检测运动活性以研究昼夜节律和睡眠参数 果蝇

摘要

我们描述了记录每日运动活动节律的实验步骤 黑腹果蝇 以及后续的数据分析。运动活动节律是动物生物钟可靠的生理行为输出指标，在研究昼夜节律突变体或探究环境如何调控昼夜节律系统时，常被用作评估生物钟功能的标准读出指标。

摘要

大多数生命形式在细胞、生理和行为现象上都表现出由内源性昼夜（circadian）节律驱动的日常节律≡24小时）起搏器或生物钟。人类昼夜节律系统的功能障碍与多种疾病或紊乱相关。通过对遗传筛选的研究，利用易于测量的行为节律作为生物钟功能的读出指标，我们在理解昼夜节律机制方面已取得显著进展。相关研究采用 果蝇 在昼夜节律的细胞与生化基础研究方面做出了开创性贡献。标准的昼夜节律行为检测指标通常测量 果蝇 是运动活动。通常，监测系统包含专门设计的设备，可用于测量生物体的运动活动 果蝇这些设备安置在暗室内的环境可控培养箱中，通过红外光束的阻断来记录置于小管内的单只果蝇的运动活动。当持续测量多天时， 黑腹果蝇 表现出活动与非活动的每日周期，这种行为节律由动物体内的内源性昼夜节律系统所调控。随着商业化运动活动监测设备的出现以及数据分析软件的发展，整体实验流程已得到显著简化。我们采用Trikinetics公司生产的系统，该系统是目前全球使用最广泛的装置，本文所述即为其操作流程。近年来，相同的监测设备已被用于研究睡眠行为 果蝇由于可以同时测量大量果蝇的每日清醒-睡眠周期，且通常仅需1至2周的连续运动活动数据即可，因此该系统非常适合用于大规模筛选以鉴定 果蝇 表现出昼夜节律或睡眠特征的改变。

方案

本方案的整体设计如图1所示。首先需要组装用于监测运动活动的设备，该设备置于暗室内的环境控制培养箱中。一旦完成组装，该系统即可用于后续所有的运动活动节律测量实验。每次实验需完成以下步骤：（i）准备实验动物，可能包括制备转基因动物或设置必要的杂交组合；（ii）准备含有食物来源的玻璃活动管；（iii）将果蝇装入活动管，并将活动监测仪连接至数据采集系统；（iv）根据所要分析的昼夜节律或睡眠参数，使用不同的软件进行数据记录与分析。本文中，将实验的“开始”定义为监测装置中的果蝇首次暴露于环境培养箱中设定的光照/黑暗条件的时间点。

1. 设置运动活动监测系统

1. 监测系统涉及多种设备，例如专用监测装置、具备昼夜光照控制能力的环境培养箱、数据采集装置、计算机以及用于连接监测装置与数据采集装置的导线等外设材料（图2）。Drosophila活动监测（DAM）数据采集系统的安装说明由制造商（Trikinetics Inc.）提供。
2. 为安置运动活动监测系统，应选择通风良好的房间，并最好配备温控系统，作为专用暗室。由于所有电气系统（如计算机和培养箱）将在狭小密闭空间内长时间运行，可能产生大量热量，导致室内温度迅速上升。因此，培养箱将承受额外负荷以维持设定温度，从而更易出现温控失效。我们发现，即使通风良好的房间，在夏季空调向秋冬供暖切换期间，也难以维持稳定的室温。在此类情况下，可能需要在暗室内加装额外通风设备，以降低过热风险。此外，最好关闭未使用的培养箱，以尽量减少不必要的热量产生。
3. 应将房间与外部光源完全隔绝。入口处可使用旋转门或黑色帘幕进行密封。我们更倾向于使用旋转门，因其可最大程度减少非预期光线进入暗室的可能性。在暗室内操作时，无需完全处于黑暗中，因为果蝇的昼夜节律系统对红外光不敏感（且对红光的敏感性远低于对绿光/蓝光的敏感性）。当需要在暗室中视物但仍需保持整体黑暗环境时（例如，在处于黑暗阶段的培养箱中快速移除或添加监测装置），我们通常使用加装红色滤光片的标准手电筒。此外，若暗室配备荧光灯，可将其覆盖红色滤光纸，或使用带有此类滤光纸的独立白炽台灯。果蝇在黑暗环境中短暂暴露于红光（数秒）极不可能影响其昼夜节律钟。尽管Drosophila的昼夜节律系统对可见光极为敏感，但我们认为暗室内微弱的漏光通常不会产生显著影响；无论如何，良好的操作规范是仅在必要时才打开培养箱门。此外，每次仅打开一个培养箱，以最大限度避免处于黑暗阶段的培养箱受到处于光照阶段培养箱的光线干扰。
4. 购置具备足够功率容量的不间断电源（UPS）应急备用装置，以在建筑内发生电压浪涌、尖峰或断电时维持活动监测系统各组件的运行。如条件允许，应将UPS应急备用装置连接至建筑的应急供电电路。需注意，即使设备在断电期间已接入应急电源插座，系统切换至应急供电时仍可能存在短暂过渡期。在此过渡期间，即使数秒的断电也可能导致计算机关闭及培养箱内灯光熄灭。因此，必须确保用于采集活动数据的计算机以及控制培养箱灯光的系统不仅接入应急电源，同时还连接UPS。若培养箱的照明控制系统并非由培养箱本身直接调控（大多数情况下如此），则仅需将培养箱接入应急电源而无需额外连接UPS，因为短暂断电不会影响培养腔体的温度。需注意，通常UPS设备在断电情况下仅能维持设备运行5至30分钟；其主要作用是在常规供电切换至应急供电的过渡期间防止临时断电造成影响。
5. 配置一台专用的计算机（PC或Macintosh），专门用于数据采集和/或培养箱的光照控制。由于DAM系统需持续运行且无人值守，建议该计算机安装最少的软件，最好不连接网络，以降低系统崩溃的风险。此外，系统需配备便携式数据存储设备，例如Zip驱动器、CD/DVD刻录机或USB设备，以便下载采集的数据用于后续分析。
6. 手动将电话线网络整齐布设于环境控制培养箱的支架周围，以便于活动监测仪的插拔操作。标准电话线、适配器和分路器可从商用电子商店购买并使用。应设置多条电话线，使其汇合为一条主线路，并从培养箱引出后连接至计算机。
7. 通过电源接口单元（即Trikinetics Inc.的“蓝盒”）将培养箱内的监测装置连接至计算机，该单元通过电话线为活动监测仪（Trikinetics Inc.）供电。该电源接口单元还充当数据传输的接口，实现从电话线到USB电缆的信号转换。该单元可选配光照控制器，培养箱照明系统的电源线可接入其中，从而实现通过计算机控制昼夜培养箱的光照程序。
8. 使用胶带或黑色布料遮蔽电子设备的LED光源，或对密封不良的培养箱门进行封堵，以确保在无非预期光照条件下测量自由运行的节律。

2. 实验动物的准备

1. 果蝇的昼夜节律性和睡眠/休息活动等行为表型对实验动物的基因型和年龄差异非常敏感（Koh et al. 2006）。因此，必须使用在相同环境条件下饲养且年龄一致的适当对照动物来评估这些表型。此外，昼夜节律存在性别二态性（Helfrich-Föster 2000）。通常的做法是使用在25°C下饲养、年龄为1至5天的成年雄性果蝇进行运动活性检测。传统上选择雄性而非雌性果蝇，是因为产卵活动会影响运动活性的真实测量。但由于存在性别二态性，在某些情况下检测雌性果蝇可能具有参考价值。使用仅含5%蔗糖和2%细菌琼脂的食物可防止非处女雌性果蝇所产卵的发育，以及孵化幼虫的活动造成错误的活动计数。此外，也可使用处女雌性果蝇，尽管交配雌性和处女雌性之间的活动模式可能存在差异（Helfrich-Forster, J. Biol. Rhythms 2000）。
2. 在研究特定突变果蝇的昼夜节律和睡眠/休息参数时，应将突变品系与相同遗传背景的野生型品系（例如 w1118 或 yw）进行杂交。这有助于消除可能掩盖昼夜节律或睡眠/休息表型的次要位点遗传修饰因子。由于雄性 Drosophila 不存在染色体交换，因此最好通过将突变雌性与野生型雄性杂交来完成杂交操作。该野生型品系也可作为实验的合适对照。在运动活性节律实验开始前约10至14天，同时将野生型对照和突变果蝇接种于标准 Drosophila 培养基中（参见Bloomington果蝇品系中心的培养基配方：http://flystocks.bio.indiana.edu/）。待子代羽化后，收集1至5日龄的雄性果蝇并留作实验使用。
3. 得益于全球各大品系中心提供的丰富遗传工具和资源，如基因过表达、RNA干扰（RNAi）以及组织特异性GAL4驱动果蝇品系，研究人员能够以组织特异性和时间特异性的方式解析特定基因过表达或敲低的影响（Brand and Perrimon 1993；McGuire et al. 2004；Osterwalder et al. 2001）。为利用此方法研究昼夜节律和睡眠/休息参数，需在运动活性实验开始前约14天，将携带组织特异性或药物可诱导GAL4驱动元件的转基因果蝇（例如雄性）与携带目标基因连接UAS响应元件的转基因果蝇（例如处女雌性）进行杂交。待子代羽化后，收集1至5日龄的雄性果蝇并留作实验使用。杂交所用的亲本品系通常作为实验的对照。此外，将UAS响应品系和GAL4驱动品系分别与相同遗传背景的野生型果蝇杂交所产生的子代，也可作为合适的对照。
4. 如步骤（2）和（3）所述，实验动物准备所需的时间长短因实验的性质和设计而异。若需要构建转基因动物或执行复杂的杂交方案，则显然需要更长的时间。从操作角度而言，在25°C条件下，Drosophila 从卵发育至成虫大约需要14天。

3. 活性检测管的制备

1. 活动管用于表示实验期间果蝇的生活环境。它们是细长的（直径约 5 mm；注意，Trikinetics 提供不同尺寸，具体取决于待检测的 Drosophila 物种）5 mm 玻璃管，一端含有食物物质，另一端用纱线或塑料塞封口。由于玻璃活动管可多次重复使用，本文将以之前实验中使用过且未清洗的活动管作为起始材料描述其制备流程。若您使用的是全新的活动管，请直接跳至步骤（11）。
2. 建议使用新制备的活动管，因为即使在 4°C 条件下储存，管内的食物仍会随着时间推移逐渐变干并被真菌污染。通常应在实验开始前数天至一周内完成制备。因此，在准备活动管前，准确评估每次实验所需数量至关重要。
3. 从使用过的活动管上移除塞子（纱线或塑料塞），并将它们放入一个大玻璃烧杯中。烧杯中的管子不应超过其容积的一半。向烧杯中加入自来水，确保完全浸没所有管子。
4. 将装有玻璃管的烧杯放入微波炉加热，直至水剧烈沸腾，以融化管内残留的蜡和琼脂食物。
5. 注意热水可能造成烫伤。将烧杯从微波炉中取出，用刮刀或塑料 10 mL 移液管搅拌管子，使融化的蜡浮至水面。然后重复步骤（4）。
6. 将烧杯从微波炉中取出，静置冷却。若条件允许，可将烧杯置于冷室中以加快冷却过程。
7. 随着水温下降，蜡会聚集在水面并逐渐凝固。可直接用手将凝固的蜡块取出。此操作可去除管子上大部分残留的蜡。
8. 将活动管转移至另一个装有新鲜自来水的新烧杯中，并重复步骤（4）和（5）。
9. 由于大部分蜡已在步骤（7）中被清除，无需等待蜡再次凝固。直接将烧杯中的水倒出，并将管子转移至另一个新的烧杯中。注意此时水仍可能较热，操作时需小心。
10. 最后一次重复步骤（4）和（5）。倒出烧杯中的水，等待活动管冷却。
11. 将活动管垂直装入 250 mL 或 500 mL 玻璃烧杯中，确保管子之间不过于紧密。通过使用干燥循环的高压灭菌器或干燥烘箱对管子进行灭菌或干燥处理。
12. 另取材料制备用于填充活动管的食物：在蒸馏水或自来水中配制 5% 蔗糖（Sigma）和 2% Bacto 琼脂（BD）的溶液。通过高压灭菌对该溶液进行灭菌。灭菌后的食物可立即使用，也可长期储存在 4°C 环境中。一旦食物凝固，再次使用前需通过微波加热使其液化。未使用完的食物可储存并在后续使用。
13. 理想情况下，用于填充活动管的食物温度应维持在约 65°C。若温度过高，管内将产生过多冷凝水；若温度过低，食物会在管子未完全填充前即凝固。使用 10 mL 移液管沿玻璃烧杯内壁缓慢加入液态食物溶液，使食物自底部向上填充，直至各管填充至约三分之一处。轻轻旋转烧杯，确保所有管子（尤其是位于烧杯中央的管子）均被均匀填充。在室温或 4°C 条件下静置，直至食物完全凝固。待玻璃管内的冷凝水完全消失后，再进行下一步操作。
14. 为将活动管从烧杯中取出，可将管子向烧杯底部推动并同时轻轻扭转，使管内凝固的食物与烧杯底部分离。最好以整束形式取出管子。
15. 用纸巾逐根擦拭管子外表面，去除多余的食物残留。将处理后的管子置于洁净容器中备用。
16. 取一个无管架的一般实验室加热块，用多层坚固的铝箔小心覆盖加热孔。向铝箔衬里的加热孔中加入石蜡（蜡）颗粒并加热至熔化。
17. 手持活动管的非食物端，将食物端浸入熔化的蜡中。随后将涂蜡部分迅速浸入装有冷水的玻璃烧杯中，以加速蜡的凝固。重复此操作一次。将涂蜡后的管子浸入水中可防止它们相互粘连。
18. 制备完成的活动管可立即使用，或在密封容器中于 4°C 储存，一周内使用。长期储存会导致食物过度干燥。若管子曾在 4°C 储存，使用前应将其置于实验台面上，使其恢复至室温后再使用。

4. 将果蝇装入活动管并接入运动活动监测系统

1. 在将果蝇装入活动管之前，打开将用于放置活动监测仪的培养箱。使用培养箱的控制装置调节温度，并根据实验设计要求，使用DAM系统光照控制器或培养箱自带的光照控制系统设置明暗循环周期。装入果蝇所需的时间应足以使培养箱内温度达到稳定。
2. 用二氧化碳麻醉果蝇。
3. 使用细毛笔轻轻将一只果蝇转移至一根活动管中。
4. 用精细镊子夹住一段长约半英寸的细线中点，将其插入活动管的非食物端，以封住管口，防止果蝇在实验期间逃逸，同时允许空气流通。或者，也可使用带小孔的塑料帽（Trikinetics, Inc.）封闭管口。
5. 确保在果蝇苏醒前将活动管平放，否则果蝇可能粘附在食物上而无法活动。
6. 将活动管插入活动监测仪中。对于较新型号的Trikinetics监测仪（Trikinetics DAM2 和 DAM2-7），需使用橡皮筋固定活动管，以确保红外光束穿过玻璃活动管的中心位置。
7. 将活动监测仪放入培养箱，并通过电话线连接至数据采集系统。使用DAM系统采集软件检查，确保所有监测仪均已正确连接，并且正在从每台设备采集数据。监测仪会发射一束红外光穿过每根玻璃活动管的中心。果蝇的运动活动以原始二进制数据形式记录，每次红外光束被阻断时记录为“1”，未被阻断时记录为“0”。

5. 用于记录数据以确定昼夜节律周期性和振幅的实验设计

1. 果蝇通过暴露于设定的光照/黑暗（LD）周期和温度条件下同步并完成诱导，持续时间为2-5个完整昼夜。最常用的诱导条件为12小时光照/12小时黑暗（12:12 LD）周期，温度设定为 25°C这一普遍接受的标准条件主要基于以下理念： 果蝇 源自非洲赤道地区。在研究昼夜节律时，需熟悉一些专业术语。与本实验方案相关的是，光照培养箱开灯的时间被定义为外部授时因子时间0（ZT0），其他所有时间均相对于该值表示（例如，在12:12明暗循环条件下，ZT12为关灯时间）。在标准的12:12明暗循环条件下，野生型 黑腹果蝇 通常表现出两次活动高峰，一次集中在ZT0左右，称为“早晨”峰，另一次集中在ZT12左右，称为“傍晚”峰（图3A）。早晨和傍晚的活动高峰由内源性生物钟控制，但也存在对光-暗转换的瞬时“惊跳”反应，表现为短暂的活动激增。至少需要两天的节律同步，这在耗时较长的大规模筛选中可作为最低标准，尤其适用于测量恒定黑暗条件下的自由运行周期（见下文步骤2）。然而，若研究目标是分析昼夜光暗循环中的活动模式，则建议将果蝇在光暗周期（LD）条件下维持4至5天，以获取更充分的数据。本质上，在最终数据分析中增加果蝇数量或光暗周期天数（例如，合并最后两天的运动活动数据），将获得更可靠的昼夜活动谱型及测量结果（如早晨或傍晚峰的时间点）。此外，每日活动分布会随日照长度（光周期）和温度的变化而改变。改变光周期或温度的一个主要原因是研究昼夜活动模式如何实现季节性适应（例如，Chen） 等 2007). 果蝇 也可以被每日温度周期所同步（例如 Glaser和Stanewsky 2005；Sehadova 等 2009)。温度循环的变化幅度仅为2-3°C 足以驱动活动节律的同步。
2. 在限定周期结束后，在恒定黑暗和恒定温度条件下测量果蝇的自由运行昼夜活动节律（见上文步骤1）。在LD周期的最后一天的暗期期间，可随时更改光照周期设置，使实验的下一天成为DD周期的第一天。连续采集7天的DD数据足以计算果蝇的昼夜节律周期和振幅（例如节律的功率或强度）。通常，每种基因型至少需要16只果蝇的样本量，才能获得可靠的自由运行周期。即使研究者仅关注测量昼夜活动，仍建议在DD条件下测定果蝇的自由运行周期，因为内源性周期的改变会影响LD条件下的日常活动分布。例如，具有较长内源性周期的果蝇在LD条件下通常表现出晚间活动峰的延迟（例如，见图4）。
3. 实验结束后，使用 DAM 系统软件采集的原始二进制数据将被下载至便携式存储设备（如U盘）。
4. 原始二进制数据使用 DAM Filescan102X（Trikinetics, Inc.）进行处理，在分析昼夜节律参数时，汇总为15分钟或30分钟的时间段，而在分析睡眠/静息参数时，则汇总为1至5分钟的时间段。目前，连续五分钟的不活动是果蝇中睡眠/静息的标准定义 果蝇 （Hendricks 等 2000；Ho 和 Sehgal 2005）。
5. 分析DAM系统收集的数据有多种方法，但此处仅介绍本实验室常规使用的方法。使用Microsoft Excel将不同样本组分配基因型。分别使用FaasX软件（M. Boudinot和F. Rouyer，法国国家科学研究中心，Gif-sur-Yvette Cedex）或Insomniac（基于Matlab的程序；Leslie Ashmore，美国宾夕法尼亚大学）分析昼夜节律参数（如周期和功率）或睡眠/休息参数（如睡眠百分比、平均静息片段持续时间）。

6. 典型结果

完成本实验方案后，可利用相同的数据集分析实验动物与对照动物相关的昼夜节律和睡眠参数。

昼夜节律参数分析：可使用 FaasX 生成教育图（eduction graphs），以展示果蝇在明暗循环（LD）或恒暗（DD）条件下多日的日常运动活动或平均活动情况（图3）。Drosophila melanogaster 通常表现出两次活动高峰，一次集中在 ZT0（或 CT）附近，称为“早晨”峰，另一次在 ZT12（CT 12）附近，称为“傍晚”峰。这两次活动高峰由内源性生物钟控制，即使在自由运行的 DD 条件下也能观察到（图3B）。这些活动峰的时间变化可在教育图中清晰识别，可能提示内源性生物钟特性的改变。另一个反映生物钟正常功能的特征是在 LD 周期中出现的运动活动预知性增加，即在实际的暗转亮或亮转暗过渡之前即出现活动上升（图3A，箭头所示）。这种行为在野生型果蝇中明显可见（图3A），但在无节律突变体如 per⁰ 中则缺失（图3C）（Konopka 和 Benzer，PNAS，1971）。在 per⁰ 突变体中，LD 条件下观察到的“早晨”和“傍晚”峰纯粹是对光暗条件突变的惊吓反应（即“无钟”果蝇不能预知环境变化，仅被动响应）。在 DD 条件下，行为节律的丧失更为显著，通常表现为完全失去早晨或傍晚的活动高峰（即活动与静止呈随机分布），如 per⁰ 果蝇所示（图3D）。除了教育图外，运动活动数据还可表示为双日绘图式活动图谱（double-plot actogram，FaasX），其中每一天的数据按顺序排列在每一行上，但下一行从上一行最后一天的数据开始，形成连续两日的活动模式（图4）。例如，LD1 和 LD2 绘制在活动图谱的第一行；下一行则以重复 LD2 开始，随后是 LD3，依此类推。按照此格式，整个实验期间的运动活动数据可在活动图谱中完整呈现。活动图谱可针对每只果蝇个体或每种基因型分别绘制。与教育图相比，活动图谱的一个优势在于能够清晰观察到每日活动节律周期长度的变化（图4）。除了生成教育图和活动图谱外，还可将 DD 条件下的运动活动数据提交至 FaasX，利用包括 Cycle-P 在内的多种程序计算节律周期长度。

睡眠/休息参数分析：根据目前对果蝇（Drosophila）睡眠/休息的定义（Hendricks et al. 2000），即连续五分钟不活动，可利用运动活性检测所记录的数据，并使用基于Matlab开发的程序Insomniac（L. Ashmore）分析多种睡眠参数。可以计算果蝇在不同时间间隔内睡眠所占的时间百分比，例如每小时睡眠百分比（图5A），或12小时睡眠百分比（图5B）。其他常见的可分析睡眠参数还包括平均休息片段长度（图5C）和清醒活动次数（图5D）。平均睡眠/休息片段长度用于衡量睡眠的连续性，可反映睡眠质量。清醒活动度顾名思义，是指果蝇在清醒状态下的活动水平。该参数有助于区分真正存在睡眠/休息行为异常的果蝇与因疾病或过度活跃而导致表型变化的果蝇。例如，单纯因生病而导致活动能力下降的果蝇可能表现为睡眠时间增加，但其清醒活动度相较于对照组动物会明显降低。

图1：测定运动活动节律的主要步骤流程图 果蝇. 左侧展示实验步骤，右侧提供辅助性说明。获得特定实验所需基因型果蝇所涉及的杂交和遗传操作所需时间，因实验的性质和设计不同而有所差异。标有星号（*）的两个步骤指明了成年果蝇需要接种/交配的时间范围，以产生适合实验所需日龄（1至5天）的子代果蝇。

图2：接线图，展示不同组件之间的连接方式 果蝇 使用 DAM 系统采集运动活动数据 使用一台专用计算机记录运动活动次数 果蝇活动监测仪放置在配备温度和光照（开/关）控制的培养箱内。如果照明系统的电源可连接至电源供应单元，则计算机也可用于控制培养箱内光照的开关时间（可选）。计算机与活动监测仪/培养箱之间的通信由电源供应接口单元管理。计算机、电源供应单元以及培养箱（若照明控制独立于计算机）均通过不间断电源（UPC）连接至交流电源插座，以确保在光照阶段活动监测和照明的持续进行。建议将所有电器设备连接至实验设施中的应急备用电路（如有）。

图3：使用FaasX生成的教育图，显示具有节律的野生型果蝇（携带per⁺转基因的w per⁰果蝇）(A和B)与无节律的w per⁰突变体果蝇(C和D)的每日运动活动节律。 雄性果蝇在25°C下培养，并先在12:12光照/黑暗（LD）周期条件下进行4天的同步化，随后转入持续黑暗（DD）条件下7天。对每种果蝇品系，分别测量单个果蝇（n>32）在15分钟时间窗内的运动活动水平，然后取平均值以获得代表该品系的群体活动谱。A和C图显示的是在光/暗周期的第二天和第三天（LD 2-3）取平均值后生成的活动数据，而B和D图显示的是在持续黑暗条件下的第二天和第三天（DD 2-3）取平均值后生成的活动数据。垂直条形表示在光照期（浅灰色）或黑暗期（深灰色）每15分钟时间窗内记录的活动量（任意单位）。LD教育图底部的水平条：白色表示开灯，黑色表示关灯。ZT0和ZT12分别表示光周期的开始和结束时间。DD教育图中，CT0和CT12分别表示在持续黑暗条件下主观白天的开始和结束时间，由灰色条带表示。图A中，M = 早晨峰；E = 傍晚峰。图A中的箭头表示野生型果蝇中观察到的早晨和傍晚峰的预期行为，该行为在w per⁰无节律果蝇中缺失。

图4：使用FaasX软件生成的双绘图活动图，展示具有野生型、短周期或长周期果蝇的运动活动数据。 雄性果蝇在25°C下培养，先在12:12光暗循环（LD）条件下同步4天，随后转入恒定黑暗（DD）条件下8天，利用FaasX中的Cycle-P程序计算自由运行周期（t）。本图展示了三种果蝇品系：具有野生型周期的[w per⁰; per+; 携带per+转基因的per⁰突变体]、长周期的[w per⁰; per(S47A); 携带per(S47A)转基因的per⁰突变体]以及短周期的[w per⁰; per(S47D); 携带per(S47D)转基因的per⁰突变体]（Chiu et al. 2008）。X轴表示在LD或DD条件下的ZT或CT时间，Y轴表示以15分钟为区间累加的活动计数（任意单位）。红色虚线连接实验每一天的傍晚活动峰。注意，在LD条件下，傍晚活动峰被“强制”与24小时光暗循环保持同步；而在DD条件下，自由运行周期可能偏离24小时。例如，对于具有短周期的果蝇，在DD条件下（如本图所示，按24小时时间尺度绘制），其傍晚活动时间在连续每一天都会提前；而对于具有长周期的果蝇，则表现为向右偏移。

图5：睡眠参数的量化 果蝇. 果蝇（Canton-S；CS）在标准的12:12明暗循环条件下饲养 25°C使用 Insomniac（L. Ashmore）处理数据，使用 Microsoft Excel 生成此处所示图表。为获得所示的组平均值和误差线（均值标准误），每组至少合并了 70 只果蝇的数据。（A）每小时计算的基础睡眠量；显示为一个代表性昼夜周期。（B）每 12 小时计算的代表性昼夜周期的基础睡眠量。（C）每 12 小时计算的每次休息片段的平均持续时间。（D）每 12 小时计算的觉醒活动频率。

讨论

在本方案中，我们描述了用于测量的步骤 黑腹果蝇 运动活动节律，是果蝇生物钟可靠的行为输出，被用作检测生物钟功能的标准指标。该检测方法已用于大规模筛选新的生物钟突变体（例如 Konopka 和 Benzer 1971；Dubruille 等 2009）并持续用于解析和理解生物钟功能 体内它还被用于研究果蝇的睡眠-觉醒周期，尽管最近的报告表明，与利用运动活动节律相比，视频数字分析在量化睡眠方面更为可靠（Zimmerman 等 2008）。当利用运动活动节律分析睡眠时，白天睡眠百分比往往被高估。

为确保本实验方案的成功与可重复性，必须检测在年龄、遗传背景和培养条件上尽可能一致的果蝇，因为果蝇的行为表型（如昼夜节律和睡眠/休息活动）对上述所有因素均极为敏感。若在单次实验中使用多个培养箱，需确保所有培养箱均达到预期温度，因为某些昼夜节律参数可能随温度变化而改变。在选购用于果蝇实验的培养箱时需特别注意：不同产品的性能并不相同。尽管我们不倾向于推荐特定型号，但市场上存在多种选择。查找销售果蝇培养箱公司的相关信息时，一个可靠的资源来源是 果蝇 提供的工作在 一些公司甚至出售“果蝇 “昼夜节律”培养箱，具备更多附加功能，例如已预装与Trikinetics系统兼容的线路以及温度梯度控制功能（如Tritech）。重要功能包括能够在生理温度范围内实现昼夜光照控制和良好的温度调控能力 果蝇 （约15–30°C）。培养箱的价格和尺寸差异较大，但随着Trikinetics公司新型活动监测仪的推出，即使是小型培养箱也能容纳相当数量的设备。此外，尽管可使用带湿度控制功能的培养箱，但只要放置一个盛有水的小托盘以提供湿度（50–70%即可），该附加功能并非必需。最后，尽管本方案中我们常规使用FaasX和Insomniac进行数据分析，但也存在其他可选程序和软件（Rosato和Kyriacou 2006），例如ClockLab（ActiMetrics）、Brandeis Rhythm Package（D. Wheeler，贝勒医学院，休斯顿）和MAZ（Zordan） 等 2007).

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Drosophila活动监测仪（DAM）	Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	DAM2 或 DAM5	DAM2 型号更紧凑，可在单个培养箱中容纳更多设备
DAM 系统电源接口单元	Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	PSIU9	包含 PS9-1 交流电源
光照控制器	Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	LC6
派热克斯玻璃管	Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	PGT5、PGT7 和 PGT10
塑料活动管帽	Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	CAP5	可用纱线代替塑料管帽
DAM 系统数据采集软件	Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆		提供适用于 Mac 和 PC 的版本
FaasX 软件	法国国家科学研究中心		仅适用于 Mac
Insomniac 2.0 软件	匹兹堡大学医学院		基于 Matlab 运行，可在 PC 和 Macintosh 系统上使用
具备温度与昼夜节律控制功能的环境培养箱，例如 Percival 培养箱	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	内部空间尺寸：宽度 65 cm；高度 86 cm；深度 55 cm
具备温度与昼夜节律控制功能的环境培养箱，例如 DigiTherm 加热/制冷培养箱，配备昼夜定时照明与温度控制	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	内部空间尺寸：宽度 36 cm；高度 56 cm；深度 28 cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V（应急电源备份装置）	APC	SU2200NET	输出功率容量为 1600 瓦
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
细菌培养用琼脂（Bacto Agar）	BD Biosciences	214010
TissuePrep 石蜡颗粒	Fisher Scientific	T565	熔点为 56°C–57°C
加热块	VWR international	12621-014