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利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

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DOI：

10.3791/2198

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2010年9月23日

 ,  , 
1National Center for Biodefense and Infectious Diseases, Department of Molecular and Microbiology, George Mason University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们开发了一种慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还含有Rev响应元件（RRE），能够以HIV-1 Tat和Rev依赖的方式调控报告基因的表达。该载体可通过表达GFP特异性地检测活细胞中复制的HIV。

摘要

大多数HIV响应性表达载体基于HIV启动子——长末端重复序列（LTR）。尽管LTR可响应早期HIV蛋白Tat，但它也受细胞活化状态及整合位点局部染色质活性的影响。这可能导致较高的HIV非依赖性活性，从而限制了基于LTR的报告系统用于标记HIV阳性细胞的应用价值 1,2,3在此，我们构建了一种表达型慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还包含多个HIV DNA序列，其中包括Rev响应元件和HIV剪接位点。 4,5,6该载体被整合到一种慢病毒报告病毒中，可在活细胞群体中高度特异性地检测复制中的HIV。通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达来测定该载体的活性。本文所报道的该载体的应用为现有方法（例如）提供了一种全新的替代方案 原位 PCR 或 HIV 抗原染色，以鉴定 HIV 阳性细胞。该载体还可表达治疗性基因，用于基础或临床实验中靶向 HIV 阳性细胞。

方案

1. 转染质粒以产生依赖Rev的慢病毒颗粒

实验设置：Rev依赖性GFP慢病毒载体pNL-GFP-RRE-SA此前已有描述4,5,6。为组装成病毒颗粒，将该质粒与HIV-1包装质粒pCMVΔ8.2（由Dr. Dider Trono惠赠）以及携带VSV-G糖蛋白的质粒（pHCMV-G）共同转染至HEK293T细胞中。转染采用磷酸钙法进行。

缓冲液的配制：通过将5 g Hepes、8 g NaCl、0.37 g KCl、1 g 右旋糖、0.103 g Na2HPO4（无水）溶于100 mL H2O中，配制10×HBS（Hepes缓冲盐溶液）。将10×HBS缓冲液分装为每管1 mL，于-20°C保存。转染时，用H2O将10×HBS稀释为2×HBS（1:5稀释），并调节pH至7.05–7.12（配制10 mL 2×HBS通常需约50 μL 1 M NaOH）。将2×HBS缓冲液经0.22 μm Millipore滤器过滤除菌。CaCl2缓冲液的配制：将CaCl2溶于10 mM Hepes中，终浓度为2 M，调节pH至5.8，过滤除菌后于4°C保存。

实验步骤：

  1. 转染前一天，将 2 × 106 个 HEK293T 细胞接种于 100 mm 培养皿中，在 37°C、5% CO2 条件下，用 10 mL DMEM + 10% FBS 培养过夜。
  2. 次日，吸除细胞上清液，更换为 5 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS，继续培养 4 小时。
  3. 在 5 mL 聚苯乙烯管中，加入 480 μL 2× HBS 缓冲液。
  4. 在另一支 5 mL 聚苯乙烯管中，加入 60 μL 2 M CaCl2 缓冲液、质粒 DNA 和转染 TE 缓冲液（1 mM Tris，25 mM EDTA，pH 8.0），总体积补至 480 μL。每培养皿所加质粒的比例为：pNL-GFP-RRE-SA 10 μg、pCMVΔR8.3 7.5 μg 和 pHCMV-G 2.5 mg。
  5. 将质粒 DNA-CaCl2 混合液逐滴加入 2× HBS 管中，室温孵育 30 分钟，形成细小沉淀。
  6. 用移液器将 960 μL 混合液逐滴加入细胞中，于 37°C、5% CO2 条件下培养过夜。
  7. 次日，吸除上清液，加入 10 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS，继续在 37°C、5% CO2 条件下培养过夜。
  8. 转染后 48 小时，收集上清液转移至 50 mL 无菌离心管中以收获病毒。向每个培养皿中加入 10 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS，继续培养过夜。将病毒上清液置于 4°C 保存。
  9. 转染后 72 小时继续收集上清液，合并所有上清液，于 500 × g 离心 15 分钟，沉淀并去除细胞碎片。
  10. 收集上清液，经 0.22 μm Millipore 滤器过滤。病毒进一步通过尺寸排阻层析柱进行浓缩。

2. 浓缩病毒颗粒并测定病毒滴度

  1. 使用尺寸排阻柱（100,000 MW 截留，Centricoin）浓缩病毒颗粒。将病毒上清液加入柱中，在 4°C 条件下以 6,000 × g 离心 15 分钟。
  2. 收集浓缩后的病毒上清液，分装后于 -80°C 保存。
  3. 通过感染经 TNF 处理的 HIV-1 阳性 Jacket 细胞系 J1.1 7 来测定病毒滴度。将细胞以每毫升 2.5 × 105 个细胞的密度接种于 96 孔板中（总体积 100 µL），并加入 100 µL 系列稀释的 vNL-GFP-RRE-SA 病毒液感染一周。根据 Reed 和 Muench 的方法 8，通过计数表达 GFP 的阳性孔来估算病毒颗粒的滴度（TCID50）。

3. 使用慢病毒颗粒 vNL-GFP-RRE-SA 标记 HIV-1 阳性细胞

实验设置：首先用HIV-1感染人CD4 T细胞系CEM-SS。感染后48小时，用慢病毒颗粒vNL-GFP-RRE-SA对细胞进行超级感染。超级感染再持续两天后，通过流式细胞术分析GFP阳性细胞。作为对照，未感染HIV-1的CEM-SS细胞以相同方式感染vNL-GFP-RRE-SA。结果显示，只有HIV-1感染的CEM-SS细胞产生GFP阳性细胞，而未感染HIV-1的CEM-SS细胞则无GFP阳性细胞出现。

步骤：

  1. 感染前两小时，加入polybrane至终浓度为4 mg/mL。计数细胞，并为每次感染取2 × 105个细胞。用200 ng（p24）的HIV-1NL4-3感染细胞，持续2小时。
  2. 以300 × g离心10分钟洗涤细胞，将细胞重悬于2 × 105个细胞/mL，于37°C培养48小时。
  3. 计数细胞，并为每次vNL-GFP-RRE-SA感染取2 × 105个细胞。加入100 µL的vNL-GFP-RRE-SA，于37°C过夜孵育。洗涤细胞后重悬于2 × 105个细胞/mL。
  4. 在二次感染后48小时进行流式细胞术分析。将感染的细胞离心沉淀，重悬于500 µL 1%多聚甲醛中，室温孵育20分钟，随后在FACScan分析仪（Becton Dickinson）上进行检测。

4. 典型结果

如果实验成功，在 HIV-1 感染的 CEM-SS 细胞中将通过流式细胞仪检测到大量 GFP 阳性细胞群体，而在对照组中，HIV-1 未感染的 CEM-SS 细胞中则不会检测到 GFP 阳性细胞。

如果实验成功进行，依赖 Rev 的慢病毒载体 vNL-GFP-RRE-SA 将能够通过检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达，特异性地检测活细胞群体中复制的 HIV。在此示例中，收集的 CEM-SS 细胞使用 PE 标记的抗小鼠 CD24、HSA 的大鼠单克隆抗体进行染色，随后通过流式细胞仪同时分析 HSA 和 GFP 的表达情况。

流式细胞术图谱；分析GFP和HSA表达；显示HIV-1的影响；表达结果为18.9%。
图1. 如图所示，在感染HIV-1并被vNL-GFP-RRE-SA超感染的细胞中检测到大量GFP阳性细胞群（图1c）。相比之下，在未感染HIV-1的CEM-SS细胞中，无论是否进行慢病毒超感染，均未检测到GFP阳性细胞（图1a和图1b）。

讨论

与早期开发的Tat依赖性表达载体类似，此处描述的Rev系统利用了进化而来的HIV过程。引入Rev依赖性使得基于LTR的表达载体高度依赖于复制型HIV的存在。本文所报道的该载体作为一种HIV依赖性报告病毒，为识别HIV阳性细胞提供了一种全新的方法。该载体允许对活细胞进行检测，可表达任意基因用于基础或临床实验，并且作为假型慢病毒，能够感染大多数细胞类型和组织。

致谢

本工作部分由美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）向 Y. W. 提供的公共卫生服务基金 1R01AI081568 资助，以及 M. Rosen 和 Day2 公司组织的 2009 年纽约市艾滋病骑行活动的捐赠者和参与者的慷慨捐助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物安全柜
37°C 5%CO2 培养箱
流式细胞仪FACSCalibur
离心机Beckman Coulter Inc.Allega®6KR
4°C 冰箱
-20°C 冰箱
-80°C 冰箱
细胞计数仪Nexcelom BioscienceCellometer® AutoT4
HEK293T 细胞系美国国立卫生研究院
CEM-SS 细胞系美国国立卫生研究院
Jurkat 细胞系 J1.1美国国立卫生研究院
DMEMInvitrogen11965-118
RPMI 1640Invitrogen21870
HI FBSInvitrogen10438-018
HIV-1NL4-3通过将克隆的前病毒DNA转染HeLa细胞制备
pNL-GFP-RRE完全缺失pNL4-3中所有HIV ORF
pNL-GFP-RRE-SA将HIV-1 A5和D4插入pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2由Dr. Dider Trono提供
pHCMV-G
10 x HBS（HEPES缓冲盐溶液）Invitrogen11344-041
2M CaCl2 缓冲液InvitrogenS-013-154-10
1% 多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
次氯酸钠溶液（漂白剂）
50 ml Falcon 管BD Biosciences358206
5 ml 圆底管BD Biosciences352063
0.45μm Millipore 滤膜EMD MilliporeSLHA033SS
0.20μm Millipore 滤膜EMD MilliporeSLFG85000
100 mm 培养皿Sigma-AldrichCLS430588
尺寸排阻柱（100,000 MW 截断）Sartorius AGVS2041
2 ml 冻存管Axygen ScientificSCT-200
96 孔板BD Biosciences353227
1.7 mL 微量离心管Axygen ScientificMCT- 175-C

参考文献

  1. Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
  2. Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
  3. Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
  4. Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
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  7. Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
  8. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).

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标签

GFP HEK 293T CD4 T

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