使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

摘要

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。

摘要

该实验模型旨在利用以下方法评估小鼠软脑膜微循环在急性和慢性、生理及病理生理状态下的血流动力学、炎症和代谢情况， 体内 荧光显微镜。在小鼠左侧顶枕皮层上方植入封闭式颅窗。通过该颅窗，利用落射照明和荧光照明实时记录局部微循环，并对血管直径和红细胞（RBC）流速进行测量。红细胞流速采用实时互相关法和/或荧光标记的红细胞进行测定。借助荧光标记的示踪剂（如Albumin-FITC和抗CD45-TxR抗体），可观察白细胞和血小板在软脑膜血管上的黏附情况，并评估灌注状态和血管渗漏。微循环可在数天内多次进行视频记录。我们首次应用封闭颅窗活体显微技术研究软脑膜微循环，以动态观察疾病进程中发生的各项变化 疟原虫伯氏疟原虫 在小鼠中进行 ANKA 感染，并表明 CM 的表达与微循环功能障碍相关，其特征为血管收缩、血流显著减少，最终导致血管衰竭。

方案

1. 开颅手术

需要提前对8至10周龄的小鼠进行开颅手术，操作步骤如前所述¹，但不将钛棒植入动物头部。慢性颅窗是一种稳定的制备方法，可在植入后数月内持续观察软脑膜微循环。通常，我们在颅窗植入术后2至3周进行实验研究。

2. 活体显微成像

1. 开颅术后两到三周，检测小鼠体温，随后使用异氟烷进行轻度麻醉（诱导浓度4%，维持浓度1-2%）。采用轻度麻醉旨在防止实验过程中动物产生应激反应和不适。
2. 动物随后被置于立体定位仪上，呈俯卧位，并使用耳杆仔细固定头部。通过左右杠杆调节水平。使用加热垫维持核心体温。由于患脑型疟疾的小鼠会出现低体温，因此需要针对每只动物调整温度设置。
3. 用浸有矿物油的棉签轻轻清洁颅窗上的盖玻片，借助体视显微镜和数码相机（Nikon Coolpix 995，日本）拍摄窗下血管的全景图像。将图像打印并标注标识与日期，用于后续测量血管直径和红细胞（RBC）流速时作为定位参考图。
4. 将小鼠转移至活体显微镜载物台（定制 Leica-McBain，加利福尼亚州圣地亚哥）。利用牙科丙烯酸树脂形成的凹槽，在颅窗上滴加一滴水，调节焦距。使用20倍水浸物镜（LUMPFL-WIR，数值孔径0.6，Olympus）进行测量。持续观察同一血管，以便与基线水平进行直接比较，从而在小样本群体中获得更可靠的统计结果。图像通过数字低照度高速相机（Hamamatsu C9300-221，日本）或低照度模拟相机（COHU 4815，加利福尼亚州圣地亚哥）采集，相机连接至录像带记录仪（JVC，日本）、时间戳设备（MicroImage Video Systems，宾夕法尼亚州博伊尔敦）和彩色监视器（PELCO，加利福尼亚州克洛维斯）。在开始录制前对录像带进行正确标识，时间戳可记录事件发生的时间段，便于后续识别所记录的事件。
5. 首先检查血管以评估制备质量，并确认血液是否在所有血管中流动。然后选择待测量的血管，应包括不同直径的微静脉和微动脉（在我们的小鼠软脑膜制备中，大多数血管直径介于20至80μm之间），并覆盖窗体暴露区域内不同位置的血管。通过观察血管分支处血流方向（即血流是向外分布还是向内汇集），可轻松区分微动脉与微静脉。在我们的研究中，共对12条血管进行测量。每个测量位点的精确位置均在软脑膜血管图像上标注。
6. 对于每个位点，使用图像剪切仪（Image Shear，Vista Electronics，San Diego，CA）测量血管直径。²选定位置后，将血管图像调整至垂直位置，并对图像进行剪切，直至相对的边缘对齐，记录此时的读数。通过使用测微尺校准台（Reticle Calibration Stage Micrometer，Edmund Optics Inc.，Barrington, NJ）对每种特定放大倍数进行预先校准，可将该数值转换为微米。
7. 每次记录至少持续30秒，以追踪红细胞。追踪时采集血液样本，使用羰基氰染料Dil（Molecular Probes，Carlsbad，CA）对红细胞进行荧光标记，并通过尾静脉输注，以获得 体内 浓度约为 0.4–0.5%³在感染的动物中 疟原虫伯氏疟原虫 表达绿色荧光蛋白的 ANKA（PbA）（PbA-GFP，由马里亚疟疾研究与参考试剂资源中心 MR4，Manassas, VA 提供，CJ Janse 和 AP Waters 捐赠），无需灌注标记细胞。视频图像以每秒 150 帧的速度记录。该速率设置旨在使每个视频帧中捕获一个至六个细胞图像，以测定最高达 8 mm/s 的细胞运动速度。视频图像通过个人计算机使用 Adobe Premier 4.0 软件进行数字化处理，并利用 SigmaScan Pro 4.0 软件（SPSS，Chicago, IL）获取每个细胞图像的 x-y 坐标数据。⁴细胞位置通过人工确定，而非图像分析，因为训练有素的观察者肉眼即可对细胞中心位置作出良好估计，该位置通常与大多数细胞取向下观察到的荧光最强位置相一致。对每个细胞进行多次位置和速度测定，并取平均值以获得红细胞平均流速。
8. 当离线进行红细胞流速测量时，每只小鼠的总观察时间不超过10–15分钟，以尽量减少麻醉对心脏的抑制作用。
9. 一旦获得血管直径和红细胞流速的测量值，即可使用以下公式计算每条血管中的血流量：Q = V × π(D/2)²²，其中 Q = 血流量，V = 红细胞流速，D = 血管直径。
10. 这些操作可随时间重复进行。例如，在小鼠脑型疟疾模型中，我们从感染后第4天开始进行每日测量。每只小鼠每天获得的数值均以第0天（感染前）为基准进行归一化处理，第0天的数值定义为100%。
11. 除了血管直径和血流测量外，还可进行其他评估，例如对灌注情况进行更精确的评估，以及分析白细胞和/或血小板在软脑膜血管中的滚动与黏附。这些测量可通过荧光标记物辅助完成。在疟疾研究中，还可利用表达GFP的PbA菌株检测循环或黏附的疟原虫。
12. 为评估灌注情况，我们使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的白蛋白溶液（Sigma，St Louis, MO，每只小鼠50 μg），为量化白细胞在软脑膜血管上的黏附，我们使用与德克萨斯红（TxR）标记的全白细胞标志物CD45抗体（Invitrogen，Carlsbad, CA，每只小鼠4 μg）。具体操作中，将25 μL白蛋白-FITC溶液（2 mg/mL）与20 μL抗-CD45-PE抗体溶液（200 μg/mL）混合后，注入预热的尾静脉。注射后可立即进行成像；但若需测量渗漏，则让白蛋白-FITC循环15分钟后再成像。白蛋白-FITC和GFP（PbA-GFP感染性红细胞）发射的绿色荧光（518 nm）通过ALPHA Vivid: XF100-2滤光片（Omega Optical, Brattleboro, VT）进行激发与采集，而抗-CD45-TxR荧光（615 nm）则使用Vivid Standard: XF42滤光片进行激发与采集。
13. 荧光标记的白蛋白可实现对血管网络（包括穿支血管）的更佳可视化，在脑型疟疾等疾病状态下，特别有助于检测无灌注或低灌注的血管。此外，该方法还可用于评估血管渗漏。⁵.
14. 荧光标记的抗CD45抗体可便于识别和定量白细胞在软脑膜血管上的滚动和黏附。为避免定量过程中的偏倚，我们在预先设定用于测量血流的同一位置进行白细胞滚动和黏附的定量。白细胞黏附的定量方法是在100 μm血管长度内计数白细胞的数量。白细胞滚动的定量方法是在30秒内，计数在同一100 μm血管长度中移动速度显著慢于血流速度的白细胞数量。

3. 代表性结果

图 1.（步骤 2.6） 通过颅窗观察到的小鼠软脑膜血管网络图像。

图 2.（步骤 3.1–3.5） 小鼠软脑膜微循环活体显微观察实验装置示意图。1：活体显微镜；2：20倍水浸物镜；3：光源；4a：数字低照度高速相机；4b：模拟相机；5：固定于立体定位架上的小鼠；6：计算机显示器；7：模拟剪切图像显示器，显示如何通过图像剪切法（箭头）测量血管直径。

图 3.（步骤 3.6–3.8） 通过高速荧光录像中红细胞的追踪测量微血管内红细胞流速。图片 A 至 F 为一条软脑膜血管的连续图像，显示单个红细胞穿过相机限定的显微视野。通过手动确定 15 个或更多红细胞在视野中逐帧移动的位置，并结合预先校准的距离，可借助 Excel 电子表格计算每条血管中的平均红细胞流速。

图4.（步骤3.9） 一项代表性实验数据，显示恶性疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei ANKA, PbA）感染小鼠（n = 5）与未感染对照小鼠（n = 5）随时间变化的软脑膜血流情况。对照组小鼠的软脑膜血流随时间相对稳定，而PbA感染小鼠在脑型疟疾发病时（第6天）血流显著下降。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。

图5.（步骤4.3） 通过抗CD45-Texas Red荧光抗体染色显示，感染了Plasmodium berghei ANKA的小鼠软脑膜血管上黏附有大量的白细胞。

讨论

此处描述的活体显微成像方法为详细观察小鼠软脑膜微循环提供了一种独特而强大的工具。该方法可单独识别单个微动脉和微静脉，并测量多种参数的变化，包括血管直径、红细胞流速、血流量、白细胞、血小板及其他血细胞的黏附与滚动、血管渗漏、组织pH值和pO₂值，以及潜在的其他多种应用。 体内 血管反应可在药物干预或病理过程中迅速评估。此外，微循环行为可随时间进行动态追踪。我们已利用该技术研究由脑型疟疾引起的软脑膜微循环变化 P. berghei 在小鼠中研究 ANKA，并已证明该模型中的神经系统综合征与微循环功能障碍相关，其特征为脑血流量减少、血管收缩、灌注受损，最终导致血管衰竭⁶.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
碳菁染料 Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
白蛋白-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
抗-CD45-TxR 抗体	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865