我们介绍了利用荧光显微镜证明配体结合于台湾乳白蚁肠道内纤维素消化原生动物表面膜的方法，并展示了将配体与裂解肽偶联可杀死这些原生动物的实验流程。 体外 （厌氧原生动物培养）和 体内 （注射至白蚁后肠）
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方法文章
测试配体裂解肽对白蚁肠道原生动物的杀原虫活性 体外 （原生动物培养）和 体内 （白蚁后肠的显微注射）
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
我们正在开发一种新型的地下白蚁防治方法，该方法将减少对化学杀虫剂的依赖。地下白蚁依赖于工蚁后肠中的原生动物来高效消化木材。溶细胞肽已被证明可杀死多种原生寄生虫（Mutwiri 等 2000）以及中国台湾地下白蚁肠道中的原生动物， Coptotermes formosanus （Husseneder 和 Collier，2009）。裂解肽是真核生物非特异性免疫系统的一部分，可破坏微生物的细胞膜（Leuschner 和 Hansel，2004）。大多数裂解肽不太可能对高等真核生物造成伤害，因为它们不会影响含有胆固醇且电性中性的高等真核生物细胞膜（Javadpour 等 1996年）。通过添加配体，可将溶细胞性肽的作用靶向特定细胞类型。例如，Hansel 等 (2007) 报道指出，与癌细胞膜受体配体偶联的裂解肽可用于破坏乳腺癌细胞，而单独使用的裂解肽或与非特异性肽偶联的裂解肽则无效。裂解肽还曾被偶联至可结合肿瘤细胞受体的人类激素，以靶向杀伤前列腺癌和睾丸癌细胞（Leuschner 和 Hansel 2004）。
本文介绍了一种用于验证溶细胞肽（Hecate）与可结合中国台湾乳白蚁工蚁肠道原虫表面膜的七肽配体偶联后所表现出的杀原虫活性的技术。这些技术包括从工蚁中切除肠道、肠道原虫的厌氧培养Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi），显微镜下证实，用荧光染料标记的配体可结合于白蚁肠道原生动物及其他自由生活的原生动物，但不结合于细菌或肠道组织。我们还证明，同一配体与裂解肽偶联后可有效杀死白蚁肠道原生动物 体外 （原生动物培养）和 体内 （显微注射至工蚁后肠），但其杀菌效果弱于单独使用的裂解肽。原生动物的丧失会导致白蚁在不到两周内死亡。
未来，我们将对微生物进行基因改造，使其能够在白蚁后肠内存活，并作为“特洛伊木马”在白蚁群体中传播，表达能够杀灭白蚁肠道中原生动物的配体裂解肽，从而导致整个群体的白蚁死亡。配体裂解肽也可能对针对原生动物寄生虫的药物开发具有应用价值。
方案
实验1：在厌氧条件下提取白蚁肠道原生动物
- 在手套箱中使用风扇箱（Coy Laboratories），通过干燥剂和D型催化剂Stak-Paks持续循环空气，以控制湿度和氧气水平，并消除温度不均。用持续的氮气流吹扫手套箱20至30分钟。使用氧气传感器（C-squared, Inc.）监测氧气水平1小时。必要时使用氮气达到并维持厌氧条件。
- 制备Trager U培养基（Trager 1934），调节pH至7.0。在手套箱中，用含2.5%氢气、5%二氧化碳和92.5%氮气的混合气体对过滤除菌的培养基鼓泡处理1小时，以去除残留氧气。
- 使用Sigmacote对实验中使用的所有材料（包括显微镜载玻片、微量离心管、移液器、玻璃器皿等）进行硅烷化处理，以防止原生动物或肽类吸附到表面（Sigmacote，Sigma，# SL-2，http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf）。
- 由于白蚁肠道原生动物为严格厌氧生物，不得暴露于氧气中。因此，以下步骤均需在手套箱内的厌氧条件下进行（见1.1）。用镊子将一只工蚁整个浸入70%乙醇中，轻轻旋转约10秒，以去除表面污染物。
- 将工蚁从乙醇中取出，在干净的Kimwipe纸上晾干约20秒。用无菌细尖镊子夹住工蚁腹部，再用另一对镊子夹住腹部末端，以45度角轻柔地向上或向下拉出肠道。若以直角用力拉扯，肠道易断裂。将10条肠道置于载玻片上100 μl Trager U培养基液滴中。
- 用一对无菌细解剖探针刺破肠道，释放原生动物，并用200 μl移液器将肠道内容物轻柔转移至含有900 μl Trager U培养基的1 ml微量离心管中。静置5秒使肠壁碎片沉降后，将900 μl上清液转移至新管中。
- 取10 μl原生动物培养物置于硅烷化处理过的显微镜载玻片上，在200倍显微镜下检查原生动物状态。
- 按照供应商推荐的培养基，制备好氧原生动物Tetrahymena pyriformis、Amoeba sp.、Euglena sp.和Paramecium sp.（Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC）以及大肠杆菌Escherichia coli的过夜培养物作为对照培养物。
实验2：将与荧光染料偶联的配体加入原生动物和细菌培养物中，检测其与表面膜和细胞壁的结合情况
我们先前使用噬菌体展示文库（New England Biolabs Inc, Ipswich, MA）鉴定了19种可结合原生动物的七肽序列（相关方案见 http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf）。其中一种配体含有肽序列（ALNLTLH），该序列与已知的Trypanosoma brucei膜源性假定糖蛋白具有相似性。该配体通过固相肽合成法（SSPS），使用EDANS NovaTag树脂（EMD Biosciences）与C端荧光探针（EDANS，5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸，λmax = 341 nm，λem = 471 nm）偶联。本文中我们证明，该配体可结合自白蚁肠道分离的原生动物以及其他自由生活的原生动物，但不结合细菌。
- 按照实验1所述方法培养原虫。用10%甲醛在4°C下固定原虫12小时。
- 将原虫溶液离心（30 × g，10分钟），弃去上清液，并用1 ml Trager U培养基将含有固定原虫的沉淀洗涤两次。将沉淀重悬于1 ml Trager U培养基中。同时，固定其他原虫以及作为对照的E. coli细菌。
- 将固定后的微生物与合成配体偶联荧光染料EDANS的溶液（溶于水中）在50 μM终浓度下孵育1–2小时。该配体在水中的溶解性优于Trager U培养基。
- 在荧光显微镜下以400倍放大观察微生物，激发光最大吸收波长为341 nm，发射光位于蓝色区域，波长为471 nm。
实验3：检测配体与裂解肽偶联物的杀原虫活性 体外 （原生动物培养）
配体与裂解肽 Hecate 的偶联物（Mutwiri 等，2000）先前在 LSU 蛋白质中心合成。
- 按照实验1所述，在厌氧手套箱中对材料进行硅烷化处理，并准备白蚁肠道原生动物培养物。
- 准备好需氧对照微生物的培养物（例如，E. coli 以及自由生活的原生动物 T. pyriformis）。
- 在手套箱的厌氧环境中，用移液器将原生动物培养物各198 μl分装至6个0.5 ml离心管中。向其中一半的白蚁肠道原生动物培养物中加入2 μl 100 μM的配体-溶菌肽溶液（终浓度为1 μM），向另一半中加入2 μl水（对照组）。
- 在实验台面上，对 E. coli 和 T. pyriformis 培养物进行类似分装，分别加入1 μM溶菌肽、配体-溶菌肽或水。
- 1小时后，取每种原生动物培养物10 μl滴加至载玻片上。在显微镜下以200倍放大倍数比较处理组与对照组原生动物的存活情况。
- 1小时后，取约10-4 稀释度的 E. coli 培养物100 μl涂布于BHI培养基上，37°C过夜培养。比较各平板上的菌落形成单位数量。
实验4：将配体与荧光染料偶联后注入白蚁后肠
- 使用 Narishige PC-10 玻璃微电极拉制仪，采用双阶段加热（65 和 48）拉制针头（型号 GD-1，1 X 900 mm），以获得 20–30 μm 的尖端尺寸。在显微镜下使用测微尺测量尖端尺寸以确认其大小。
- 使用连接的注射器将约 30 μl 的 50 μM 荧光标记配体水溶液注入一根针头中，另取一根针头装入水作为对照。将一支微量移液管（容量 0.5 μl，长度 32 mm，Drummond Scientific Company）安装至微操纵器的持针器上。将针头安装至第二个微操纵器的注射系统持针器中。设定初始注射参数为约 1 秒脉冲时长和 10–12 psi 注射压力。缓慢将针头推进微量移液管内，使用脚踏驱动的高速电子注射系统配合脉冲时长控制器和受控氮气流进行注射，以确保每次可重复注入恒定体积。注射完成后，取出微量移液管，使用游标卡尺测量注入溶液的长度。根据微量移液管的已知参数计算注入体积。调节氮气压力和脉冲时长，使单次注射排出 0.3 μl 溶液。
- 用软镊子轻轻挤压白蚁工蚁腹部末端，以清除直肠中可能存在的排泄物。将白蚁工蚁置于冰上冷藏 5 分钟以固定其活动。
- 使用解剖刀片切割 100 μl 移液枪头，制备用于固定白蚁工蚁的接收器。将枪头切至 10–12 mm 长度，并根据白蚁大小选择合适尺寸使用。
- 将接收器安装至微操纵器上。将一只工蚁背面向上放置于培养皿中，使用氮气抽吸泵将其头部先进方式吸入接收器内，使工蚁末端从接收器中露出。
- 固定好接收器中的白蚁后，通过微操纵器小心推进已装液的针头，将其插入工蚁肛门。注入 0.3 μl 溶液（实验组为荧光标记配体，对照组为水）。
- 将注射过配体或水的工蚁分别放入铺有湿润滤纸的培养皿中，在 26±2 °C、78% 相对湿度条件下培养。
- 在注射后 24 小时，按实验 1 所示方法取出白蚁肠道并收集原生动物。按实验 2 所示方法固定并观察原生动物。
实验5：检测配体与裂解肽偶联物的杀原虫活性 体内 （注射至白蚁后肠）
- 按照实验1所述方法对材料进行硅烷化处理。
- 将配体-溶菌肽溶于水，配制浓度为500 μM的溶液。
- 按照步骤3.1)至3.4)准备玻璃针、受体及白蚁工蚁。
- 依照3.5)所述方法，向20只白蚁工蚁的后肠分别注射0.3 μl配体-溶菌肽溶液（处理组）或水（对照组）。
- 将白蚁饲养24小时后，取出若干工蚁的肠道，按3.6)和3.7)所述方法在显微镜下观察肠内容物。
- 一旦确认白蚁肠道中原生动物死亡，即将其余处理组和对照组白蚁置于含湿润滤纸的培养皿中，每日观察其死亡情况。
代表性结果：
实验1：通常情况下，如果操作正确，前肠、中肠和后肠可以完整地一起取出（图1a）。原生动物高密度存在于后肠的厌氧区域，可通过镊子刺穿后肠将其释放（图1b 1&2）。台湾乳白蚁肠道中最大的原生动物种类是纺锤形的P. grassii，长度为200–300 μm，宽度为150 μm，肉眼可见。第二大的种类是梨形的H. hartmanni（长50–140 μm，宽30–80 μm）。最小的种类是圆锥形的S. leidyi（长15–50 μm，宽8–30 μm；Lai et al. 1983）。各类原生动物如图2所示。
在最佳培养条件下，从中国台湾地下白蚁肠道中分离出的三种原生动物在厌氧的Trager U培养基中可存活并保持健康至少72小时（图3a）。然而，若培养条件不理想，原生动物会迅速死亡。若培养基中残留氧气，原生动物的运动将立即停止。若渗透压过高或细胞膜完整性受损，原生动物的表面膜会向外膨出，细胞随之破裂（图3b）。若渗透压过低或细胞膜受损，原生动物则会皱缩、萎缩（图3c）。
实验2：我们证实，与荧光探针偶联的配体能够以可检测的密度结合到台湾乳白蚁后肠中的三种原生动物。配体结合发生在整个细胞表面（图4）。在P. grassii中，结合位点主要集中于原生动物前部的轴丝（微管结构）和细胞核区域。
我们观察到原生动物摄取的木屑颗粒存在一些斑块状的自发荧光。然而，由于表面、轴柱和细胞核均无自发荧光，因此自发荧光通常很容易与配体的特异性结合区分开来（图4）。
我们在所有受试的自由生活的需氧原生动物物种中均检测到了荧光信号（图5），这表明该配体可结合于原生动物中普遍存在的结构。然而，在E. coli中未观察到配体结合现象。
实验3：1 μM的配体-裂解肽在不到10分钟内杀死了来自台湾乳白蚁工蚁肠道的三种原生动物以及体外培养的自由生活的T. pyriformis，而对照组原生动物仍存活。图6显示了用配体-裂解肽处理后，白蚁肠道原生动物细胞膜完整性的逐步丧失过程。细胞膜出现膨出并破裂，原生动物皱缩并死亡。在配体-裂解肽处理组与水处理组之间，E. coli菌落数量无显著差异。然而，无配体的裂解肽则显著减少了E. coli的菌落数量（图7）。这表明配体的连接在一定程度上保护了非靶标微生物免于裂解。
实验4：将0.3 μl浓度为50 μM的荧光标记配体注入白蚁工蚁的后肠后，通过荧光显微镜观察，确认其与P. grassii、S. leidyi和H. hartmanni结合，结果与实验2相似（图4）。白蚁肠道组织未显示荧光。
实验5：向台湾乳白蚁肠道内注射0.3 μl 500 μM的配体-溶菌肽，可在24小时内杀死肠道内的全部三种原生动物。白蚁在失去共生原生动物后10天内死亡。此前，Husseneder 和 Collier（2009）曾将相同浓度的溶菌肽注入白蚁肠道，但未连接配体时，原生动物死亡需要72小时，白蚁死亡则需六周。这表明配体可通过将溶菌肽结合至原生动物，从而提高其杀灭原生动物的效率。
图 1. a：置于载玻片上的中国台湾地下白蚁肠道，显示肠道主要部分（前肠、中肠、后肠）；
b 1& 2：用镊子刺穿后肠以释放含有原生动物的肠内容物。
图2. 在中国台湾地下白蚁后肠中发现的三种鞭毛原生动物：a) Pseudotrichonympha grassii，b) Holomastigotoides hartmanni，和 c) Spirotrichonympha leidyi。
图3．培养中的原生动物，a）健康的原生动物，b）细胞膜膨出的原生动物，c）皱缩的原生动物。
图 4．通过荧光标记配体处理的白蚁肠道原生动物（从上至下： P. grassii、H. hartmanni、S. leydi）与未经处理的对照组（显示自发荧光），验证配体与荧光探针偶联后的结合情况。
图5. 配体与自由生活的需氧原生动物结合，a) Tetrahymena，b) Amoeba，c) Euglena，和 d) Paramecium。
图6. 原生动物分别用 a) 水（对照）和 b) 1 μM 配体-溶菌肽进行处理。
图7. E. coli 在平板上的菌落（10-4 稀释度）：a) 用水处理（对照），b) 用1 μM 配体-裂解肽处理，c) 用1 μM 裂解肽处理。
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讨论
配体裂解肽已成功用于有效靶向并破坏癌细胞（Hansel 和 Leuschner 2004，Hansel 等. 2007）。基于这一概念，我们开发了一种七肽配体，该配体可结合台湾乳白蚁肠道中原生动物的表面，并将其与一种裂解肽偶联，旨在破坏这些白蚁肠道内必需的纤维素消化共生体，从而实现对白蚁的控制（Husseneder 和 Collier 2009）。
我们成功证实了配体与台湾乳白蚁肠道内三种原生动物的结合 体外 和 体内 通过使用带有荧光探针（EDANS）且发射光在蓝色范围内的配体进行检测。然而，白蚁肠道腔内木屑颗粒以及原生动物摄取的木屑所产生的自发荧光会干扰特异性结合的检测。尽管有经验的观察者能够区分荧光标记配体的信号与自发荧光（图4），但某些改进措施可使信号检测更为简便。我们建议使用远红光谱范围的荧光染料（例如 mPlum，Clontech Laboratories Inc.），因为在该波段，白蚁肠道及木屑颗粒的自发荧光显著减弱。
我们发现，低浓度的配体裂解肽可杀死台...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢路易斯安那州立大学肽合成中心前主任Allison Richard博士在荧光配体合成方面的帮助，感谢佛罗里达大学跨学科生物技术研究中心在配体-溶菌肽合成方面的支持，以及Socolovsky显微镜中心为提供荧光显微镜使用机会所给予的协助。本研究经费由美国国防部、能源部和环境保护局联合环境恢复技术示范计划（SERDP）探索性开发项目（SEED）、生物技术农业中心跨学科团队项目以及路易斯安那州政府提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | |
| EDANS | Novabiochem, EMD Millipore | ||
| 厌氧手套箱 | Coy Laboratories, Inc. | 定制 | |
| Intellus 环境控制器 | Percival Scientific, Inc. | I36NL | |
| PC-10 玻璃微量移液器拉制仪 | Narishige International | PC-10 | |
| 玻璃针（型号 GD-1，1 X 900 mm） | Narishige International | GD-1 | |
| Leitz 显微操作器 | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | |
| 显微注射仪 | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | |
| Microcaps | Drummond Scientific | 1-000-0005 | |
| LEICA 荧光成像系统 | Leica Microsystems | DMRxA2 | |
| LEICA 解剖显微镜 | Leica Microsystems | MZ16 | |
| LEICA 显微镜 | Leica Microsystems | DMLB | |
| Olympus 解剖显微镜 | Olympus Corporation | SZ61 |
参考文献
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. Bourtzis, K., Miller, T. A. 3, CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. Volume 3 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
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