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冷预处理神经保护作用的研究策略

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DOI：

10.3791/2192

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2010年9月2日

 ,  , 
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

本文内容

摘要

我们旨在阐明介导冷适应性神经免疫信号传导的机制，以期发现新的治疗靶点，从而在脑损伤发生前对其进行保护。本文介绍了开展此类研究的策略，这些策略需要具备生物系统、实验操作以及高度可重复且灵敏的技术手段。

摘要

神经系统损伤是全身麻醉及相关外科手术中常见的发病率和死亡率原因，而有效的、易于给药且安全的预处理治疗手段有望减轻此类损伤。我们旨在明确介导低温预处理的神经免疫信号通路，以发现新的治疗靶点，从而在脑损伤发生前实现神经保护。低水平的促炎介质信号随时间发生的变化，对于低温预处理所提供的神经保护作用至关重要。该信号模式符合生理学适应性兴奋效应（hormesis）的基本原理，即刺激性刺激必须达到一定强度，并持续足够长的时间以诱导机体产生适应性反应，才能显现出保护作用。

因此，明确冷预处理神经保护作用中所涉及的免疫信号通路，需要具备高度可重复性和高灵敏度的生物系统、实验操作及技术手段。我们的方法是采用海马脑片培养作为实验模型 体外 模型，该模型紧密反映了他们的 体内 受成熟且静息态的巨胶质细胞/小胶质细胞影响的多突触神经网络的对应结构。这种胶质细胞状态对小胶质细胞尤为重要，因为它们是细胞因子的主要来源，而细胞因子的作用浓度可达飞摩尔（femtomolar）范围。此外，脑片培养可被长期维持。 体外 数周时间足以诱发激活刺激并评估适应性反应。最后，利用脑片培养可精确控制环境条件，从而测量、模拟和调节低温预处理的细胞因子信号，以解析其中的关键节点。细胞因子信号系统的分析需要采用灵敏且可重复的多重技术。我们首先使用定量PCR检测TNF-α，以筛查小胶质细胞的激活状态，随后通过定量实时qPCR阵列筛查评估全组织范围内的细胞因子变化。后者是一种同时测量多种细胞因子系统信号变化的最灵敏且可重复的方法。显著变化需通过靶向qPCR进一步验证，随后进行蛋白质检测。我们采用基于Luminex技术的多重微球流式细胞术检测组织中细胞因子蛋白水平的变化。通过双标免疫组织化学确定特定细胞的细胞因子产生情况。综上所述，该脑组织制备方法及其应用方式，结合建议的研究策略，可能是识别潜在治疗靶点的最优途径，以开发可模拟低温预处理优势的新型治疗手段。

方案

无菌与无菌操作技术对于脑片培养的制备、维持及长期使用至关重要。此外，我们仅在培养18天后使用脑片培养的原理 体外 基于证据表明，兴奋性和抑制性突触传递在此阶段发育最为成熟，且胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）趋于静息状态，并与其功能稳态相一致 体内 对应物（图1）。

1. 海马脑片培养物的制备与维持

  1. 培养当天，将无菌插件置于1.1 mL生长培养基中平衡，该培养基由50 mL Eagle基础培养基、25 mL Earle's平衡盐溶液、23 mL马血清、0.5 mL Glutamax（200 mM储备液）、0.1 mL庆大霉素（10 mg/mL储备液）、0.4 mL两性霉素B（Fungizone）组成250 μg/mL)，1.45 mL D-葡萄糖（45%；总浓度42 mM）。
  2. 将六孔板置于培养箱中 36°C5% 二氧化碳和 95% 湿度。
  3. 为最大限度保持无菌，培养操作最好在配备高效微粒空气（HEPA）过滤系统的正压培养室中进行，室内空气应通过自带紫外线灯的空气净化风扇进一步灭菌；操作时应穿戴洁净实验服，并佩戴无菌手套，手套需覆盖实验服袖口。
  4. 在包含所有所需材料（即McIlwain组织切片机、配套聚四氟乙烯切片插件、剃刀切片刀片、冰冻解剖盘（3-4°C）培养皿、手术工具和解剖用培养皿）使用Wild（M8）体视显微镜。
  5. 让冷却板（连接至附近的水浴循环）温度降至3-4°C 在至少30分钟内保持该温度，同时将解剖材料暴露于紫外光下，以进一步确保解剖区域和工具的无菌状态。
    1. 层流罩需定期检测，以确保紫外灯在台面水平具有足够的强度，检测时使用短波紫外光测量仪。
  6. 使用出生后8-9天（P8-P9）的幼鼠（每只约23 g，出生时窝仔数调整为10只）进行实验。在通风柜后方的无菌操作台中，将幼鼠置于小型动物盒内，用100%二氧化碳麻醉，随后在通风柜内将其浸入100%乙醇中进行清洁，并在通风柜内完成后续所有操作。
  7. 在直径100 mm的培养皿的一半中将幼鼠断头，并将头部置于培养皿的另一半，每只幼鼠使用新的培养皿。
  8. 取出脑组织，放入含有10 mL无菌冷（3-4°CGey's 平衡盐溶液，添加 D-葡萄糖至 6.5 mg/mL（即每 500 mL Gey's 溶液中加入 7.5 mL 45% D-葡萄糖）
  9. 从每个半球中分离出海马体，并将其放置在麦氏切片机（McIlwain chopper）的聚四氟乙烯（Teflon）圆盘上。使用虹膜铲将培养基从脑组织周围推开，以防止切割的脑片粘附在刀片上。
  10. 使用McIlwain切片机将海马体沿其长轴垂直方向进行切片，切片厚度设定为350-400 μm.
  11. 迅速用冷（3-）冲洗新切的切片，将其从聚四氟乙烯插件上洗下，并放入含有冷液的60 mm培养皿的上半部分4°C使用1 mL移液器，将含6.5 mg/mL D-葡萄糖的Gey's平衡盐溶液加入。
  12. 在体视显微镜下检查切片，确认海马齿状回和锥体细胞层完整。
  13. 将最大的切片轻轻放置在小室插件上（每个插件放3片，每只仔鼠共12片），并在经每六个月清洁一次、每三个月使用精确到小数点后一位的红外二氧化碳分析仪和温度计校准过的培养箱中，维持正常培养条件。
  14. 每隔3-4天更换培养皿中的生长培养基 体外 使用BSL-2生物安全柜并采用无菌技术。
  15. 7 天后 体外，用 1.1 mL 无血清培养基（SFM）替换培养液，该培养基由 97 mL Neurobasal、2 mL B27、0.5 mL Glutamax（200 mM）、0.1 mL 抗坏血酸（0.5 M）和 0.68 mL D-葡萄糖（45%；总浓度 42 mM）组成。

2. 预筛选脑片培养物的活力

  1. 分装Sytox Green储备液（10 μL）并于 -20°C.
  2. 将Sytox贮存液用无血清培养基稀释至500 nM的工作浓度（即， 10 μL 在 100 mL 培养基中）。将 Sytox 培养基置于 4°C 可使用长达一周。
  3. 在6孔培养板中每孔加入1.1 mL Sytox，并升温至 36°C 在5%二氧化碳条件下培养足够时间（即以培养皿上无冷凝水为证）。
  4. 同时，开启紫外灯（即配备FITC滤光片的荧光光源），通过稳压电源供电以确保光照强度均匀，并预热至少20分钟。
  5. 将脑片培养物（18天） 体外在Sytox培养基中孵育10分钟，然后转回SFM，以筛选不可逆的CA1锥体层损伤。
  6. 在倒置显微镜的无菌表面上观察培养物，在5倍放大倍数下进行检查。
  7. 接受CA1区Sytox阳性细胞少于30个的培养样本。

3. 冷预处理

  1. 在6孔培养板中加入1.1 mL的无血清培养基（SFM）。将冷却的培养基（例如，30°C）置于培养箱（5%二氧化碳和95%湿度）中至少平衡20分钟后再使用。培养板上无冷凝水珠表明已达到足够的平衡时间。
  2. 用无菌操作技术，在生物安全等级2级（BSL-2）通风橱中，将组织切片培养插入物转移至保持在30°C的冷却培养基（1.1 mL/孔）中，并孵育90分钟。
  3. 再次使用生物安全等级2级（BSL-2）通风橱中的无菌操作技术，将组织切片培养物放回正常的无血清培养基（SFM）中，并在正常培养条件下继续培养24小时。

4. 兴奋性毒性损伤

  1. 开始切片培养实验前，先用 Sytox 培养基处理 20 分钟进行预筛选。
    1. 在保持切片方向与预筛选时一致的条件下，获取各个切片的图像（背景图像）。可通过在每个插入物的“10点”和“2点”位置分别用记号笔标记一个和两个标记来实现。该操作有助于为每组培养图像使用相同的感兴趣区域形状。
  2. 同时，打开紫外灯光源（在稳压电源下）和 CCD 相机，至少预热 20 分钟，使其达到工作温度。
  3. 然后，使用荧光素标准品校准 CCD 相机。
    1. 除非使用自动校准的 CCD 相机，否则需通过曝光 50 个周期“清除”CCD。我们已在 MetaMorph 中建立程序，用于清除用于损伤定量的 Cool Snap 相机。
    2. 将 10 μL 荧光素加入 90 mL PBS（10 mM 磷酸盐缓冲液，150 mM NaCl，pH 7.3）中，涡旋混匀。
    3. 用移液器将 10 μL 荧光素混合液滴加到深度为 100 μm 的血细胞计数板上。
    4. 将全图像强度调整为 1000/4096。
  4. 采集切片培养物的背景图像，以确认冷预处理未造成损伤（即，弃去 CA1 区域感兴趣区域强度 ≥ 250 的培养物）。
  5. 准备含 NMDA 培养基的培养盘。
    1. 每周至少配制一次 10 mM 的 NMDA 储存液。
    2. 为诱导兴奋性毒性损伤，将 NMDA 稀释至 20–50 μM 的 SFM 中，并在正常培养条件下平衡至少 20 分钟。
  6. 在 BSL-2 生物安全柜中采用无菌操作技术，将插入物置于含 NMDA 的培养基中，在正常培养条件下孵育 60 分钟。
  7. 通过将每个插入物在三个分别装有 10 mL 预热至 36°C 的 Neurobasal 培养基的 60 mm 培养皿中各浸洗三次，以去除 NMDA。每组三个 60 mm 洗涤培养皿中，不要使用超过三个插入物。
  8. 将培养物放回正常培养条件中继续培养。
  9. 在 NMDA 处理后 24 小时采集损伤图像。
    1. 按照上述方法，使用荧光素标准品校准相机。
    2. 将培养物置于 Sytox 培养基中 20 分钟。
  10. 定量损伤：
    1. 使用 MetaMorph 软件，在 CA1 区域周围绘制感兴趣区域（AOI）。
    2. 测量所选区域的强度作为“损伤”值。
    3. 将“损伤”图像中的 AOI 复制并粘贴至“背景”图像中。
    4. 将“损伤”和“背景”图像中的数值输入 Excel。
    5. 计算对照组和冷预处理组的“损伤减去背景”数值。
    6. 使用统计软件（例如 SigmaStat）进行适当的统计检验，比较实验组与对照组的损伤程度，每次实验均应包含对照组。
    7. 注意：若损伤后一天的图像中损伤水平较低，可将实验延长至两至三天。由于对损伤缺乏易感性，培养物中的保护效应可能被掩盖（图 2）。
    8. 注意：关于“保护”的问题促使我们转向测量损伤水平而非比值来进行所有比较（图 3）。

5. 与冷预处理联合应用的共处理

切片培养的一个重要优势在于能够精确控制环境条件。这意味着可以测量、模拟和调控低温预处理产生的细胞因子信号，以解析其中的关键节点特征。

  1. 重组蛋白（如激动剂蛋白）和中和蛋白（如抗体或可溶性受体）可分别用于模拟和调控细胞因子信号传导。
  2. 通常，这些蛋白质被重构后分装保存于 -20°C 在六个月内使用，以确保足够的生物活性。
  3. 此处，我们描述了利用可溶性肿瘤坏死因子受体1（sTNFR1）阻断TNF-α信号通路的典型应用。
    1. 用 PBS 中含 0.1% 牛血清白蛋白的溶液重悬 sTNFR1，配制成储存液 50 μg/mL，分装至20-50 μL 量，并在 -20°C.
    2. 使用时，将sTNFR1用预热至适当温度的切片培养生长培养基稀释至200 ng/mL 36°C 将脑片培养物置于sTNFR1培养基中，于低温预处理前孵育20分钟。
      1. 注意：为减少实验误差，最好将 200 ng/mL sTNFR1 加入大量培养基中进行稀释（即按 1:250 比例稀释） 50 μg/mL 10 mL 生长培养基中的 sTNFR1 储存液需要 40 μL 可溶性TNF受体1（sTNFR1）与将sTNFR1直接加入培养皿各孔中的比较4.4 μL 每1.1 mL培养基。
    3. 将sTNFR1用培养基稀释至200 ng/mL，并在每个插入式培养小室中加入1.1 mL。让培养基平衡至 30°C 在将脑片培养物进行上述90分钟的低温预处理之前，至少应孵育20分钟。
    4. 将切片培养物放回 36°C 培养基中含有sTNFR1。
    5. 24小时后，将培养物暴露于Sytox染色液中20分钟，操作同前；采集背景图像，以确认低温预处理未对培养物造成损伤。
  4. 按照上述方法对数据进行定量分析。
  5. 每隔 3-4 天更换一次含成分的培养基 体外.

6. 冷预处理后即刻与延迟性兴奋性毒性损伤

  1. 低温预处理后的即刻损伤。
    1. 按上述方法进行低温预处理。
      1. 低温预处理后，将培养物恢复至正常培养条件孵育 20 分钟。
      2. 然后，用 20–50 μM NMDA 处理培养物一小时以诱导损伤。
      3. 按上述方法清洗培养物三次，并放回正常孵育条件。
      4. 24 小时后，按上述方法采集损伤图像。
  2. 低温预处理的延迟效应。
    1. 按上述方法进行低温预处理。
    2. 24 小时后，按上述方法施加 NMDA 损伤。
    3. 在初次低温预处理后最多连续三天采集损伤图像，以监测保护作用。

7. RNA 提取

以下基因表达操作步骤适用于单个脑片培养样本。

  1. 将切片培养物从生长培养基和正常培养条件下转移至6孔板中的3 mL RNAlater中，以稳定RNA。在按以下所述方法处理前，于4°C下保存，最长可保存三天。
  2. 用精细尖头画笔轻轻将切片培养物从插入物上取下，放入含有1 mL冷（4°C）PBS的1.5 mL（无DNase、RNase和DNA）微量离心管中。
  3. 将样品离心30秒，弃去PBS上清液。
  4. 将样品在-80°C下保存。
  5. 从切片培养物（约250 ng/个）中提取RNA时，将样品置于冰上解冻。
  6. 使用Qiagen MicroRNeasy试剂盒提取RNA，具体操作步骤如下，并根据RNeasy Micro手册（Qiagen）进行详细说明和调整：
    1. 向每个含有一个切片培养物的微量离心管中加入350 μL RLT缓冲液（每毫升含10 μL β-巯基乙醇）。
    2. 通过涡旋震荡30秒使样品匀浆。如有必要（即组织沉淀仍可见），使用一次性研磨棒反复吹打组织，直至在RLT缓冲液中完全匀浆。
    3. 向裂解液混合物中加入350 μL 70%乙醇，用移液器吹打混匀。
    4. 将匀浆液转移至离心柱中，并放入收集管内（离心柱和收集管均由Qiagen提供）。
    5. 以最大速度离心15秒，保留离心柱。
    6. 向离心柱中加入350 μL RW1缓冲液进行洗涤，然后以最大速度离心15秒，弃去流出液。
    7. 将10 μL DNase I原液用70 μL RDD缓冲液稀释，总体积为80 μL。轻轻吹打混匀，切勿涡旋。每个样品准备80 μL稀释后的DNase工作液，在室温下孵育30分钟。
    8. 向样品离心柱中加入350 μL RW1缓冲液，离心15秒，弃去收集管。
    9. 使用新的收集管，向样品中加入500 μL RPE缓冲液，离心15秒后弃去缓冲液。
    10. 向样品中加入500 μL 80%乙醇，离心2分钟，弃去收集管。
    11. 将离心柱管盖打开，以最大速度离心5分钟以干燥柱膜，弃去收集管，然后将离心柱转移至试剂盒提供的1.5 mL收集管中。
    12. 为收集提取的RNA，向离心柱膜中央加入14 μL无RNase的水，离心1分钟，收集流出液。
    13. 加入2 μL RNasin（在TE缓冲液中稀释至1 U/μL），并于-80°C下保存。TE缓冲液成分为10 mM Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）、1 mM EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐水合物），pH为8.0。

8. RNA 定量

  1. 注意：RNasin 不会干扰 RiboGreen 检测。
  2. 按以下方法用无 RNase 的 TE 缓冲液以 1:200 比例稀释 RiboGreen。
    1. TE (mL): 1; Ribogreen (μL): 5;
    2. TE (mL): 4; Ribogreen (μL): 20;
    3. TE (mL): 6; Ribogreen (μL): 30.
  3. RNA 标准品的制备方法如下。
    1. 使用酵母 tRNA 作为 RNA 标准品。tRNA 以 1 mg/mL 浓度储存于 TE 缓冲液中，保存条件为 -20°C。
    2. 将 1 mg/mL 原液用 TE 缓冲液稀释 100 倍，使用（无 DNase、无 RNase 且无 DNA 的）1.5 mL 微量离心管，制备成 1 μg/mL 的工作标准液。
    3. 直接在 96 孔荧光检测板中制备标准曲线：先加入 TE 缓冲液作为稀释液，然后按邻近表格所示，向板孔中已有的 TE 缓冲液中加入相应体积的 1 μg/mL 标准品。每种标准品设两个复孔，具体如下：
      1. Vol. of std. (μL): 100; Vol. of TE (μL): 0; RNA in well (ng): 100;
      2. Vol. of std. (μL): 80; Vol. of TE (μL): 20; RNA in well (ng): 80;
      3. Vol. of std. (μL): 60; Vol. of TE (μL): 40; RNA in well (ng): 60;
      4. Vol. of std. (μL): 40; Vol. of TE (μL): 60; RNA in well (ng): 40;
      5. Vol. of std. (μL): 20; Vol. of TE (μL): 80; RNA in well (ng): 20;
      6. Vol. of std. (μL): 0; Vol. of TE (μL): 0; RNA in well (ng): 0.
  4. 检测操作步骤如下。
    1. 向 96 孔板的每个样品孔中加入 99 μL TE 缓冲液。最高效的方法是使用多通道移液器。
    2. 向实验样品孔中加入 1 μL RNA。
    3. 使用多通道移液器向每孔加入 100 μL 稀释后的 RiboGreen，并用移液器吹打一至两次以混匀。
    4. 在荧光酶标仪上读取数据，激发波长为 480 nm，发射波长为 520 nm。
    5. 使用 Microsoft Excel 根据 RNA 标准品测得的荧光强度绘制标准曲线。
    6. 根据标准曲线所得线性方程计算各样品中 RNA 的浓度。

9. SYBR Green 定量 PCR

  1. PCR 操作最好在专门用于 RNA 操作的洁净区域进行（图 4）。
    1. 使用前，用紫外线、10% 漂白剂或 RNase Away 对操作区域及相关实验设备进行去污染处理，以消除潜在的 DNA 污染和 RNase 活性。
    2. 所有操作过程中均需佩戴手套。
    3. 所有步骤均使用试剂盒提供的无 RNase 水，不得使用 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理的水。
    4. PCR 相关管子使用后应立即盖紧，以减少外源 DNA 气溶胶污染的风险。
  2. 针对感兴趣的 mRNA 目标开发并表征引物。这些方法详见 Hulse et al. 在《神经科学杂志》2008 年发表的补充方法13。
  3. 使用 iScript 通过逆转录从 30–200 ng 总 RNA 生成 cDNA。
    1. 起始 RNA 用量的选择取决于可获得的总 RNA 量，目标是对样品的一部分（即总量的 10%–20%）进行 RT-PCR 分析。
    2. 剩余较大量的 RNA 应储存起来以备将来分析使用。
    3. iScript 试剂盒采用随机六聚体与 oligo-dT 引物的混合物，以及改良的 MMLV 逆转录酶，在总体积为 20 μL 的体系中进行反应。
    4. 逆转录程序为：25°C 反应 30 分钟，随后 42°C 反应 50 分钟，最后在 85°C 下使逆转录酶变性 5 分钟。
    5. 将 cDNA 用 TE 缓冲液稀释，使其相对于起始 RNA 量的终浓度为 0.4 ng/μL。
  4. 采用 SYBR Green PCR 方法扩增 cDNA。
    1. 通过实时监测 SYBR Green 的掺入情况来实时监控 PCR 反应。
    2. 50 μL 反应体系包含：3 mM MgCl2、200 μM dNTPs、上下游引物各 15 pmol、1 μM 荧光素、1× SYBR Green 染料、10 μL（4 ng）脑片培养 cDNA，以及 1.25 U Platinum Taq 聚合酶，反应缓冲液组成为 50 mM KCl、10 mM Tris，pH 8.3。
    3. 使用可实时采集数据的 iCycler 梯度扩增仪进行 PCR。
    4. 循环参数为：95°C 变性 15 秒，随后 60°C 退火/延伸 30 秒，共重复 45 个循环。
    5. 在退火/延伸阶段进行光学检测，Ct 值由 iCycler 系统软件自动确定。
    6. 使用目标细胞因子和 β-actin 的 cDNA 构建标准曲线。
      1. 根据质粒 cDNA 的分子量和质量确定拷贝数。
      2. 构建拷贝数/质量的标准曲线，并在每次检测中包含该曲线。
      3. 利用每个 cDNA 稀释样本的 Ct 值绘制拷贝数与 Ct 值的关系曲线。
    7. 根据标准曲线确定各样品中细胞因子和 β-actin 的拷贝数水平。

10. 用于微阵列的定量 PCR

定量实时qPCR阵列筛选是一种高灵敏度且可重复的方法，用于检测低水平炎症介质表达的变化。

  1. 采用 SABiosciences 公司的 RT2 Profiler PCR 芯片检测炎症介质相关基因表达的变化，具体步骤详见制造商说明书。
  2. 该检测使用 0.1–1.0 μg RNA。我们采用局部切片区域（例如 CA1 区，两个合并样本可提供约 250 ng 总 RNA）或含有相似总量 RNA 的单个完整切片。
  3. 使用第一链 cDNA 合成试剂盒（例如 #C-03）将样品 RNA 和对照 RNA 逆转录为 cDNA。
    1. 将所得 cDNA 与基于 SYBR Green 的 PCR 混合液（#PA-011）混合，并将 25 μL 分装至 PCR 芯片板的 96 个孔中（每块板可检测 84 个独特的目标基因和 16 个看家基因）。
    2. 为实验样品准备一块芯片板，为对照样品准备另一块芯片板。
    3. 注意：制造商提供的 SYBR Green 预混液是针对特定热循环仪的。
  4. 使用 iCycler 进行热循环反应，共 40 个循环，每个循环包括 95°C 下变性 15 秒，随后在 60°C 下延伸 1 分钟；在延伸阶段收集光学数据。热循环结束后进行熔解曲线分析，以 0.5°C 递增扫描 55–95°C 的温度范围。
  5. 使用配套的 Excel 软件，通过 2-ΔΔCt 法计算处理组与对照组芯片中基因的相对表达量，并以相对于对照组的倍数变化（上调或下调）表示结果。
  6. 表达量变化达到两倍或以上的基因将被选作进一步评估。
  7. 通过 PCR 芯片筛选鉴定出的基因（例如使用 #PARN-011A 研究冷适应预处理）需进一步通过 qPCR 验证。
    1. PCR 芯片可用于鉴定在刺激条件下发生调控的基因。
    2. 以冷适应预处理为例，我们发现 IL-11 基因在冷适应预处理后呈正向调控。
    3. 分析的下一步是利用上述 qPCR 检测方法，确认新鉴定出的基因在脑片培养体系中是否确实发生表达调控。

11. 多重微球流式细胞术蛋白质组学检测

  1. 按照上述方法对脑片培养物进行冷预处理。
  2. 收集脑片培养物用于总蛋白检测。
    1. 使用细尖毛刷轻轻将脑片从插入物上取下，并置于 1 mL 冷（4°C）PBS 中。
    2. 离心管并移除 PBS，将脑片培养物置于干冰上，直至完成所有收集操作。
    3. 将管置于 -80°C 保存。
  3. 匀浆脑片培养物样本以进行总蛋白检测。
    1. 准备用于匀浆的细胞裂解缓冲液。
      1. 根据制造商说明（Bio-Rad），向 5 mL 裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，并置于冰上备用。
    2. 向脑片培养物中加入 100 μL 裂解缓冲液，并使用剪开至 1 mm 的 100 μL 吸头上下吹打 5 次以混匀。
    3. 在 4°C 条件下将样本置于平板振荡器上振荡 20 分钟。
    4. 在 4°C 条件下以 13,000 rpm 离心 15 分钟。
    5. 将上清液转移至洁净离心管中，并置于冰上备用。
  4. 进行总蛋白检测。
    1. 制备 BSA（牛血清白蛋白）蛋白标准品。
      1. 根据制造商说明，用超纯水重悬 BSA 原液。
      2. 用裂解缓冲液稀释，制备浓度范围为 0–1000 μg/mL 的蛋白标准品。
    2. 根据试剂盒说明计算所需工作试剂的体积。
      1. 例如，（8 个标准品 + 18 个未知样本）×（2 个重复）×（每样本需 200 μL 工作试剂）= 共需 10.4 mL 工作试剂，用于加载至 96 孔微孔板（例如，微球流式细胞检测，见下文）。
      2. 混合试剂 A 与试剂 B 时可能出现轻微浑浊，但应很快消失。
    3. 向微孔板中每孔加入 10 μL 标准品和样本。
    4. 向各孔中加入 0.2 mL 工作试剂。
    5. 用封板膜覆盖微孔板，并在平板振荡器上振荡 30 秒。
    6. 将微孔板在 37°C 下孵育 30 分钟。
    7. 在读取前将微孔板冷却至室温（约 10 分钟），然后在酶标仪上以 595 nm 波长读取吸光度。
    8. 使用 Microsoft Excel 根据 BSA 标准品的测定吸光度构建标准曲线。
    9. 根据标准曲线所得线性方程计算样本中的蛋白浓度。
      1. 将所有样本用裂解缓冲液稀释至测得的最低浓度，并在 -80°C 下保存。
  5. 按照参考文献 #12 和 #16 中详述的方法进行单重和多重细胞因子组织（或体液）检测。

12. 免疫组织化学

  1. 使用 PLP 固定液固定培养物 24 小时，固定液组成为：10 mL 16% 多聚甲醛、1.096 g 赖氨酸、0.42 g 磷酸钠、0.17 g 高碘酸钠，用超纯水定容至 80 mL（固定液 pH 为 6.2）。
    1. 我们发现 PLP 固定液是一种温和的固定剂，可检测到使用其他固定剂无法显现的低水平免疫染色信号。
    2. 培养物固定 24 小时后，用细毛刷将其转移至含叠氮化钠（100 mg/L）的 PBS 中。
  2. 漂浮脑片培养物的明场免疫染色操作步骤如下，所有步骤均在约 50 rpm 振荡条件下进行。
    1. 用 3 mL PBS 洗涤脑片培养物，每次 10 分钟，共洗三次。
    2. 用 0.3% H2O2 对脑片培养物进行淬灭处理。
      1. 将 30% H2O2 储存液用 PBS 稀释。
    3. 用 PBS 洗涤脑片培养物三次，每次 10 分钟。
    4. 在六孔板中，用 3 mL 封闭液于室温封闭脑片培养物 1 小时，封闭液组成为：10 mL 山羊血清、0.75 mL Triton X-100 和 89.25 mL PBS。
      1. 封闭液所用血清应与二抗来源物种一致。
    5. 将脑片培养物在 4°C 条件下，于封闭液稀释的一抗溶液中孵育过夜。
      1. 小玻璃 Pyrex 培养皿孔中一抗溶液的最大体积应为 0.3 mL，体积过高容易溢出培养皿边缘。
      2. 将培养皿置于密闭湿盒中。我们不使用粘性封膜覆盖培养皿，以防切片在振荡过程中粘附到膜上而丢失。
      3. 调节摇床转速，使其刚好足以使脑片在抗体溶液中循环流动。
    6. 将脑片从玻璃板上取出，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    7. 在室温振荡条件下，用二抗溶液孵育脑片 1 小时。
      1. 使用小玻璃 Pyrex 培养皿，每孔加入 0.3 mL 二抗溶液。
    8. 用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    9. 使用 3'-二氨基联苯胺（DAB）显色。
      1. 将 30 mg DAB 溶解于 3 mL 二甲基亚砜中。
      2. 使用两张 #1 滤纸过滤 DAB 溶液，并用 54 mL PBS 洗涤。
      3. 使用前立即加入 20 μL 30% H2O2。
      4. 在室温下将培养物置于 DAB 溶液中孵育 5–7 分钟。
      5. 注意：DAB 为致癌物，必须妥善处理。所有 DAB 溶液应收集于通风橱内标记的容器中，所有使用过的器皿需浸泡于漂白剂溶液以灭活 DAB。所有 DAB 废液最终应通过机构安全办公室统一处理。
    10. 用 PBS 洗涤脑片培养物三次，每次 10 分钟。
    11. 用含 100 μL 洗洁精的蒸馏水将脑片湿封于明胶（或硅烷）包被的载玻片上，室温干燥过夜。
      1. 避免使用载玻片加热器，过热可能导致封片后的脑片出现裂纹。
    12. 将载玻片依次通过梯度乙醇（50%、75%、95%、95%、100%、100%）脱水，每级 30 秒。
    13. 用二甲苯透明四次，每次 10 分钟。
    14. 使用玻璃巴斯德吸管，在载玻片上滴加 0.1 mL 封片介质，轻轻加盖盖玻片以避免产生气泡，室温干燥过夜。
  3. 荧光免疫染色。
    1. 使用冷冻切片机将脑片培养物切为 20 μm 厚的切片。
      1. 调节冷冻切片机内部温度为 -16°C，样品台温度为 -12°C。
      2. 用巴斯德吸管在金属样品头表面滴加少量水，并在干冰上冷冻固定。
      3. 在已冷冻的样品头上覆盖一层薄的 Tissue-Tek 包埋剂。
      4. 让样品头充分冷冻并平衡至冷冻切片机腔室温度。
      5. 切削 Tissue-Tek 包埋剂，形成一个平整表面，以便将脑片平铺其上。
      6. 切片过程中注意记录样品头的方向，以保持一致的切片角度，防止包埋剂从样品头上脱落。
      7. 冷冻完成后，取出样品头并放入夹持器中。使用金属刮刀和细头画笔，将一个脑片滑至刮刀上，再转移至样品头 Tissue-Tek 包埋剂的中央平整区域。
      8. 在已固定的脑片上覆盖一层薄的 Tissue-Tek 包埋剂，并在切片机腔室温度下冷冻至少 10 分钟。
      9. 启动“修片”模式，切去 Tissue-Tek 包埋剂的表层，直至脑片可见。
      10. 将切片模式从“修片”切换至预设厚度为 20 μm 的“切片”模式。
      11. 用室温的明胶包被载玻片捞取 20 μm 切片，并将载玻片干燥过夜。
      12. 载玻片上可见 Tissue-Tek 包埋剂残留，但在 PBS 洗涤过程中会溶解。
    2. 免疫染色。
      1. 用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
      2. 在室温振荡条件下，用 0.3% H2O2 淬灭 15 分钟。
      3. 用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
      4. 使用 SFX 信号增强剂，在载玻片切片上直接滴加数滴组分 A，在湿盒中室温孵育 30 分钟。
        • 组分 A 的孵育可替代明场免疫组织化学中使用的 10% 山羊血清封闭步骤。
      5. 将载玻片在 37°C 条件下，于含 0.75% Triton X-100 的 PBS 稀释的一抗溶液中孵育 2 小时。
        • 将一抗溶液直接滴加于载玻片表面，并在湿盒中孵育以防止蒸发。
        • 所有抗体溶液中均不添加血清，仅使用 PBS 和 Triton X-100。
      6. 用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
      7. 在室温避光条件下，用二抗孵育 1 小时。
        • 所有荧光二抗均需离心 20 分钟，以防止抗体溶液中存在聚集体。
        • 使用含 0.75% Triton X-100 的 PBS 配制抗体稀释液。
      8. 用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
      9. 将载玻片在蒸馏水中浸洗一次，以去除 PBS 中的盐分。
      10. 将载玻片避光覆盖，室温干燥过夜。
      11. 使用 ProLong 抗荧光淬灭封片剂封片。
        • 将组分 A 在微波炉中解冻 5–10 秒，取约 1 mL 加入组分 B 小瓶中，用巴斯德吸管轻轻混匀，注意避免引入气泡。
        • 以最大转速离心 5 分钟以去除气泡。
        • 用巴斯德吸管在载玻片表面均匀滴加一层薄的 ProLong 封片剂，注意避免产生气泡。
        • 轻轻加盖盖玻片，避光覆盖，室温干燥过夜。
      12. 双标荧光免疫染色（图 5）。
        1. 按上述方法进行荧光免疫染色，但将两种一抗同时加入同一孵育溶液中稀释。
        2. 将所有二抗混合于同一溶液中，按上述方法孵育。
        3. 采用两种抗体连续孵育的方式会导致免疫染色信号减弱。

13. 典型结果

荧光显微镜显示海马神经元区域 CA1、CA3、DG；细胞形态学分析。
图1. 海马脑片培养物及小胶质细胞的形态 左图显示典型的成熟（即21天） 体外) 海马脑片培养经 NeuN（绿色）染色以显示主要神经元的细胞构筑。图中显示 CA1 和 CA3 区的锥体神经元以及左侧齿状回（DG）神经元。比例尺为 250 μm右侧图像源自CA1区，以更高倍率显示，以展示成熟脑片培养中静息态小胶质细胞的分支形态。细胞使用小胶质细胞表面标志物cd11b标记。比例尺为 50 μm.

细胞中荧光强度比较；24小时，最大时间点；对照组 vs. CP处理。
图2. 海马脑片培养物中的低温预处理神经保护作用。 培养物与Sytox Green共同孵育，Sytox Green是一种荧光标记的死细胞指示剂。上排显示假手术对照组培养物，下排显示暴露于28°C持续90分钟的脑片。左侧的初筛图像显示无CA1区损伤。左上方图像展示了相对损伤程度的颜色校准标尺。中间一排图像显示暴露于20 μM NMDA后24小时的脑片培养物相对损伤情况。可见假手术对照组的损伤程度大于接受低温预处理（CP）的培养物。传统上，培养物随后会持续暴露于20 μM NMDA过夜，以最大化CA1神经元损伤水平以及CP组与假手术组之间的相对损伤，该结果以损伤/最大损伤的比值表示。然而，施加最大损伤刺激可能不足以克服预处理所诱导的神经保护作用。因此，使用损伤/最大损伤的比值可能无法准确反映预处理带来的神经保护效果。右侧图像清楚表明，CP组的最大损伤水平低于假手术对照组。

显示损伤后数天相对损伤程度的图表，包含两条用于比较的数据序列。
图3. 示意图说明在低温预处理实验中利用初始、第一天测量值来定量损伤水平的实用性。 如上所述，我们发现使用比值（损伤/最大损伤）可能会掩盖低温预处理所带来的神经保护作用。这一点可以从左侧的示意图中看出，其中假手术损伤以红色表示，低温预处理后的损伤以蓝色表示。NMDA暴露后一天，低温预处理组的相对损伤水平为“3”，而假手术对照组为“5”，表明具有40%的神经保护作用。然而，如果采用传统的比值法（即损伤/最大损伤），则无法显示出任何保护作用［例如，假手术组为(5/10)=50%，低温预处理组为(3/6)=50%］。

qPCR 分析；标准曲线、扩增曲线；PCR 效率计算，DNA 定量。
图 4. 典型的 qPCR 结果展示。 上图显示 PCR 扩增的 RNA 拷贝数与阈值循环数之间的关系，包括对照样本（蓝色）和实验样本（红色）。下图显示四个样本的典型扩增曲线（黑色、绿色、黄色和紫色）。注意，后者的 Ct 阈值循环数（由橙色线标记）分别为 26.0、29.5、31.0 和 32.5。

免疫荧光显微镜，IL-11/NeuN 染色，神经元鉴定，荧光分析，细胞
图 5. 双重标记免疫染色用于验证 qPCR 和 qPCR 芯片结果。 对脑片培养样本进行 IL-11（红色）和 NeuN（绿色，用于标记神经元）染色，以检测 IL-11 的细胞表达定位。注意，部分锥体神经元（箭头）显示 IL-11 与 NeuN 共染色（黄色），而少数较小的细胞（箭头），推测为星形胶质细胞，仅显示 IL-11 染色增强（红色）。

讨论

图6和图7展示了与冷预处理神经保护相关的细胞因子信号系统的两个基本重要概念。首先，在正常脑组织中，细胞因子是浓度极低的信号分子。然而，由于细胞因子具有调控基因表达的能力，其生理浓度的微小变化也具有巨大潜力来改变脑的结构与功能（即表型）（图6）。此外，细胞因子具有高度的冗余性和多效性，即多种细胞因子可产生相似效应，而单一细胞因子也可产生多种不同的效应（图7）。因此，为了准确确立冷预处理（或其他生理性预处理刺激）神经保护的内在细胞因子基础，必须对相关信号变量进行综合分析。这可通过多重检测策略实现，从而建立冷预处理神经保护的细胞因子“特征谱”。

标有尺度的猫、水果、城市景观、海岸线、地球和月球的量级对比示意图。
图6. 脑细胞因子信号的强度。 图示展示了生理浓度下脑细胞因子信号能力的巨大程度，相较于其他已被广泛认知的物质具有显著优势。浓度以距离的倒数表示，起始参考点为单根猫的胡须。钠（10-1M，以一粒胡椒表示）和钾（10-3M，以一个番茄表示）在脑间质空间中的浓度分别约为150 mM和3 mM，在神经细胞电生理功能中具有明确的重要作用。同样，pH值（即氢离子浓度约为10-7M，图示为芝加哥湖滨780米的距离）和钙离子（即浓度约为10-8M，图示为从芝加哥大学附近的麦考密克展览中心到海德公园岬角点的卫星图像中7.8 km的距离）也对脑功能调节起关键作用。此外，释放到间质空间中、浓度高于上述物质的神经递质可影响局部脑区的活动。相比之下，细胞因子（图示为地球到火星的距离）在浓度上比上述物质低一千万倍以上时，仍可改变脑功能。

细胞信号通路示意图；显示免疫应答中的细胞因子相互作用。
图 7. 固有细胞因子通路的交互式信号传导。 细胞因子具有高度冗余性和多效性，即多种细胞因子可产生相似效应，而单一细胞因子可产生多种不同效应。这种多样性源于配体、受体及磷酸化蛋白水平上发生的复杂交互信号传导。更进一步的复杂性来自于脑组织包含多种不同细胞类型，每种细胞均可发生特异性的固有细胞因子、受体及相关磷酸化蛋白的变化。为便于说明，此处仅展示源自免疫细胞研究的固有细胞因子信号通路。为简化起见，脑组织被描绘为单一细胞（白色轮廓线），显示固有细胞因子（IL-1α 和 IL-1β（本文中记为 IL-1α/β）、TNF-α、IL-6、IFN-γ 及 IL-10）、受体（IL-1R1、TNFR1、IL-6/gp130、IFNγR 和 IL-10R）以及磷酸化蛋白（即激酶 ERK1/2、P38（P38-MAPK）和 JNK）与转录因子（ATF-2、NFκB 和 STAT3）之间的潜在相互作用。例如，TNF-α 通过 TNFR1 激活 JNK、p38-MAPK 和 ERK1/2，进而通过 ATF-2 触发基因表达。TNF-α 还可通过激活 NFκB 直接调节基因表达。这些转录因子的共同激活可诱导如图所示的细胞因子及其受体表达上调（箭头）或下调（钝端）。重要的是，这些通路表明，一种细胞因子（如 TNF-α）的变化会影响其他细胞因子（如 IL-1β）的生成。因此，为准确建立冷适应诱导神经保护作用的细胞因子基础，必须对相关信号变量进行综合分析。这将确立冷适应的固有细胞因子“特征谱”。（图像根据参考文献 #25 的数据汇编而成。）

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（NS-19108）、偏头痛研究基金会和怀特基金会向 Richard P. Kraig 提供的资助支持。Marcia P. Kraig 女士协助完成了培养基的配制及脑片培养的维护工作。我们感谢 Yelena Grinberg 对本文最终版本提出的修改意见和建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脑片培养的制备
Millicell-CM 组织培养插入物（30 mm）PICM0-3050
基础伊格尔培养基21010
Earle's 平衡盐溶液E2888
马血清26050-088
Glutamax35050
庆大霉素15710-064
两性霉素B（Fungizone）15295
D-葡萄糖G8769
BSL-1 级生物安全柜
McIlwain 组织切片机
聚四氟乙烯圆盘023-49-310-1
刮勺14-373-25A
弯头虹膜剪14091-09
长直剪14002-14
长镊子13-812-40
弯头镊子11808-02
短镊子13-812-38
#5 不锈钢镊子11254-20
2 把虹膜刮勺10094-13
150 × 15 mm 培养皿08-757-148
60 × 15 mm 培养皿08-757-100B
Wild M8 体视显微镜
Gey's 平衡盐溶液G9779
Blak-Ray 短波紫外测量仪J-225
6 孔 Falcon 培养板08-772-1B
Neurobasal 培养基21103
B27 补充剂17504
Gem21 Neuroplex400-160-010
抗坏血酸A4544
CO2 分析仪#2820
脑片培养活力的预筛选
Sytox GreenS7020
DMIBRE 倒置显微镜
低温预处理
BSL-2 级生物安全柜
兴奋性毒性损伤
CoolSnap fx CCD 相机
荧光素F36915
MetaMorph 软件v. 7.5.04
100 μm 深度血细胞计数板
N-甲基-D-天冬氨酸454575
SigmaStat 软件v. 3.5
与低温预处理联合使用的共处理
sTNFR1425-R1-050
牛血清白蛋白A-4503
RNA 提取
RNAlaterAM7021
Micro RNEasy 试剂盒74004
β-巯基–乙醇03446-100
一次性 1.5 mL 无 RNA 酶研磨杵749521-1590
RNasinN261A
三（羟甲基）氨基甲烷T3069
EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐水合物）#E7889
RNA 定量
RiboGreen 检测试剂盒R11491
酵母 tRNA15401-011
1.5 mL 离心管16155500
96 孔荧光检测板DK-4000
96 孔荧光酶标仪Safire II
定量 PCR
iScript 反转录试剂盒170-8891
SYBR GreenS7563
Platinum Taq DNA 聚合酶RNA Ultrasense 11732-927
iCycler PCR 仪iCycler 光学模块
iCycler 系统软件v. 3.1
用于微阵列的定量 PCR
RNase Away#7000
RT2 第一链合成试剂盒C-03
基于 SYBR Green 的 PCR 混合液专用于 iCyclerPA-011
RT2 Profiler PCR 阵列PARN-011A
蛋白质组学检测
细胞裂解试剂盒171-304011
微量离心机Micro 7
BSA 蛋白标准品500-0007
BCA 蛋白检测试剂盒23225
Immuno 96 微孔板449824
封板膜2239444
96 孔板读板仪1420-mulilabel counter
Bioplex 大鼠 TNF-α 细胞因子检测试剂盒X0000001T
免疫染色
16% 多聚甲醛43368
赖氨酸L-6001
磷酸钠S374-1
高碘酸钠S-1878
叠氮化钠S-2002
过氧化氢（30%）H1009
山羊血清CS 0920
Triton X-100T-8787
染色皿14511
平板摇床3520
#1 滤纸（185 mm）1001-185
3,3'-二氨基联苯胺D8001
二甲基亚砜D8418
乙醇111000200
二甲苯X3S-4
Permount 封片介质SP15-100
冷冻切片机cm3050 S
Tissue-Tek27050
细头画笔11806
PAP 阻断笔22309
SFX 信号增强剂A31631
ProLong 抗荧光淬灭封片剂P7481

参考文献

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