小鼠垂体免疫原的制备用于诱导实验性自身免疫性垂体炎

摘要

通过注射小鼠垂体蛋白提取物，可在小鼠中复制自身免疫性垂体炎。

摘要

自身免疫性垂体炎是一种由自身免疫反应引起或伴随自身免疫反应发生的垂体慢性炎症¹。传统上被认为是一种罕见疾病，但近年来报道病例显著增加。事实上，垂体炎常作为使用抗体治疗癌症患者时的一种“副作用”出现，这些抗体用于阻断T淋巴细胞表面表达的抑制性受体，例如CTLA-4²和PD-1受体。实验性自身免疫性垂体炎可通过将小鼠垂体蛋白与佐剂混合后注射小鼠而诱导产生³。在本视频文章中，我们演示了如何从小鼠垂体腺中提取蛋白质，并将其制备成适用于在SJL小鼠中诱导自身免疫性垂体炎的形式。

方案

实验方案

本实验方案的第一步是收集大量小鼠垂体。第二步是将垂体组织匀浆以制备蛋白质提取物。第三步是将这些蛋白质与油性混合物乳化。

步骤1：小鼠垂体的采集与保存

小鼠垂体位于颅底蝶骨凹陷处，该凹陷称为蝶鞍，外侧毗邻三叉神经，前部与视交叉相邻。垂体由较大的前叶以及较小的后叶和中间叶组成，平均重量为1.9 mg。垂体样本取自动物护理机构计划实施安乐死的不同品系、性别和年龄的小鼠。

为分离垂体，先将小鼠处死，解剖颅骨上方的皮肤，并用剪刀剪开颅骨。抬起脑组织以暴露垂体，随后将垂体从周围的硬脑膜分离，从蝶骨中取出，置于塑料管中，并在干冰上保存。

通常，我们使用 300 个小鼠垂体进行一次蛋白质制备，这一数量可由一人在 9 小时内采集完成。

收集完成后，含有垂体的试管应保存在 -80 °C，直至进行下一步操作。

步骤 2. 小鼠垂体蛋白的提取

1. 将匀浆缓冲液加入置于冰浴中的15 ml Falcon离心管（货号352059）中，每收集100个垂体使用250 μL缓冲液。缓冲液的离子强度应与细胞胞质内生理状态相近（0.2 M），pH为生理pH值（7.4）。我们使用磷酸盐缓冲盐水（0.161 M，pH 7.4），并添加蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，货号P8340-1ML）。
2. 在匀浆前将垂体组织加入缓冲液中，然后将Polytron匀浆器的转子（直径5 mm）置于Falcon管底部。在最大转速下匀浆30秒，同时轻轻上下移动Falcon管，保持其处于冰浴中。随后将匀浆液置于冰上静置1分钟。重复匀浆和冷却步骤两次。这种温和的匀浆方式可破碎细胞并释放胞质蛋白，同时不破坏细胞核。
3. 为去除细胞核、未破碎的组织以及不溶性物质（如结缔组织和变性蛋白复合物），在4 °C下以低速（1000g）离心匀浆液10分钟。
4. 将上清液（现称为核后上清液，PNS）小心转移至新的Falcon管中，注意勿扰动沉淀，并将PNS置于冰上保存。
5. 用原始体积的匀浆缓冲液（每100个垂体使用250 μL缓冲液）重悬沉淀，按上述方法进行匀浆和离心，然后将第二次获得的PNS与第一次的合并。
6. 将合并后的两份PNS样品分装至微量离心管中，于-80 °C保存，直至进行下一步实验。该蛋白样品可在-80 °C长期保存，但活性会逐渐下降，因此建议在制备后6个月内使用。取少量分装样品通过BCA法（Pierce，货号23225）测定蛋白产量和浓度，并通过凝胶电泳评估蛋白质量。通常情况下，使用1.5 mL匀浆缓冲液处理300个小鼠垂体可获得约60 mg蛋白，浓度约为40 mg/mL。

步骤 3. 制备用于免疫的乳剂

1. 迅速解冻实验所需的冷冻蛋白分装样品，并将蛋白浓度调整至 20 mg/mL。该蛋白提取物将按 1:1 比例与完全弗氏佐剂（CFA, Sigma F-5881）乳化，其中含有 5 mg/mL 热灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Becton Dickinson, 231141）。每只小鼠将接受含 1 mg 垂体提取物的 100 μL 乳化液。
2. 本示例适用于免疫 10 只小鼠，每只小鼠注射 100 μL 含 1 mg 垂体蛋白的乳化液。为防止制备过程中的材料损耗，额外预留两只小鼠的用量，因此共使用 12 mg 垂体蛋白。使用 2.5 mL Hamilton 气密注射器吸取上述 20 mg/mL 垂体蛋白提取物 600 μL。通过振荡重悬 CFA，再用另一支 2.5 mL Hamilton 注射器吸取 600 μL CFA。将一根 22 号微乳化针头连接并固定到装有 CFA 的注射器上。缓慢推动 CFA 注射器的推杆，使针头充满 CFA，然后将针头的另一端连接并固定到装有垂体蛋白提取物的注射器上。
3. 缓慢推动 CFA 注射器的推杆，将油相组分推入水相垂体蛋白提取物中，仅使少量混合。然后将垂体蛋白提取物注射器的推杆推回至 CFA 注射器中。重复此操作，逐步增加混合量，直至两支注射器中的全部内容物完全混合。最终获得乳白色、均匀分布的溶液，即为水包油乳化液。
4. 乳化液形成后，继续来回推动推杆至少 500 次，以确保乳化充分。完成最后一次混合循环后，1:1 的水包油乳化液即可使用，其中垂体蛋白浓度为 10 mg/mL。该乳化液需在同一天皮下注射至麻醉的 SJL 小鼠体内，具体操作详见配套的 JoVE 文章。

讨论

尽管首例自身免疫性垂体炎患者于1962年被报道⁴，但致病性的垂体自身抗原仍有待鉴定⁵。动物模型对于鉴定这些自身抗原非常有用，有助于发现可转化为临床应用的生物标志物。本文展示了一种制备垂体蛋白的简便方法，所获得的蛋白形式足以在实验动物中诱导自身免疫性垂体炎。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 毫升 Falcon 管
匀浆缓冲液
磷酸盐缓冲液
蛋白酶抑制剂混合物
Polytron 匀浆器
BCA 法	Pierce，Thermo Scientific	23225
完全弗氏佐剂’完全弗氏佐剂（CFA）	Sigma-Aldrich	F-5881
结核分枝杆菌	BD 生物科学	231141
2.5 mL Hamilton 气密注射器
22 号微乳化针头