通过瞬时表达带有荧光标记的目标蛋白质，并利用共聚焦显微镜分析其在细胞内和细胞间的分布，可以评估大分子在植物细胞间的转运情况。
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本文内容
摘要
摘要
在此，我们介绍一种简单快速的方案，用于检测并评估细胞间大分子转运的程度 在植株中在本实验方案中，通过基因枪将编码目标蛋白的DNA构建体递送至植物组织，实现该蛋白在植物组织中的瞬时表达，并利用荧光标记对目标蛋白进行标记。随后通过共聚焦显微镜分析标记蛋白在细胞内及细胞间的分布情况。本文详细描述了该技术，并提供了在三种植物物种中检测与评估胞间连丝介导的蛋白质运输程度的分步实验方案。 拟南芥 拟南芥, Nicotiana benthamiana 和 N. tabacum （烟草）
方案
背景
大分子通过植物细胞间连接结构——胞间连丝进行共质体运输，是许多植物病理学家和生物学家关注的研究领域。例如，已知多种病毒蛋白能够调节胞间连丝的大小排阻极限，从而促进病毒在细胞间的移动1-3。此外，一些内源性蛋白（包括重要的发育调控因子）被认为可通过胞间连丝在细胞间移动，以实现非细胞自主性的功能4。因此，建立一种可靠的方法来鉴定和可视化植物细胞间的大分子运输，已成为当前迫切需要的技术手段。
1) 培养目标植物
为了获得高转化效率，应使用健康、健壮的植株。
1. 拟南芥 植物
在环境控制培养室中，将一株 Arabidopsis 种植于 Pro-Mix BX 培养基质中，使用规格为 10 cm × 10 cm × 10 cm 的花盆，培养条件为短日照周期（光照 8 小时，光强 130–150 μE m-2 s-1，温度 23°C；黑暗 16 小时，温度 20°C），相对湿度保持在 40–65%，培养 6 至 8 周5。根据文献描述5，定期使用市售肥料进行施肥。选择叶片尺寸大于 15 mm × 35 mm（长度测量包含叶柄）的植株用于实验。
2. N. benthamiana 和 N. tabacum
在环境控制培养室中，将一株植物种植于 Pro-Mix BX 培养基中，使用规格为 20 cm × 20 cm × 20 cm 的花盆，培养条件为长日照周期（16 小时光照，光照强度为 130–150 μE m-2 s-1，温度 23°C；8 小时黑暗，温度 20°C），相对湿度保持在 40–65%，培养 7 至 10 周。根据说明偶尔施用市售肥料。实验选用叶片尺寸大于 50 mm × 70 mm 的 N. benthamiana 植株，或大于 100 mm × 125 mm 的 N. tabacum 植株（上述长度测量不包括叶柄）。
2) 使用DNA包被的金微粒制备基因枪载体
该实验步骤的方案此前已有详细描述6。为在实验后期便于进行共聚焦显微镜分析，并获得最高的转化效率，使用高浓度（~1 μg/μl）且纯度良好的质粒DNA至关重要。
对于该实验，重要的是要确认制备的载弹在高频轰击下不会同时转化两个或多个相邻细胞，因为与荧光信号簇相关联的细胞数量被用作评估共质体运输程度的指标（即，单个细胞含有信号表明无运输发生，而多细胞信号簇则表明发生了运输）。每个载弹的质量可通过在轰击后16–20小时分析蛋白表达情况进行检测。我们的方案6 仅产生多细胞表达簇的试剂盒 <在此时间范围内，所有表达事件的3%，因此适用于本实验。
3) 基因枪递送DNA包被的微粒
- 使用锋利的剃须刀片切下处于相同发育阶段（即大小和年龄相同，参见步骤1）的叶片，并立即将其背面朝上放置于平整的泡沫塑料表面。由于叶片背面的毛状体密度较低且角质层较薄，因此更适合作为轰击的受体表面。Arabidopsis叶片因其相对较小，应覆盖一层窗纱网，并用图钉将网固定在泡沫塑料表面上。保持叶片平整可提高微粒递送效率，并在微轰击过程中最大限度减少组织损伤。
- 将含有DNA包被微粒（按步骤1制备）的弹匣插入基因枪中。对于Arabidopsis，使用1-μm微粒时轰击压力为80–110 psi，使用0.6-μm微粒时为140–160 psi；对于N. benthamiana和烟草，使用1-μm微粒时压力为100–120 psi，使用0.6-μm微粒时为160–180 psi。对于Arabidopsis，通常每片叶片使用一个弹匣，因为每片叶片仅能提供足够一次轰击的表面积，微粒扩散区域直径约为10–12 mm。对于较大的N. benthamiana和烟草叶片，可在同一叶片上进行多次轰击，但必须在中脉两侧对称位置进行，以确保靶向相同发育阶段的叶片区域（见讨论部分）。
- 将叶片从泡沫塑料表面取下，置于培养皿中的三层湿润Whatman滤纸上，用Parafilm密封培养皿，并在室温下孵育36–48小时，以允许转入基因的表达及其蛋白产物在细胞间的潜在移动。
4）蛋白质表达成像
通过共聚焦显微镜观察瞬时表达的标记蛋白的荧光信号。应仔细调整显微镜的设置，以获得每种待测蛋白的最佳检测条件。例如，对于细胞内积累有限且信号强度较弱的蛋白，如烟草花叶病毒运动蛋白（TMV MP）在胞间连丝的定位1-3,6，应使用40X物镜进行观察，以获得更高的分辨率和灵敏度；而对于在细胞质中广泛分布且信号较强的蛋白，如游离YFP，则可使用10X物镜结合共聚焦缩放功能进行快速成像（见图1）。
通过观察含有荧光信号的多细胞簇的出现可推断共质体运输情况。此类细胞簇的数量及每个簇中所含细胞的数目反映了细胞间运输的程度。为获得可靠数据，每种实验体系至少应记录100个表达簇。例如，若比较某种蛋白质在两种不同遗传背景（如野生型和转基因植株）中的细胞间移动能力，则总共应记录200个表达簇。重要的是，相互比较结果的实验应同时进行。
5. 代表性结果
下图展示了检测荧光标记蛋白胞间连丝运输的代表性实验。图A和图B显示了将表达TMV MP-YFP的构建体微弹轰击到N. benthamiana叶片后获得的典型共聚焦图像。在图A中，通过观察到YFP信号的多细胞簇，可判断TMV MP-YFP发生了胞间连丝运动。并非所有瞬时表达的TMV MP-YFP均能发生移动，部分微弹轰击结果显示为单细胞信号（图B），表明其运动受限。统计结果显示，在<40%的计数信号簇中，TMV MP-YFP无法在细胞间移动；而在>60%的信号簇中，该蛋白可在2-5个细胞间移动，其中以两个细胞的扩散最为常见（约占50%）（图1C）。
相对分子质量较小且无内在运动活性的蛋白质可通过胞间连丝（PD）在细胞间扩散。例如，游离的YFP或1xYFP（约27 kDa，图D）在30%的计数簇中可扩散至数个细胞（图C）。而对于翻译融合的YFP二聚体（2xYFP，54 kDa，图E），这种非特异性扩散则不会发生；其分子大小与烟草花叶病毒运动蛋白-YFP融合蛋白（TMV MP-YFP，57 kDa）相近，且完全局限于单个细胞内（图1C）。
图 1. 在 N. benthamiana 叶片组织中进行胞间连丝运输实验所获得的典型结果。(A, B) TMV MP-YFP 的可视化。(C) 信号簇的定量分析。1xYFP 和 2xYFP 分别代表游离 YFP 和翻译融合型 YFP 二聚体。(D) 1xYFP 的可视化。(E) 2xYFP 的可视化。显微图像中，左侧面板显示 YFP 信号，右侧面板显示 YFP 信号（绿色）与叶绿体自发荧光信号（白色）的叠加图像。图像为单层共聚焦切片。显微图中的星号标记了显示 YFP 信号的表皮细胞。标尺 = 50 μm。
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讨论
胞间连丝运输实验成功的关键在于获得高效的转化效率，从而产生具有统计学意义且易于检测的信号簇。为此，应使用从健康、健壮的植株上采集的叶片，并采用纯度高、浓度高的DNA制备物包裹金颗粒，以实现这一目标。
使用处于相同生长阶段的叶片对于确保检测的可靠性也至关重要。已知胞间连丝孔径会因组织发育阶段的不同而受到差异性调控7-11。许多植物物种的叶片以向基性方式发育，即从顶端向基部展开，叶片顶端部分比基部更成熟12。因此，不仅应选择发育阶段相同（通常通过叶片大小和在茎上的位置反映）的叶片用于每组实验，而且微轰击所针对的叶片区域也应位于相同的位置。
一些早期研究采用细胞自主性标记物，例如内质网锚定型绿色荧光蛋白（erGFP）11，以区分最初被转化的细胞与通过共质体运输获得测试蛋白的细胞。然而，后续一项研究表明，某些非细胞自主性蛋白与erGFP共表达时可诱导erGFP发生细胞间移动13，这质疑了erGFP作为初始转化标记物的可靠性，并显著增加了此类共表...
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致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）、美国国家科学基金会（NSF）、美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）以及BARD向VC提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 直径为1.0 μm的金微粒 | Bio-Rad | 165-2262 | |
| 直径为0.6 μm的金微粒 | Bio-Rad | 165-2263 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel管路 | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios基因枪弹制备站 | Bio-Rad | 165-2420 | |
| 管路切割器 | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios基因枪 | Bio-Rad | 165-2432 | |
| 氦气调节器 | Bio-Rad | 165-2413 |
参考文献
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重印与许可
