测试配体裂解肽对白蚁肠道原生动物的杀原虫活性 体外 （原生动物培养）和 体内 （白蚁后肠的显微注射）

摘要

我们介绍了利用荧光显微镜证明配体结合于台湾乳白蚁肠道内纤维素消化原生动物表面膜的方法，并展示了将配体与裂解肽偶联可杀死这些原生动物的实验流程。 体外 （厌氧原生动物培养）和 体内 （注射至白蚁后肠）

摘要

我们正在开发一种新型的地下白蚁防治方法，该方法将减少对化学杀虫剂的依赖。地下白蚁依赖于工蚁后肠中的原生动物来高效消化木材。溶细胞肽已被证明可杀死多种原生寄生虫（Mutwiri 等 2000）以及中国台湾地下白蚁肠道中的原生动物， Coptotermes formosanus （Husseneder 和 Collier，2009）。裂解肽是真核生物非特异性免疫系统的一部分，可破坏微生物的细胞膜（Leuschner 和 Hansel，2004）。大多数裂解肽不太可能对高等真核生物造成伤害，因为它们不会影响含有胆固醇且电性中性的高等真核生物细胞膜（Javadpour 等 1996年）。通过添加配体，可将溶细胞性肽的作用靶向特定细胞类型。例如，Hansel 等 (2007) 报道指出，与癌细胞膜受体配体偶联的裂解肽可用于破坏乳腺癌细胞，而单独使用的裂解肽或与非特异性肽偶联的裂解肽则无效。裂解肽还曾被偶联至可结合肿瘤细胞受体的人类激素，以靶向杀伤前列腺癌和睾丸癌细胞（Leuschner 和 Hansel 2004）。

本文介绍了一种用于验证溶细胞肽（Hecate）与可结合中国台湾乳白蚁工蚁肠道原虫表面膜的七肽配体偶联后所表现出的杀原虫活性的技术。这些技术包括从工蚁中切除肠道、肠道原虫的厌氧培养Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi），显微镜下证实，用荧光染料标记的配体可结合于白蚁肠道原生动物及其他自由生活的原生动物，但不结合于细菌或肠道组织。我们还证明，同一配体与裂解肽偶联后可有效杀死白蚁肠道原生动物 体外 （原生动物培养）和 体内 （显微注射至工蚁后肠），但其杀菌效果弱于单独使用的裂解肽。原生动物的丧失会导致白蚁在不到两周内死亡。

未来，我们将对微生物进行基因改造，使其能够在白蚁后肠内存活，并作为“特洛伊木马”在白蚁群体中传播，表达能够杀灭白蚁肠道中原生动物的配体裂解肽，从而导致整个群体的白蚁死亡。配体裂解肽也可能对针对原生动物寄生虫的药物开发具有应用价值。

方案

实验1：在厌氧条件下提取白蚁肠道原生动物

1. 在手套箱中使用风扇箱（Coy Laboratories），通过干燥剂和D型催化剂Stak-Paks持续循环空气，以控制湿度和氧气水平，并消除温度不均。用持续的氮气流填充手套箱20至30分钟。使用氧气传感器（C-squared, Inc.）监测氧气水平1小时。必要时使用氮气达到并维持厌氧条件。
2. 制备Trager U培养基（Trager 1934），调节pH至7.0。在手套箱中，用含2.5%氢气、5%二氧化碳和92.5%氮气的混合气体对过滤除菌的培养基鼓泡处理1小时，以去除残留氧气。
3. 使用Sigmacote对实验中使用的所有材料（包括显微镜载玻片、微量离心管、移液器、玻璃器皿等）进行硅烷化处理，以防止原生动物或肽类吸附到表面（Sigmacote，Sigma，# SL-2，http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/ Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf）。
4. 由于白蚁肠道原生动物为严格厌氧生物，不得暴露于氧气中。因此，以下步骤均需在手套箱内的厌氧条件下进行（见1.1）。用镊子将一只工蚁整体浸入70%乙醇中，轻轻旋转约10秒，以去除表面污染物。
5. 将工蚁从乙醇中取出，在洁净的Kimwipe纸上晾干约20秒。用无菌细头镊子夹住工蚁腹部，再用另一对镊子....

讨论

配体裂解肽已成功用于有效靶向并破坏癌细胞（Hansel 和 Leuschner 2004，Hansel 等. 2007）。基于这一概念，我们开发了一种七肽配体，该配体可结合台湾乳白蚁肠道中原生动物的表面，并将其与一种裂解肽偶联，旨在破坏这些白蚁肠道内必需的纤维素消化共生体，从而实现对白蚁的控制（Husseneder 和 Collier 2009）。

我们成功证实了配体与台湾乳白蚁肠道内三种原生动物的结合 体外 和 体内 通过使用带有荧光探针（EDANS）且发射光在蓝色范围内的配体进行检测。然而，白蚁肠道腔内木屑颗粒以及原生动物摄取的木屑所产生的自发荧光会干扰特异性结合的检测。尽管有经验的观察者能够区分荧光标记配体的信号与自发荧光（图4），但某些改进措施可使信号检测更为简便。我们建议使用远红光谱范围的荧光染料（例如 mPlum，Clontech Laboratories Inc.），因为在该波段，白蚁肠道及木屑颗粒的自发荧光显著减弱。

我们发现，低浓度的配体裂解肽可杀死台.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
厌氧手套箱	Coy Laboratories, Inc.	定制
Intellus 环境控制器	Percival Scientific, Inc.	I36NL
PC-10 玻璃微量移液器拉制仪	Narishige International	PC-10
玻璃针（型号 GD-1，1 X 900 mm）	Narishige International	GD-1
Leitz 显微操作器	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
显微注射仪	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
LEICA 荧光成像系统	Leica Microsystems	DMRxA2
LEICA 解剖显微镜	Leica Microsystems	MZ16
LEICA 显微镜	Leica Microsystems	DMLB
Olympus 解剖显微镜	Olympus Corporation	SZ61