本视频展示了如何在SJL小鼠中诱导自身免疫性垂体炎，以及如何通过组织病理学评估其严重程度。
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本文内容
摘要
摘要
通过将垂体蛋白与佐剂混合后注射到易感小鼠体内，可实验性地复制自身免疫性垂体炎1。小鼠模型使我们能够研究疾病的发生发展过程，通常能很好地模拟人类中发生的相似病理过程。对于某些自身免疫性疾病（如1A型糖尿病），已存在可自发产生类似人类疾病的小鼠模型（如NOD小鼠）。然而，对于许多其他自身免疫性疾病，仍需通过实验手段诱导模型产生。常用的方法之一是向小鼠体内注射源自目标器官的优势抗原。例如，研究自身免疫性甲状腺炎的研究人员会向小鼠注射甲状腺球蛋白2，而研究重症肌无力的研究人员则注射乙酰胆碱受体3。如果某种特定自身免疫性疾病的自身抗原尚未明确，则研究人员会注射来自该自身免疫反应靶器官的粗制蛋白提取物。对于自身免疫性垂体炎，致病性自身抗原仍待鉴定4，因此目前使用粗制垂体蛋白制剂进行诱导。在本视频文章中，我们将演示如何在SJL小鼠中诱导实验性自身免疫性垂体炎。
方案
实验方案
一旦制备好垂体免疫原（参见配套文章），将其皮下注射至SJL小鼠（The Jackson Laboratories，货号 000686）。7天后重复进行第二次相同注射。随后利用小鼠采集 体内 以及死后结果。
步骤1. 将垂体免疫原皮下注射至SJL小鼠
首先通过腹腔注射 0.5 ml 浓度为 20 mg/ml 的 2,2,2-三溴乙醇（Avertin，TCI America，T-1420）对小鼠进行麻醉。随后，在皮下注射 100 μl 垂体乳剂，该乳剂如 JoVE 2181 文章所述，含有 1 mg 垂体提取物和 0.25 mg 完全弗氏佐剂。乳剂分别注射于左侧背侧后肢区域（50 μl）和右侧腹股沟区域（50 μl）。在第 7 天，将垂体乳剂再次注射至对侧部位（右侧背侧后肢区域注射 50 μl，左侧腹股沟区域注射 50 μl）。在初次免疫后的前 3 天内每天观察小鼠，之后每周观察一次，直至处死动物，通常在初次免疫后第 28 天进行处死。
步骤2. 样本采集 体内 结果：血液检测
在小鼠仍存活时用于评估实验结果的最常用组织是血液。通常在首次免疫后14天采集血液，以检测血清中垂体抗体或其他标志物（如细胞因子和趋化因子）的水平。
按如下方法从活体小鼠采集血液。用手指牢固地抓住小鼠颈部的皮肤，并定位下颌骨后部。确定下颌骨后部位置后，使用4 mm采血针穿刺下颌下血管束。采血完成后，用酒精棉签按压穿刺部位以防止血肿形成。采集的血液在2,000g离心20分钟，随后储存于-80°C，待用时取出。
步骤 3. 死亡后结局的收集：垂体组织病理学
通常在首次免疫后28天处死小鼠。确诊自身免疫性垂体炎（EAH）所必需的主要特征是造血单核细胞浸润垂体腺。
将小鼠置于一个密闭的塑料容器中，并通入CO2进行安乐死。小鼠在容器中保留总共8分钟。安乐死后，按照配套文章所述方法采集垂体。病变的垂体表现为肿胀，并更牢固地粘附于周围的硬脑膜。使用锐利的镊子松解包围垂体的脑膜。当垂体在蝶骨上能够自由移动时，用镊子夹住垂体的一端，小心地将其提起。随后将垂体放入含有Beckstead固定液5的微量离心管中。垂体在固定液中固定过夜，用镜头纸包裹后放入包埋盒中。然后按照以下方案处理垂体：
| 站点编号 | 试剂 | 时间（分钟） | 温度（摄氏度） |
| 1 | 70% alcohol | 5 | 25 |
| 2 | 70% alcohol | 15 | 25 |
| 3 | 95% alcohol | 15 | 25 |
| 4 | 95% alcohol | 15 | 25 |
| 5 | 100% alcohol | 15 | 25 |
| 6 | 100% alcohol | 7.5 | 25 |
| 7 | 100% alcohol | 7.5 | 25 |
| 8 | xylene | 20 | 25 |
| 9 | xylene | 20 | 25 |
| 10 | xylene | 20 | 25 |
| 11 | paraffin | 30 | 58 |
| 12 | paraffin | 5 | 58 |
| 13 | paraffin | 5 | 58 |
处理后，将垂体腺包埋于石蜡中，并从每个腺体切取至少5张非连续切片（厚度为5-μm）。切片完成后，对腺体组织进行苏木精-伊红染色，并分析以量化单核细胞浸润程度。选择浸润最严重的切片进行评分。严重程度根据免疫细胞对腺垂体组织的替代或破坏范围进行主观评估：0级，无病变；1级，受累范围为2%-20%；2级，20%-30%；3级，30%-50%；4级，50%-90%；5级，超过90%。所有切片均由两名不了解切片来源的研究人员独立评分。
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讨论
已有四种技术被报道用于在实验动物中诱导垂体炎。本文所述技术，即垂体蛋白与弗氏佐剂混合后注射，是最早的一种方法，可追溯至1967年6，并在近年得到进一步改进1。其他技术包括：1992年注射可溶性风疹病毒糖蛋白7；2002年通过立体定位将腺病毒直接注射至垂体腺内8；以及2010年将一种大鼠品系的垂体腺移植至另一种大鼠品系的肾包膜下9。使用弗氏佐剂方法的主要优势在于其侵入性较小、结果更一致，尤其能够更准确地诱导出与人类疾病高度相似的垂体炎。本视频文章所描述的技术可建立一种可重复的垂体炎模型，供研究人员用于深入理解这一引人关注的疾病。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DK080351（授予PC）以及Terry和Kristine Gore家族的慷慨捐赠支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SJL小鼠（The Jackson Laboratories） | 品系 000686 | ||
| 2,2,2-三溴–乙醇（Avertin） | TCI America | T-1420 | |
| 贝克斯特德’固定剂 |
参考文献
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
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