本文介绍了用于制备大鼠尾腱以进行生物力学和力生物学研究的实验步骤。演示了制备过程中主要步骤的多个关键环节，包括组织提取、横截面积测量、冲洗以及装入生物反应器腔室。
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本文内容
摘要
摘要
大鼠尾腱（RTTs）是肌腱生理学和肌腱病研究领域中常用的体外实验生物学模型。由于这些组织非常脆弱，且迄今为止尚无严格详细的分离方案，因此对其进行操作具有较大挑战性。
面对这些挑战，我们开发了多种方法和仪器，以促进对活体组织移植物（RTTs）的操作，并控制其组织活性、无菌性和完整性。本文介绍了用于准备活体组织移植物以进行生物力学和力生物学研究的实验步骤。我们的工作分为四个主要步骤：提取、横截面积测量、冲洗以及装入生物反应器腔室。
每一步均详细介绍了所有操作步骤、材料和操作方法，以便于轻松重复实验。此外，还介绍了所开发的特定仪器：用于分离RTT的操作板、在测量横截面积时用于定位组织的光学显微测微器，以及将RTT固定到生物反应器上的锚定系统。
最后，我们描述了经过多次测试后获得的结果，以验证我们的方法。活力、无菌性和完整性评估表明，我们的操作步骤足以满足对大鼠尾腱等脆弱组织进行操作的严格要求。
方案
在进行任何操作之前，必须根据所开展的实验以及可用的设备，确定将要使用的肌腱组。就我们的目的而言，选择了腹侧肌腱，因为它们体积较小，因此在测量横截面积以及将其置入生物反应器腔室时更易于操作。
请注意，所有仪器均经过高压灭菌或使用70%乙醇进行消毒。此外，每个工作台旁均放置一个装有70%乙醇的喷雾瓶，以便在每次操作前对实验人员的手套进行消毒。
第1部分：提取
切除后，应通过尾部的末端小心操作，以避免损伤组织。同时，为保持细胞活性，所有操作均在冷盐溶液中进行。
1A）材料：
- 冷盐水溶液（D-PBS）
- 碎冰
- 表面保护垫
- 切板
- 独立操作培养皿
- 2 个 500 ml 培养皿
- 2 个 2 L 玻璃培养皿
- 胶带
- 1 把镊子
- 1 把解剖镊
- 1 个镊子架
- 1 把手术剪
- 1 把手术刀
- 1 把手术剪
图 1. 带有方位标识的独立操作（“P”表示“近端”）
1B) 工作站：
- 铺开表面保护垫，并将切板放在其上。
- 将两个较大的玻璃皿各装至一半的碎冰，然后将其放置在纸上。
- 在操作板的一角贴上一块胶带，并用一个字母标记以指示近端。
- 将两个较小的玻璃皿各装至一半，并将操作板的所有凹槽中充满冷生理盐水溶液，然后将其放入盛有冰的大型玻璃皿中。
- 将所有无菌器械整齐摆放在表面保护垫上。
- 将尾部转移至其中一个盛有生理盐水溶液的玻璃皿中。
1C）操作步骤：
- 观察尾部近端的解剖结构，以区分腹侧与背侧。腹侧含有较多的肌腱以及一条血管，可通过轻轻挤压尾部产生微小血滴来确认。
- 若需提取腹侧肌腱，使用手术剪沿尾部背侧切开皮肤（若需提取背侧肌腱，则沿腹侧切开）。
- 在近端打开切口，用镊子或手指小心操作尾部两端，剥离并移除皮肤。
- 用生理盐水冲洗掉血液和毛发，并将标本转移至另一个盛有新鲜溶液的玻璃培养皿中。更换手套。
在光学显微镜下观察横切面，可见六个肌腱群。每个肌腱群中的一条肌腱连接于每节尾椎的远端，因此我们通过在椎间盘处切割，以暴露切面处的新肌腱。
图2. 大鼠尾部在光学显微镜下观察的横切面。 - 使用手术剪穿过软骨，在距离远端2-3节椎骨更短的位置进行切割。将尾部置于切割板上，用手术刀切开软组织，随后立即放回溶液中。
- 使用镊子从尾部远端拉出一根肌腱。
- 轻柔地夹住肌腱两端，将其放入独立的操作培养皿中。
重复最后两个步骤，直至无法再分离出新的肌腱；每当需要暴露新组织时，将尾部再缩短一节椎骨进行切割。
第二部分：横截面积测量7
当组织接受力学表征或刺激时，其力学性能通过将肌腱内部的力归一化为应力来描述。因此，我们需要评估横截面积。
2A）材料：
- 光学测微计
- 体视显微镜
- 数码相机
- 边缘识别与轮廓重建算法 5,6
- 冷磷酸盐缓冲液（D-PBS）
- 1 支 20-200 μL 微量移液器
- 1 把用于调节光学测微计的六角扳手
- 2 把镊子
图3. 光学测微计
2B）工作台：
- 打开软件（数码相机与算法）。
- 放置光学测微计，确保有足够的空间将肌腱装入装置中。
- 将仪器和盛有已提取肌腱的玻璃皿放置在手边附近，以便操作。
2C）操作步骤：
- 用冷生理盐水填充测量室，直至两个锚定系统均被浸没。
- 用镊子夹住肌腱两端，将其转移至测量室内。
- 通过微量移液器的抽吸作用，依次将肌腱一端拉入硅胶管中，吸液至末端伸出轴套之外。
- 拧紧轴套以压紧硅胶管，并将装置安装在体视显微镜下。
- 在105倍放大倍数下拉伸肌腱，同时观察组织，直至褶皱不再可见。再额外拉伸0.40%。
图4. 肌腱在拉伸前后105倍放大下的投影图像。 - 调整位置和焦距，确保在180°旋转过程中始终清晰观察肌腱图像。
- 每旋转10°拍摄一张照片，期间不得改变张力、焦距或位置，仅通过旋转轴完成转动操作。由于肌腱呈圆锥形，这些步骤可在肌腱的不同位置重复进行。
- 启动边缘识别与轮廓重建算法，以分析所记录的数据集。
- 松开轴套以释放肌腱，并使用微量移液器向硅胶管内吹入空气。
- 再次夹持肌腱两端，将其重新放置到操作平台上。
- 验证所获得的轮廓重建形状及横截面积数值。
第3部分：冲洗
为去除在先前操作过程中可能产生的污染，需在生物安全柜中冲洗组织。
3A) 材料：
- 冷的生理盐水溶液（D-PBS）
- 多槽操作板
- 单个操作板
- 胶带
- 2 把镊子
- 1 个镊子架
3B）工作台：
- 提前15分钟开启生物安全柜的风扇，并用70%乙醇清洁内部表面。
- 将所有器械放入生物安全柜内。
- 在每块培养板的某一角落粘贴胶带，以标识近端。
- 用无菌生理盐水填充所有凹槽。
3C）操作步骤：
- 将装有已提取肌腱的操作板放入超净台中。
- 使用镊子轻轻夹住肌腱两端，将其从原操作板中取出。
- 将肌腱浸入多槽操作板的每个槽内的生理盐水中，并轻轻搅动，从最近的槽开始，依次进行至最远的槽。
- 最后，将肌腱完全浸入一个独立的操作板中。
第4部分：装入生物反应器腔室
为避免进一步污染，以下操作也需在生物安全柜中进行。
4A) 材料：
- 生物反应器腔室 4
- 无菌锚定装置
- 1 个无菌培养皿
- 冷细胞培养基（DMEM）
- 氰基丙烯酸酯
- 2 把镊子
- 镊子架
- 0.5–10 μl 微量移液器
- 1 把直尺
图5. 生物反应器腔室
4B）工作台：
- 由于上一步骤也是在生物安全柜中完成的，移除不必要的工具将为您提供更多的操作空间。
- 将所有其他仪器移入柜内。
4C）操作步骤：
- 将锚定装置放置在操作板上，使其线轴中心对准肌腱末端，并将组织缠绕在线轴上。
- 将锚定装置翻转并握住松动的末端，确保组织仍附着在锚定装置上。翻转¾圈后停止。
- 对另一端执行相同的步骤。
- 均匀翻转两个锚定装置，直至其中心间距为6 cm1。
- 松开肌腱，将其浸入溶液中，并让锚定部分短暂干燥以增强其机械性能2-3。
- 将氰基丙烯酸酯倒入培养皿中，并用微量移液器吸取2.5μL。
- 将一滴氰基丙烯酸酯涂在缠绕的组织上，注意不要将胶水滴入生理盐水中。每端锚定装置重复操作，共施加两滴。
- 保持肌腱完全浸没在溶液中，静置5分钟，使胶水完全干燥。
- 在此期间，向腔室中加入生理盐水。
- 用生理盐水重新水化所有组织，以防止损伤。
- 仅通过操作锚定装置，将肌腱转移至生物反应器腔室中，并关闭腔室，以防止转移过程中发生泄漏和污染。
第5部分：代表性结果：
本方案的结果表明，若操作正确，我们严谨的组织分离与制备流程能够维持组织的无菌性、活性和完整性。
首先，通过采用简单且可重复的提取方法，我们能够在不破坏胶原网络的情况下提取尾部肌腱，这一点可通过提取后制备的H&E染色切片的显微分析观察到。
图6. 提取后肌腱胶原网络（5μm纵切面，H&E染色）。
随后，我们将肌腱培养长达十天并进行了无菌检测。每天将使用过的培养液接种于琼脂平板，并在37°C下孵育24小时。由于未观察到细菌生长，我们得出结论：我们的操作不会导致污染。
利用轮廓重建算法和光学千分尺，我们能够将横截面积的估算误差控制在2%以内7。
图 7. RTT 的轮廓重建。
最后，在冲洗步骤之后以及培养十二天后，我们使用哺乳动物细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit）评估了细胞活力。由于可见绝大多数细胞呈现绿色荧光（活细胞），因此可以确认我们的分离方法能够有效保持组织的活性。在将肌腱固定到生物反应器腔室后两小时，也进行了相同的检测。我们证实了固定端的脱水现象以及胶水并未扩散至两个固定点之间的组织中。
图8. 锚定点处的组织活性（绿色 = 活细胞，红色 = 死细胞）
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讨论
通过应用这些实验步骤，我们能够开展多种多样的 体外 针对此类组织的研究，例如，一项关于组织退变的研究通过对重建肌腱组织（RTTs）施加低刺激持续十天而开展。每天，我们通过非破坏性的应力松弛试验评估组织的力学性能。最终，我们能够观察到RTT的应力变化，从而分析其力学性能的演变过程。
图9. 通过松弛试验评估的RTT应力变化（第1天至第10天）。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本文由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助（资助号：299280），IRSST 为 G. Parent 提供奖学金，FRSQ 为 M. Cyr 提供本科生科研奖。我们感谢 Yoan Lemieux-Laneville 完成了视频中记录的各项操作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| D-PBS | 试剂 | Wisent Inc. | 311-410-CL | 生理盐水溶液 |
| 葡萄糖 | 试剂 | Wisent Inc. | 609-037-EL | 生理盐水溶液 1g/L |
| 抗生素-抗真菌剂 | 试剂 | Invitrogen | 15240-062 | 生理盐水溶液 1% |
| DMEM | 试剂 | Invitrogen | 12800-017 | 培养液 |
| 碳酸氢钠 | 试剂 | Wisent Inc. | 600-105-CG | 培养液 3.7g/L |
| FBS | 试剂 | Wisent Inc. | 090150 | 培养液 10% |
| 抗生素-抗真菌剂 | 试剂 | Invitrogen | 15240-062 | 培养液 1% |
| 光学显微测微尺 | 工具 | 定制 | ||
| 操作培养皿 | 工具 | 定制 | ||
| 生物反应室 | 工具 | 定制 |
参考文献
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- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
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