利用全叶片成像技术评估活体细菌细胞诱导的气孔响应

摘要

我们已开发出一种简单且可重复的实验方案，用于检测气孔对活细菌的响应。与先前报道的表皮撕片法相比，该方法最大限度地减少了对叶片的损伤和操作。

摘要

气孔是植物表皮上自然形成的开孔，负责植物内部与外界环境之间的气体交换。气孔由一对保卫细胞构成，这些细胞能够响应多种外界因素（包括光照强度、二氧化碳浓度和相对湿度（RH））而关闭气孔孔口。气孔孔口也是病原体侵入叶片的主要途径，是病害发生的关键步骤。最近的研究揭示，在拟南芥（Arabidopsis）植物中，气孔关闭能有效抑制细菌性病害的发展，这是植物先天免疫的重要组成部分。此前，我们曾使用表皮条来评估保卫细胞对活细菌的反应（Melotto et al. 2006）；然而，同时维持植物表皮条和细菌细胞处于适宜环境条件一直具有挑战性。在电生理实验中，可通过MES缓冲液（10 mM KCl，25 mM MES-KOH，pH 6.15）使叶片表皮保持存活和健康状态；但该缓冲液不适合用于制备细菌悬浮液。另一方面，细菌可在水中保持活性，但水环境无法长期维持表皮条的存活。当表皮条漂浮在水面上时，暴露于空气中的表皮细胞在4小时内即会干燥，从而限制了实验操作的时间窗口。一种理想的评估特定刺激对保卫细胞影响的方法，应尽可能减少对气孔生理及植物自然环境的干扰。因此，我们开发了一种新的方法，用于评估保卫细胞对活细菌的反应，该方法极大减少了对叶片的损伤和操作，旨在提供一种易于重复且可靠的气孔检测方法。该方案基于用碘化丙啶（propidium iodide, PI）对完整叶片进行染色，随后将染色叶片与细菌悬浮液共孵育，并在激光扫描共聚焦显微镜下观察叶片。最终，该方法允许在接近植物遭受病原体侵袭的自然条件下，对同一活体叶片样本进行长时间的连续观察。

方案

1. 植物培养与细菌制备

1. 开始本实验时，将拟南芥（Arabidopsis）种子播种于体积比为1:1:1的培养基混合物中（Redi-earth育苗基质、Sun Gro公司产品）、细蛭石和珍珠岩。
2. 将植株置于生长室中培养（22°C，每日光照12小时，光照强度为100 μmol/mm²/sec，相对湿度65±5%），根据需要浇水。植株生长4–6周后，于抽薹前出现幼嫩且完全展开的叶片时即可用于实验。
3. 实验开始前两天准备细菌培养物。从甘油保存液中取出丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）划线接种至改良LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl，pH 7.0，含1.5%琼脂），于28°C培养24小时。使用新鲜培养物制备接种液，并始终从甘油保存液中直接接种培养平板，因为细菌在多次传代后毒力会减弱。
4. 用平板上生长的细菌接种10 mL液体培养基，在50 mL三角烧瓶中培养丁香假单胞菌（P. syringae）。于28°C剧烈振荡培养过夜，直至其在600 nm处的光密度（OD）达到0.8至1.0。
5. 测定600 nm处的OD值，然后在1360 ×g离心10分钟收集菌体。将菌体沉淀重悬于蒸馏水中，调节最终OD值为0.2。此OD值相当于10⁸菌落形成单位（CFU）/mL。待细菌准备就绪后，继续进行叶片处理并开展检测。

2. 叶片染色及与细菌共孵育

1. 为了对叶片进行染色，首先配制20 μM的碘化丙啶（propidium iodide，PI）水溶液。每次染色3片小型叶片，10 mL溶液已足够。
2. 从生长室中取出植株，用镊子取下3片幼嫩且完全展开的叶片。将整片叶片浸入PI溶液中5分钟，随后取出叶片，并用蒸馏水短暂冲洗。
3. 接着将叶片下表面朝下放置于显微镜载玻片上，用锋利的剃刀刀片将叶片切成四段，避开主脉，使叶片能平整地贴附在载玻片上。
4. 为使细菌与叶片共孵育，将300 μL细菌悬浮液加至载玻片上的叶片下方，确保叶片下表面与接种液充分接触。
5. 将样品置于与植物培养条件相同的环境中孵育。当需要在显微镜下观察叶片时，将叶片转移至新的载玻片上，下表面朝上。注意封片时无需使用盖玻片。同一叶片样品可在孵育期间多次成像，具体时间点可根据研究目的设定。

3. 显微镜观察、测量与数据分析

1. 此处使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM 510 Meta，Carl Zeiss Inc.）观察叶片。观察叶片下表面，检测PI的荧光（激发波长453 nm，发射波长543 nm和620 nm）。
2. 利用相同的叶片样品，随时间采集气孔图像。保存图像用于测量气孔开口宽度。
3. 使用LSM图像浏览器，在每个时间点对每种处理至少测量60个气孔的开口宽度。
4. 计算气孔开口宽度的平均值和标准误差。结果的统计学显著性可采用双尾配对t检验进行分析。

4. 细菌孵育后气孔响应的代表性图像

1. 这是一张典型的激光扫描共聚焦显微镜明场下（使用20倍物镜）观察的拟南芥（Arabidopsis）叶片表面的显微图像（图1）。
2. 碘化丙啶可染色活细胞的细胞壁，从而增强保卫细胞的可见性，并有助于识别未受损的细胞以进行数据采集（图2）。这些显微图像中可观察到一系列气孔孔径的开张状态，从完全关闭的气孔到充分开放的气孔均有呈现。
3. 完全关闭的气孔可通过保卫细胞的形态进行识别（图3），其孔径宽度被定义为0 μm。
4. 对于开放的气孔（图4），其孔径宽度通过在气孔孔口最宽处绘制一条直线进行测量。
5. 这些是本气孔开闭实验的典型结果。将拟南芥（Arabidopis）叶片在黑暗条件下与三种不同菌株的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）共孵育。只有Pst DC3000菌株能够打开在黑暗中关闭的气孔，该结果基于每种细菌菌株随机选取的60个气孔的孔径宽度测量得出（图5）。

图1. 表面的显微照片 拟南芥 叶片 使用20倍物镜在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下观察叶片表面的一个视野。注意，与经碘化丙啶染色辅助的荧光观察视野（图2）相比，气孔开度在此处不甚明显。

图2. 碘化丙啶染色后表面的显微照片 拟南芥 叶片 使用20倍物镜在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下观察的叶片表面一个视野。注意气孔开度的差异。黄色箭头指向完全关闭的气孔，绿色箭头指向充分开放的气孔。

图3. 通过保卫细胞的形态及细胞间开口判断完全闭合的气孔。 裂缝宽度视为 0 μm。

图4. 开放的气孔，显示气孔开口宽度（单位：μm）。 测量方法为在气孔孔口最宽处沿直线绘制线段，并基于该线段使用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）浏览器进行测量。

图5. 与三种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）菌株DC3118、DB29和DC3000共孵育的拟南芥（Arabidopsis）叶片气孔开度。 实验期间植株保持在黑暗条件下。结果以均值（n=50–70）±标准误差表示。采用双尾Student t检验检测统计学显著性。该实验重复进行了三次，结果一致。

讨论

我们介绍了一种直接的方法，用于在完整叶片组织中测量气孔开度，从而便于轻松评估气孔对不同处理的响应。

尽管我们使用拟南芥/丁香假单胞菌（Arabidopsis/Pseudomonas syringae）这一模式系统展示了实验结果，但完整的叶片气孔测定法原则上可适用于任何植物-细菌组合。该实验方案可轻松修改，以适应其他植物和细菌病原体的生长需求。其基本原理和操作流程保持不变。此外，该方法可能有助于研究人员在维持叶片自然环境的条件下，研究保卫细胞对活体微生物以及其他刺激物和化学试剂所产生的功能响应。

由于叶片较厚且表面不平整，对完整叶片进行成像可能较为困难。通过去除叶片的主脉使其在载玻片上平整展开，并结合共聚焦显微镜技术，可缓解这一问题。然而，也可使用其他类型的荧光显微镜获取叶片表面的高分辨率图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4864
胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP1421-1
酵母提取物	Difco Laboratories	0127-01-7
氯化钠	VWR international	7647-14-5
琼脂	Bio Express	J637-2500G
植物生长箱
摇床培养箱
激光扫描共聚焦显微镜