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采用旋转式瓶培养系统的啮齿类动物全胚胎培养方法

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DOI：

10.3791/2170

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2010年8月28日

 , 
1Division of Developmental Neuroscience, United Centers for Advanced Research and Translational Medicine (ART), Tohoku University Graduate School of Medicine, 2The Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Corporation (JST)

本文内容

摘要

全胚胎培养技术可使我们对小鼠和大鼠胚胎进行体外培养 离体 在对应于妊娠中期阶段的有限时期内进行培养。在本视频方案中，我们展示了采用旋转瓶式培养系统进行大鼠E12.5之后的全胚胎培养的标准操作流程。

摘要

全胚胎培养（Whole embryo culture, WEC）技术由New及其同事于20世纪50年代建立，并应用于发育生物学研究 1尽管哺乳动物胚胎的发育和生长在很大程度上依赖于胎盘的功能，但WEC技术使我们能够培养小鼠和大鼠胚胎 离体 在小鼠胚胎发育第6.5天至第12.5天（E6.5–E12.5）或大鼠胚胎发育第8.5天至第14.5天（E8.5–E14.5）的中段妊娠期对应阶段的有限时间段内的情况 2, 3, 4在胚胎体外培养（WEC）中，由于胚胎可在显微镜下进行操作，我们能够使用精细的玻璃毛细管直接靶向胚胎的特定区域。因此，当需要研究植入后哺乳动物胚胎的动态发育过程时，啮齿类动物的WEC是一种非常有用的技术。迄今为止，已开发出多种类型的WEC系统。 1其中，旋转式瓶培养系统最为常用，适用于小鼠 E9.5 和大鼠 E11.5 之后的中孕期胚胎长期培养。 1在本视频方案中，我们展示了使用改良型原始旋转系统（由 New 和 Cockroft 设计）进行 E12.5 以后大鼠 WEC 的标准操作流程。 5, 6，并介绍WEC技术在哺乳动物发育生物学研究中的多种应用。

方案

1. 建立 WEC 系统

  1. 在WEC系统中，将0.22 μm膜过滤器连接至进样硅胶管a)。
  2. 打开盛有O2（95%）和CO2（5%）混合气体的气瓶阀门，通过装有高压灭菌水的鼓泡瓶将混合气体通入反应釜中。
  3. 调节混合气体的流速至50 cc。
  4. 将出气硅胶管插入盛水瓶中，检查混合气体的流动情况。
  5. 以20 rpm/min的转速旋转反应釜。

2. 培养基的制备

  1. 在 37.0°C 下解冻大鼠即刻离心（IC）血清b)。将 D-葡萄糖（2 mg/ml）加入解冻后的血清中，置于已灭菌的 100 ml 烧杯内。培养基应在原代培养级别进行配制（例如，在超净工作台内操作）。
  2. 按 1:400 稀释比例，向血清中加入抗生素-抗真菌剂（100X）液体。
  3. 在室温（RT）下挥发血清中残留的异氟烷（因采血时对大鼠实施麻醉所致），持续 20 分钟c)。
  4. 使用 0.45 μm 微孔滤膜对培养基进行除菌过滤。
  5. 每瓶培养瓶中加入 3.0 ml 培养基，并用硅胶塞密封瓶口，外层包裹铝箔（参见参考文献 14）d)。
  6. 准备三至四个一次性培养皿，内含台氏盐溶液....

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讨论

在啮齿类动物的WEC操作中，有两个关键步骤对成功至关重要。首先，解剖过程必须准确，以避免损伤胚胎，尤其是血管系统。其次，操作应尽可能迅速，因为胚胎自子宫分离后，不再通过胎盘获得氧气和营养供应。这对较晚期的胚胎尤为关键。在大鼠E12.5之后的WEC操作中，应在30分钟内将解剖完成的胚胎转移至培养瓶中。

我们通过用荧光染料DiI标记少量细胞，或在野生型和突变型背景的大鼠胚胎中移植DiI标记的细胞，分析了野生型和Pax6突变型大鼠胚胎中神经嵴细胞的迁移模式7。通过用DiI标记小鼠前部神经板的神经上皮细胞并培养24小时，已绘制出小鼠前部神经板的命运图谱8。全胚胎培养（WEC）还被用于将表达GFP的细胞移植至E12.5大鼠胚胎的端脑，以研究Pax6突变型大鼠中迁移缺陷的细胞自主性9。可在培养基中添加多种抑制剂，以研究发育过程中轴形成和细胞周期所涉及的信号通路10, 11。此外，我们还可通过电穿孔将表达质粒和siRNA导入培养胚胎的发育中脑组织，以分析基因功能.......

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢伊地井一正先生在视频录制以及视频编辑方面提供的帮助和宝贵建议。同时感谢常川裕二博士和吉崎一智博士在视频录制过程中给予的协助。本研究得到了日本文部科学省青年科学家B类项目以及优先领域——分子脑科学项目的资助。我们还感谢日本文部科学省全球卓越研究中心计划“全球脑科学基础与转化研究中心”以及日本科学技术振兴机构（JST）的革新性尖端研究开发项目（CREST）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
WEC系统（10-0310）工具Ikemoto Rika010-0310另一种小型模型也可获得。
无孔硅胶塞工具Ikemoto Rika010-032-08
气体混合气瓶工具Nikko Sanso-含95%氧气 & 5% 二氧化碳。定制订单。
气体调节器工具Ono SeisakushoWR-11
0.22 μm 滤器 Millex GS工具EMD MilliporeSLGS033SS
大剪刀工具萘普生B-7H
镊子工具萘普生A-3-2
废弃培养皿（90 mm × 15 mm） 工具岩城，旭 Techno 玻璃株式会社SH90-15深底培养皿最适合解剖操作。
异氟烷试剂Abbott LaboratoriesB506用于麻醉
戊巴比妥钠试剂默克 & Co.-用于麻醉
泰罗德液’生理盐水试剂参照参考文献2中的方案。4℃保存°C.
定时妊娠的Sprague-Dawley大鼠动物查尔斯河实验室-
培养玻璃瓶工具Ikemoto Rika010-032-05
一次性培养瓶工具Ikemoto Rika010-032-06
带孔硅胶塞工具Ikemoto Rika010-032-07
铝箔工具任意供应商-
高压灭菌袋工具HogyHM-26用于培养瓶
高压灭菌袋工具HogyHM-14A用于硅胶塞
0.45 μm 滤器 Millex HA工具EMD MilliporeSLHA033SS
50 ml 锥形管工具BD Biosciences352070
100 ml 烧杯工具岩城，旭 Techno 玻璃株式会社TE-32
大鼠IC血清试剂Charles River Laboratories-参考：Kunihiko Morisaki 先生，
电话：+81-(0) 45-474-9336；传真：+81-(0) 45-474-9340
D(+)-葡萄糖试剂和光纯药工业株式会社041-00595
抗生素-抗真菌液试剂GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌15240
眼科直剪工具萘普生MB50-7用于切割子宫壁
眼科弯剪工具萘普生MB54-2用于切割卵黄囊
5号镊子 工具活力T6715
5F号镊子工具雷吉娜T6819
玻璃移液管工具使用巴斯德吸管手工制作。
高压灭菌袋工具HogyHM-4用于玻璃移液管
双目显微镜工具Leica MicrosystemsMz7s
光照工具Leica MicrosystemsCLS 150XD
油石工具Uchida Yoko833-2000用于镊子的打磨
机器油工具Uchida Yoko835-0000用于镊子的打磨

参考文献

  1. New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
  2. Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplanta....

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