脱盐、脱保护处理，无需聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化即可直接使用。

B. 用于酵母转化的含RNA寡核苷酸的制备（修改自 Storici et al., 2007 ¹）

1. 在实验开始前，使用RNase去污染溶液擦拭实验所用的材料，包括寡核苷酸管、移液器、涡旋振荡器、试管架、实验区域以及研究人员佩戴的手套，以去除潜在的RNase污染。所有步骤均应使用无RNase的水、化学试剂、离心管和移液器吸头。本实验的每一步都必须保持无RNase环境。
2. 使用无RNase的水将购自Thermo Scientific Dharmacon公司的含RNA寡核苷酸重悬为250 pmoles/μl的储存液，并充分涡旋以溶解沉淀。储存于-80°C。
3. 在转化前立即置于冰上解冻含RNA的寡核苷酸，并用无RNase的水在无RNase离心管中稀释至50 pmoles/μl。每次转化需要1 nmole的含RNA寡核苷酸。
4. 将选定量的含RNA寡核苷酸置于100 °C金属浴中变性2分钟，以消除寡核苷酸的二级结构。
5. 变性后立即将离心管置于冰上，保持冰上放置直至进行转化。
6. 作为实验对照，使用相应的仅含DNA的寡核苷酸。该寡核苷酸从-20 °C解冻，并按照上述含RNA寡核苷酸的方法进行转化前处理。

C. 使用含RNA的寡核苷酸转化酵母细胞

1. 在5 ml富集YPD液体培养基中接种trp5突变型酵母细胞，并于30 °C过夜培养（参见材料部分）。
2. 将过夜培养物1.5 ml转移至50 ml YPD液体培养基中。
3. 将细胞在30 °C摇床（225 rpm）中孵育4小时。
4. 在无RNase的离心管中立即配制溶液1和溶液2（参见材料部分）。
5. 将细胞培养物转移至50 ml无RNase的离心管中，以3000 rpm（相当于1562 g）离心2分钟。细胞沉淀的体积约为0.3 cm³。
6. 弃去上清液，用50 ml无RNase的水洗涤细胞，并以3000 rpm离心2分钟。
7. 重复步骤6共5次，以尽可能去除培养基以及可能存在于培养基中的RNase。
8. 弃去上清液，将细胞重悬于5 ml溶液1中，并以3000 rpm离心2分钟。
9. 弃去上清液，将细胞重悬于250 μl溶液1中。此细胞量足以进行7–8次转化反应。
10. 将细胞悬液分装至无RNase的微量离心管中，每管50 μl，然后分别加入含RNA的寡核苷酸工作液20 μl（1 nmole），或仅含DNA的寡核苷酸工作液20 μl（1 nmole），或20 μl无寡核苷酸的无菌水作为阴性对照。随后每管转化反应中加入300 μl溶液2。转化过程中无需添加鲑鱼精子DNA，因为寡核苷酸本身即可作为载体。
11. 剧烈涡旋振荡，使各组分充分混匀。
12. 将转化反应体系在30 °C摇床中孵育30分钟。
13. 42 °C热激15分钟。
14. 以5000 rpm（相当于2236 g）离心4分钟，使细胞沉淀。
15. 弃去上清液，将细胞重悬于100 μl无菌水中。
16. 取部分上述细胞悬液，用无菌水稀释100,000倍，加入约15颗无菌玻璃珠，涂布于一块YPD平板上，于30 °C培养2天。
17. 将每次转化反应中重悬的全部细胞涂布于一块不含色氨酸的合成完全固体培养基（SC-Trp）培养皿中，使用约15颗无菌玻璃珠，于30 °C培养4–5天（图2）。

D. 含RNA寡核苷酸介导的基因校正分析

1. 在选择性培养基（图2）以及YPD培养基上计数形成的菌落数量，以计算含RNA寡核苷酸、仅含DNA寡核苷酸以及无寡核苷酸对照组的基因校正频率。比较所获得的菌落数目。自发回复突变率的 trp5 在所使用的酵母菌株中，含有双碱基缺失和无义突变的等位基因频率低于10-9，因此在未向细胞添加寡核苷酸的情况下，我们预期在选择性培养基上不会形成菌落。
2. 随机挑取数个转化子菌落，划线接种于YPD培养基上，以获得单菌落分离株。等待两天待菌落生长后，选取多个（至少5个）单菌落，在YPD培养基和选择性培养基上分别点种。
3. 设计一对引物，用于通过菌落PCR扩增RNA寡核苷酸靶向的区域（250–1,000 bp）（图1B）。菌落PCR的操作步骤如下（修改自Storici和Resnick，2006） ²).
   1. 将来自各个组织块的细胞（约 1 mm³）重悬于 50 μl 水并加入 1 单位裂解酶。室温孵育 10 分钟，随后在 100 ℃ 金属浴中孵育 °在 5 分钟内加热至 C 以裂解细胞，使基因组 DNA 释放到溶液中。
   2. PCR反应条件：PCR反应包含10 μ细胞重悬液，正向和反向引物各50 pmol，1 μ10 mM dNTPs 溶液，1 单位 Taq 聚合酶，5 μ10x 缓冲液，并用无菌水调整至终体积为 50 μl. PCR 程序为 95 °C 预变性 3 分钟 °C；95℃下30秒，30个循环°C，55℃下30秒 °C，以及72℃下1分钟 °C；在 72℃ 下最终延伸 7 分钟 °C；随后将样品置于4 °C. 本反应的延伸时间按1分钟/千碱基计算。
   3. PCR反应完成后，根据预期PCR产物的大小，将样品在1%或2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以观察PCR产物（图3）。
4. 如果含RNA的寡核苷酸所转移的遗传信息在酵母基因组靶区域产生新的限制性酶切位点（图1B），则可通过使用相应的限制性内切酶消化PCR产物来验证信息的正确转移。如果含RNA的寡核苷酸未产生限制性酶切位点，则进入步骤6。使用特异性限制性内切酶消化PCR产物。消化反应体系包含6 μPCR产物、缓冲液、BSA（某些酶可能无需添加，具体请参见所用酶的说明书）、0.5 μ限制性内切酶，无菌水至15 μL μl. 样品在所用酶的特异性温度下孵育1小时。
5. 在同一块2%琼脂糖凝胶的同一泳道中，同时电泳未消化样品和已消化样品，以观察由含RNA寡核苷酸的RNA片段所介导的遗传修饰（图3）。
6. 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并将其制备用于DNA测序。使用扩增产物时所用的相同引物提交样品进行测序。
7. 使用能够将多条序列与选定参考序列进行比对的软件分析DNA测序结果（图4）。

E. 含RNA寡核苷酸的碱处理（图5）

1. 每个反应中，向一个1.5 ml离心管加入1 nmole（4 μl浓度为250 pmoles/μl的储存液）含RNA的寡核苷酸或DNA寡核苷酸。
2. 加入4 μl 1 M NaOH进行水解；或者作为阴性对照加入4 μl H₂O，在65°C水浴中孵育1小时，随后转移至冰上。
3. 用2 μl 1.2 M HCl、4 μl 1 M Tris-HCl和4 μl H₂O中和；阴性对照则使用6 μl H₂O和4 μl 1 M Tris-HCl。中和后将样品置于冰上，直至进行转化。

图1. 缺陷型trp5基因以及由含RNA的寡核苷酸修复后的TRP5等位基因的示意图。 A) trp5突变基因包含一个2个碱基的缺失（黑色三角形）和一个碱基的无义突变（星号）。将含有2个碱基插入（蓝色环状结构）和1个RNA碱基替换（红色矩形）的单链含RNA寡核苷酸导入酵母细胞，以修复trp5基因的遗传缺陷，该修饰可产生一个Van91I限制性内切酶位点（括号所示）。B) 在含RNA的寡核苷酸修复TRP5基因后（修复的碱基以蓝色矩形表示），在TRP5基因中形成Van91I酶切位点。使用一对引物（P1和P2）通过PCR扩增得到一个278 bp的片段，该片段在TRP5基因中仅包含一个Van91I限制性酶切位点。图中还显示了P1和P2扩增产物经Van91I酶切后产生的177 bp和101 bp两个片段。

图2. 含RNA寡核苷酸转化结果。A) 未加入寡核苷酸的酵母细胞在SC-Trp培养基上不形成任何菌落，见平板a-b。B) 平板c-g显示酵母细胞经1 nmole含RNA寡核苷酸转化后，在SC-Trp培养基上生长出菌落。C) 平板h-l显示酵母细胞经1 nmole相应的仅含DNA对照寡核苷酸转化后，在SC-Trp培养基上生长出菌落。

图3. 通过限制性酶切PCR扩增产物检测含RNA的寡核苷酸向酵母染色体DNA的遗传信息转移。使用P1和P2引物扩增的PCR样品经Van91I限制性内切酶消化后的2%琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1、8和15为DNA ladder，左侧标注的片段大小分别为100、200、300、400和500 bp；泳道2为从trp5突变株基因组DNA中扩增的trp5位点PCR产物；泳道3为由仅含DNA的寡核苷酸靶向的Trp+菌落基因组DNA扩增的PCR产物；泳道4–7为由含RNA的寡核苷酸靶向的Trp+菌落基因组DNA扩增的PCR产物；泳道9–14为泳道2至7中PCR产物经Van91I酶切后的结果。泳道10至14中未切割PCR条带的存在可解释为Van91I在TRP5位点（CCACATTCTGG）处的不完全酶切。考虑到Van91I（识别序列：CCANNNN NTGG）的切割位点可对应多种序列，TRP5中生成的位点可能并非该酶的最佳底物。事实上，在对上述所有PCR产物进行DNA测序后，我们未检测到寡核苷酸所携带变异以外的其他改变（见图4）。右侧箭头所示分别为P1和P2引物扩增的278 bp PCR条带，以及经Van91I酶切后产生的177 bp和101 bp的酶切片段。

图4. 含RNA寡核苷酸介导基因修复的DNA测序结果。 A) 含RNA寡核苷酸靶向的基因组区域的DNA电泳图谱。DNA序列中蓝色框出的G碱基来源于含RNA寡核苷酸上的rG。另一个框出区域显示CG碱基的插入。所有其他PCR产物的测序结果均与此图一样清晰，荧光信号显著高于背景。B) 由仅含DNA寡核苷酸（T1）和含RNA寡核苷酸（T2-T5）靶向的Trp+转化子的TRP5区域序列，与寡核苷酸靶向前的trp5突变细胞基因组DNA序列（红色阴影区）进行比对，顶部为一致序列。底部的修复用含RNA寡核苷酸中，两个DNA碱基插入和一个RNA碱基（G）替换以红色标出。蓝色框内并带有黄色背景的区域显示，在所有检测样本中，含RNA寡核苷酸以及仅含DNA寡核苷酸均精确修复了缺失突变和无义突变。虚线标示了含RNA寡核苷酸序列的位置。请点击此处查看图4的放大版本。

图5. 碱处理可阻止含RNA寡核苷酸介导的基因校正。 含RNA寡核苷酸（R）的转化频率以红色柱表示，仅含DNA寡核苷酸（D）的转化频率以蓝色柱表示。误差线代表每种寡核苷酸三次独立转化实验的平均值标准误。仅含DNA的寡核苷酸在未经和经NaOH处理后显示出相似的转化频率。相比之下，含RNA寡核苷酸在经NaOH处理后转化频率降至0。因此，含RNA寡核苷酸的制备样品中未被仅含DNA的寡核苷酸污染，故所观察到的转化频率特异性地来源于含RNA寡核苷酸。

讨论

利用含合成RNA的寡核苷酸（Dharmacon合成的寡核苷酸）¹，研究人员首次发现RNA能够在细胞内直接将遗传信息传递给基因组DNA。这一发现证明了细胞可以使用含RNA的分子或仅由RNA组成的序列作为DNA合成的模板。使用含RNA的寡核苷酸不仅证实了遗传信息能够直接从RNA传递到基因组DNA，而无需经过逆转录生成DNA中间体的过程，还证明了RNA可作为同源模板参与DNA损伤的修复^1,3。这些寡核苷酸可以完全由RNA组成，也可以仅在DNA序列中嵌入单个核糖核苷酸，正如本文所展示的示例。该含RNA的寡核苷酸包含一个设计用于校正基因组中缺陷型trp5等位基因无义突变的嵌入式核糖核苷酸。遗传信息从核糖核苷酸向基因组DNA的转移可通过靶向细胞表型的变化（即细胞能够在缺乏色氨酸的培养基上生长）得以显现。通过测定含RNA寡核苷酸介导的基因校正频率，并与仅含DNA的对照寡核苷酸进行比较，可在不同细胞背景下（例如我们对多种酵母基因进行突变）开展该基因校正实验，从而检测哪些因子特异性影响含RNA寡核苷酸的靶向效率。因此，我们可以揭示细胞调控RNA/DNA杂交体稳定性的机制。通过简单设计不同形式的含RNA寡核苷酸，我们能够确定特定RNA片段作为DNA修饰模板的可能性，并评估嵌入DNA中的特定RNA序列的稳定性。此外，我们还能鉴定出与RNA/DNA杂交体相互作用的因子在体内的优先底物。

尽管有几种 体外 研究主要利用含有短RNA的寡核苷酸，对能够识别RNA-DNA杂交体中RNA的因子（如RNase H酶）的功能进行了表征。 ⁴，该 体内 RNases H 的功能以及其他可能影响 RNA/DNA 杂交体稳定性的蛋白质的身份在很大程度上仍不清楚。使用较长（50 至 80 个核苷酸）且质量优良的含 RNA 寡核苷酸（如 Thermo Scientific Dharmacon 含 RNA 寡核苷酸）的可能性，为直接研究多种分子过程开辟了途径 在体 在目标细胞中，如本视频所示，使用含RNA的寡核苷酸进行转化时，相较于使用DNA分子的转化，基本上仅需增加几个防止RNase降解的步骤。因此，含RNA寡核苷酸的转化不仅限于酵母系统，还可应用于任何能够高效进行DNA寡核苷酸转化的生物体或细胞类型。

总之，利用含RNA的寡核苷酸靶向细胞为生成嵌入DNA中的RNA/DNA杂交体和核糖核苷酸提供了可能 体内 在细胞中。这些物质的稳定性、功能及其后果 体内 生成的RNA/DNA杂交体可被分析和表征，有望揭示未知的DNA修复机制，并发现基因靶向的新策略。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 转化试剂与培养基（修改自 Storici 和 Resnick，2006）
YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基）：配制 1 L 时，加入 10 g 酵母提取物、20 g 胰蛋白胨、20 g 葡萄糖。添加 15 g 琼脂以制备 YPD 固体培养基。使用前高压灭菌，室温保存。 溶液 1：0.1 M 醋酸锂。转化前立即配制。溶液 1 为工作液，直接由粉末配制，无需配制储备液。室温保存。LiAc 可增加酵母细胞壁对 DNA 的通透性。 溶液 2：0.1 M 醋酸锂和 50% 聚乙二醇 4000。溶液 2 也为工作液，直接由粉末配制，无需配制储备液。室温保存。PEG 可将寡核苷酸沉积到酵母细胞上。 含 RNA 的寡核苷酸（Thermo Scientific Dharmacon），50–80 个碱基长度，脱盐、去保护且未经纯化。重悬至 250 pmoles/μl。-80 °C 保存。 仅含 DNA 的寡核苷酸，50–80 个碱基长度，脱盐且未经纯化。重悬至 50 pmoles/μl。-20 °C 保存。 SC-Trp（缺乏色氨酸的合成完全培养基）固体培养基。 直径 0.5 cm 的玻璃珠，经高压灭菌处理。 RNase-off：RNase 去污染溶液。 无 DNase/RNase、无菌离心管。 无 DNase/RNase、无菌锥形管。 无 DNase/RNase、无菌带 ZAP 的气溶胶吸头：1–200 μl，100–1000 μl。
B. 菌落 PCR 材料。
DNA 引物，脱盐且未经纯化。溶于无菌水中至 50 pmoles/μl。-20 °C 保存。 Taq DNA 聚合酶、缓冲液、dNTPs。 PCR 管。
C. PCR 产物纯化。
PCR 纯化试剂盒。
D. 凝胶电泳。
琼脂糖。 1 × TBE 电泳缓冲液（45 mM Tris-硼酸盐和 1 mM 乙二胺四乙酸），由 10× TBE 稀释而成。 预染分子量标记物。 DNA 上样染料。
E. 限制性酶切。
限制性内切酶、10× 缓冲液、BSA。
F. 含 RNA 寡核苷酸的碱处理。
1 M NaOH 溶液。 1.2 M HCl 溶液。 1 M Tris-HCl，pH 7.4 溶液。