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采用旋转式瓶培养系统的啮齿类动物全胚胎培养方法

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DOI：

10.3791/2170

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2010年8月28日

 , 
1Division of Developmental Neuroscience, United Centers for Advanced Research and Translational Medicine (ART), Tohoku University Graduate School of Medicine, 2The Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Corporation (JST)

本文内容

摘要

全胚胎培养技术可使我们对小鼠和大鼠胚胎进行体外培养 离体 在对应于妊娠中期阶段的有限时期内进行培养。在本视频方案中，我们展示了采用旋转瓶式培养系统进行大鼠E12.5之后的全胚胎培养的标准操作流程。

摘要

全胚胎培养（Whole embryo culture, WEC）技术由New及其同事于20世纪50年代建立，并应用于发育生物学研究 1尽管哺乳动物胚胎的发育和生长在很大程度上依赖于胎盘的功能，但WEC技术使我们能够培养小鼠和大鼠胚胎 离体 在小鼠胚胎发育第6.5天至第12.5天（E6.5–E12.5）或大鼠胚胎发育第8.5天至第14.5天（E8.5–E14.5）的中段妊娠期对应阶段的有限时间段内的情况 2, 3, 4在胚胎体外培养（WEC）中，由于胚胎可在显微镜下进行操作，我们能够使用精细的玻璃毛细管直接靶向胚胎的特定区域。因此，当需要研究植入后哺乳动物胚胎的动态发育过程时，啮齿类动物的WEC是一种非常有用的技术。迄今为止，已开发出多种类型的WEC系统。 1其中，旋转式瓶培养系统最为常用，适用于小鼠 E9.5 和大鼠 E11.5 之后的中孕期胚胎长期培养。 1在本视频方案中，我们展示了使用改良型原始旋转系统（由 New 和 Cockroft 设计）进行 E12.5 以后大鼠 WEC 的标准操作流程。 5, 6，并介绍WEC技术在哺乳动物发育生物学研究中的多种应用。

方案

1. 建立 WEC 系统

  1. 在WEC系统中，将0.22 μm膜过滤器连接至进样硅胶管a)。
  2. 打开装有O2（95%）和CO2（5%）的气体钢瓶阀门，通过装有经高压灭菌水的鼓泡瓶将混合气体通入反应釜中。
  3. 调节混合气体的流速至50 cc。
  4. 将出气硅胶管插入盛水瓶中，检查混合气体的流动情况。
  5. 以20 rpm/min的转速旋转反应釜。

2. 培养基的制备

  1. 在 37.0°C 下解冻大鼠即刻离心（IC）血清b)。在已解冻的血清中加入 D-葡萄糖（2 mg/ml），置于经高压灭菌的 100 ml 烧杯中。培养基应在原代培养阶段配制（例如，在超净台中操作）。
  2. 按 1:400 稀释比例，向血清中加入抗生素-抗真菌剂（100X）液体。
  3. 在室温（RT）下静置 20 分钟，使血清中残留的异氟烷（因采血前对大鼠麻醉所致）挥发去除c)。
  4. 使用 0.45 μm 微孔滤膜对培养基进行除菌过滤。
  5. 每瓶培养瓶中加入 3.0 ml 培养基，并用硅胶塞密封瓶口，外层包裹铝箔（参见参考文献 14）d)。
  6. 准备三至四个一次性培养皿，内含台氏盐溶液e)。

3. 大鼠麻醉及子宫分离

  1. 使用吸入性或非肠道麻醉剂对妊娠大鼠进行深度麻醉。
  2. 用70%乙醇清洁麻醉后妊娠大鼠的腹部区域。
  3. 用镊子夹起皮肤，使用大剪刀剪开皮肤，暴露腹壁f)。
  4. 用一对镊子夹住腹壁，使用大剪刀在腹壁上做大的纵向U形切口，直至胸部水平g)。
  5. 用一对镊子将肠管推向左侧，暴露连接卵巢的一侧子宫末端。
  6. 用一对镊子夹住子宫末端，使用大剪刀剪断子宫与卵巢之间的连接部位。
  7. 沿子宫另一端方向剪除子宫周围脂肪组织，将子宫从妊娠大鼠体内取出。
  8. 将子宫转移至含有Tyrode's生理盐水的培养皿中。
  9. 在取出子宫后，通过过量给予麻醉剂或颈椎脱位法处死大鼠。

4. 从子宫中取出胚胎

  1. 用台氏盐水快速冲洗子宫，然后用一对精细镊子将其转移至第二个培养皿中h)。
  2. 在双目显微镜下，用一对精细镊子夹住子宫壁，使用眼科直剪在与血管相连的子宫系膜对侧处剪开子宫壁。
  3. 将眼科直剪的尖端插入子宫壁与蜕膜之间的间隙，沿子宫非系膜侧纵向剪开子宫壁。
  4. 在子宫系膜侧将蜕膜聚拢，使用两对精细镊子将胚泡从子宫中分离出来i)。
  5. 用适当直径的无菌玻璃移液管将胚泡转移至第三个培养皿中。

5. 大鼠胚胎的解剖

  1. 将显微镊子的一端插入蜕膜，用两对镊子在胚胎周围对蜕膜进行横向切开。
  2. 将镊子尖端插入胎盘侧的蜕膜，从该处向上做两条纵向切口。
  3. 用两对镊子撕除胎盘侧的蜕膜组织，随后用两对镊子清除残留的蜕膜。
  4. 夹住瑞氏膜（Reichert's membrane），在其上做一水平切口，并从反胎盘侧将膜与胚胎结构分离。
  5. 用两对镊子在靠近胚胎头部的卵黄囊处制造一个小孔，再用一对眼科弯头剪刀剪开卵黄囊。注意避免损伤主要的血管。
  6. 用两把精细镊子夹住胚胎头部周围的羊膜，通过撕开羊膜轻柔地将胚胎从卵黄囊中拉出h)。在妊娠中期阶段，应将胚胎躯体完全拉出卵黄囊，以增加其氧气供应。

6. 整胚培养

  1. 检查胎盘、卵黄囊的损伤情况，以及心跳和血液循环的状态。
  2. 注意不要拉伸脐带，用灭菌的玻璃移液管将胚胎转移至培养瓶中。应尽量减少将泰罗德氏盐溶液带入培养瓶中。
  3. 从旋转鼓上取下无孔硅胶塞。将带有通气孔的塞子的培养瓶垂直连接到WEC系统的旋转鼓上。操作时需小心，避免对旋转鼓施加不当方向的力，因为旋转鼓是非常精密的设备。将含有已解剖胚胎的培养瓶逐一转移至培养系统中；应尽量减少打开培养箱前门的次数，以避免培养箱温度下降j)。
  4. 培养10小时后，将混合气体流量增加至75 cc，24小时后增至100 cc（表1）。
  5. 约在培养24小时后更换培养液，方法是将培养中的胚胎转移至含有新鲜配制培养液的新培养瓶中。在34小时后将气体流量增至125 cc，48小时后增至150 cc（表1）。
  6. 定期通过计数心率（例如，每分钟120–150次为最佳）和观察血液循环情况来检查培养胚胎的发育状态。必要时可在泰罗德氏盐溶液中计数体节数目以判断胚胎生长情况。在正常发育过程中，每两小时增加一个体节。
  7. 当WEC培养结束时，停止混合气体供应，并断开进气管和膜滤器，以防止气泡瓶中的液体倒流进入进气管。

7. 注意事项

  1. WEC 系统内的温度应持续保持在 37.0–37.5°C。
  2. 本实验室常规使用 100% 大鼠 IC 血清培养大鼠和小鼠胚胎，使用前保存于 -20°C。
  3. 我们所使用的大鼠 IC 血清购自经异氟烷麻醉的大鼠。
  4. 一次性培养瓶也可从 Ikemoto Rika 公司获得。培养瓶和硅胶塞应进行高压灭菌。
  5. 胚胎解剖应在室温下进行，因为在解剖过程中将胚胎暴露于过低或过高温度会影响其在 WEC 中的后续发育。
  6. 解剖工具通过干热灭菌法进行灭菌。
  7. 应分别剪开皮肤和腹壁，以尽可能避免毛发污染培养皿。我们在剪开皮肤和分离子宫时，分别更换为新的大型剪刀和镊子。
  8. 使用尖端精细的镊子对于准确解剖组织至关重要。我们通过砂轮和机械油手动打磨镊子尖端以保持其锋利。
  9. 我们使用镊子的一侧边缘如同刀具一般操作，以避免对胚胎施加过大压力。
  10. 当因频繁开门导致 WEC 系统内部温度下降时，我们持续开启照明灯以维持系统内温度。

8. 代表性结果

图1展示了大鼠胚胎的解剖步骤以及培养的大鼠胚胎。

胚胎发育阶段示意图；标签指示不同的解剖结构。
图1. E12.5 大鼠胚胎的整体胚胎培养。（A）从怀孕大鼠子宫中分离出的胚泡。（B）去除胎盘侧的蜕膜。（C）去除Reichert膜。（D）打开卵黄囊。（E）WEC开始后6小时，大鼠胚胎在培养瓶中培养。（F）培养42小时后的大鼠胚胎。d，蜕膜；R，Reichert膜；p，胎盘；ys，卵黄囊；e，胚胎。

 0 小时12 小时24 小时36 小时48 小时
E12.5 大鼠胚胎95% 50 cc95% 75 cc
(10 小时)		95% 100 cc95% 125 cc (34 小时)95% 150 cc

表1. 最佳氧气条件。

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讨论

在啮齿类动物的WEC操作中，有两个关键步骤对成功至关重要。首先，解剖过程必须准确，以避免损伤胚胎，尤其是血管系统。其次，操作应尽可能迅速，因为胚胎自子宫分离后，不再通过胎盘获得氧气和营养供应。这对较晚期的胚胎尤为关键。在大鼠E12.5之后的WEC操作中，应在30分钟内将解剖完成的胚胎转移至培养瓶中。

我们通过用荧光染料DiI标记少量细胞，或在野生型和突变型背景的大鼠胚胎中移植DiI标记的细胞，分析了野生型和Pax6突变型大鼠胚胎中神经嵴细胞的迁移模式7。通过用DiI标记小鼠前部神经板的神经上皮细胞并培养24小时，已绘制出小鼠前部神经板的命运图谱8。全胚胎培养（WEC）还被用于将表达GFP的细胞移植至E12.5大鼠胚胎的端脑，以研究Pax6突变型大鼠中迁移缺陷的细胞自主性9。可在培养基中添加多种抑制剂，以研究发育过程中轴形成和细胞周期所涉及的信号通路10, 11。此外，我们还可通过电穿孔将表达质粒和siRNA导入培养胚胎的发育中脑组织，以分析基因功能...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢伊地井一正先生在视频录制以及视频编辑方面提供的帮助和宝贵建议。同时感谢常川裕二博士和吉崎一智博士在视频录制过程中给予的协助。本研究得到了日本文部科学省青年科学家B类项目以及优先领域——分子脑科学项目的资助。我们还感谢日本文部科学省全球卓越研究中心计划“全球脑科学基础与转化研究中心”以及日本科学技术振兴机构（JST）的革新性尖端研究开发项目（CREST）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
WEC系统（10-0310）工具Ikemoto Rika010-0310另一种小型模型也可获得。
无孔硅胶塞工具Ikemoto Rika010-032-08
气体混合气瓶工具Nikko Sanso-含95%氧气 & 5% 二氧化碳。定制订单。
气体调节器工具Ono SeisakushoWR-11
0.22 μm 滤器 Millex GS工具EMD MilliporeSLGS033SS
大剪刀工具萘普生B-7H
镊子工具萘普生A-3-2
废弃培养皿（90 mm × 15 mm） 工具岩城，旭 Techno 玻璃株式会社SH90-15深底培养皿最适合解剖操作。
异氟烷试剂Abbott LaboratoriesB506用于麻醉
戊巴比妥钠试剂默克 & Co.-用于麻醉
泰罗德液’生理盐水试剂参照参考文献2中的方案。4℃保存°C.
定时妊娠的Sprague-Dawley大鼠动物查尔斯河实验室-
培养玻璃瓶工具Ikemoto Rika010-032-05
一次性培养瓶工具Ikemoto Rika010-032-06
带孔硅胶塞工具Ikemoto Rika010-032-07
铝箔工具任意供应商-
高压灭菌袋工具HogyHM-26用于培养瓶
高压灭菌袋工具HogyHM-14A用于硅胶塞
0.45 μm 滤器 Millex HA工具EMD MilliporeSLHA033SS
50 ml 锥形管工具BD Biosciences352070
100 ml 烧杯工具岩城，旭 Techno 玻璃株式会社TE-32
大鼠IC血清试剂Charles River Laboratories-参考：Kunihiko Morisaki 先生，
电话：+81-(0) 45-474-9336；传真：+81-(0) 45-474-9340
D(+)-葡萄糖试剂和光纯药工业株式会社041-00595
抗生素-抗真菌液试剂GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌15240
眼科直剪工具萘普生MB50-7用于切割子宫壁
眼科弯剪工具萘普生MB54-2用于切割卵黄囊
5号镊子 工具活力T6715
5F号镊子工具雷吉娜T6819
玻璃移液管工具使用巴斯德吸管手工制作。
高压灭菌袋工具HogyHM-4用于玻璃移液管
双目显微镜工具Leica MicrosystemsMz7s
光照工具Leica MicrosystemsCLS 150XD
油石工具Uchida Yoko833-2000用于镊子的打磨
机器油工具Uchida Yoko835-0000用于镊子的打磨

参考文献

  1. New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
  2. Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
  3. Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).
  4. Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
  5. Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
  6. New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
  7. Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
  8. Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
  9. Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
  10. Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
  11. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  12. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  13. Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
  14. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).

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