活体鼠脑微循环显微镜使用一个封闭的颅窗口

Summary

活体显微镜，按照时间和空间在软脑膜微循环血流动力学和炎症事件。

Abstract

这一实验模型的目的是评估在急性和慢性，生理和病理的血 ​​流动力学，炎症和代谢的条件下小鼠软脑膜微循环 ，在体内荧光显微镜使用。左parieto枕的老鼠的大脑皮层放置在一个封闭的颅窗口。通过使用EPI和荧光照明，测量血管直径和红细胞（RBC）的执行速度的窗口局部微循环是实时记录。使用实时交叉相关性和/或荧光标记的红细胞，红细胞流速测量。白细胞和血小板粘附到软脑膜血管灌注和血管渗漏的评估与荧光标记的标记，如白蛋白- FITC和抗CD45 - TxR还抗体帮助。可以反复录像在几天微。我们用于第一次关闭窗口脑活体显微镜研究软脑膜微循环的动态变化，并跟随在安卡疟原虫感染小鼠当然，显示CM的表达与微循环功能障碍的特点是由血管收缩，减少血液中的深刻流，并最终血管崩溃。

Protocol

1。开颅手术

需要提前¹如前所述，除了一个钛棒是不是动物的头放在一个开颅手术在8到10周大的老鼠。慢性颅窗口是一个稳定的准备允许甚至几个月后，被植入的软脑膜微循环检查。通常情况下，我们执行2-3周后颅窗口植入我们的研究。

2。活体显微镜

1. 开颅手术后两三个星期，体温检查，然后鼠标轻轻麻醉与异氟醚（归纳为4％，维持1-2％）。浅麻醉是用来防止动物在实验过程中的压力和不适。
2. 动物俯卧位，然后放置在一个立体的框架，并仔细担保使用耳酒吧头。使用左，右杠杆水平调整。使用电热垫保持核心体温。由于小鼠脑型疟疾的发展低温，温度设定需要调整每个动物。
3. 颅窗口盖玻片，轻轻地用棉签蘸用矿物油和立体显微镜和一台数码相机（尼康Coolpix 995，日本）的帮助下采取的一个窗口下的船只的全景照片，清洗。 ，图像打印，确定并注明日期，并将于血管直径和红细胞（RBC）的速度测量的地图。
4. 鼠标，然后转移到一个活体显微镜阶段（定制徕卡麦克贝恩，加利福尼亚州圣迭戈）。一滴水是利用牙科丙烯酸形成颅窗口，重点是调整。测量是使用20X（LUMPFL"世界投资报告"，数值孔径0.6，奥林巴斯）水浸泡的目的。遵循相同的船只，这样可以允许小样本人群更强大的统计，其基准水平的直接比较。用一个数字低光高速摄像机（滨松C9300 - 221，日本），或低光模拟摄像机（4815 COHU....

Discussion

这里描述的活体显微镜方法，提供了一个在小鼠软脑膜微循环的详细观察独特而强大的工具。它允许挑出个别动脉和静脉和测量的一些参数如血管直径，红细胞速度，血流量，坚持和白细胞，血小板和其他血液成分，血管渗漏，组织pH值及PO2滚动的变化和潜在的许多其他应用。 在体内的血管反应，可及时进行评估后，如药品监督管理局的干预，或在病理过程。此外，微循环的行为，可以动态地跟进，随着时间的推移。我们已经利用这种技术研究在脑型疟疾的软脑膜微循环的变化而引起的 P. 疟原虫 ANKA鼠标，并已表明，在此模型中的神经综合征是与脑血流量减少，血管收缩，灌注受损，最终血管^塌陷 6的特点是微循环障碍。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc. 公司
碳菁染料 Dil	分子探针，Life Technologies	D306
白蛋白-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
抗 CD45-TxR 抗体	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865