通过瞬时表达带有荧光标记的目标蛋白质，并利用共聚焦显微镜分析其在细胞内和细胞间的分布，可以评估大分子在植物细胞间的转运情况。
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本文内容
摘要
摘要
在此，我们介绍一种简单快速的方案，用于检测并评估细胞间大分子转运的程度 在植株中在本实验方案中，通过基因枪将编码目标蛋白的DNA构建体递送至植物组织，实现该蛋白在植物组织中的瞬时表达，并利用荧光标记对目标蛋白进行标记。随后通过共聚焦显微镜分析标记蛋白在细胞内及细胞间的分布情况。本文详细描述了该技术，并提供了在三种植物物种中检测与评估胞间连丝介导的蛋白质运输程度的分步实验方案。 拟南芥 拟南芥, Nicotiana benthamiana 和 N. tabacum （烟草）
方案
背景
大分子通过植物细胞间连接结构——胞间连丝进行共质体运输，是许多植物病理学家和生物学家关注的研究领域。例如，已知多种病毒蛋白能够调节胞间连丝的大小排阻极限，从而促进病毒在细胞间的移动1-3。此外，一些内源性蛋白（包括重要的发育调控因子）被认为可通过胞间连丝在细胞间移动，以实现非细胞自主性的功能4。因此，建立一种可靠的方法来鉴定和可视化植物细胞间的大分子运输，已成为当前迫切需要的技术手段。
1) 培养目标植物
为了获得高转化效率，应使用健康、健壮的植株。
1. 拟南芥 植物
在环境控制培养室中，将一株 Arabidopsis 种植于 Pro-Mix BX 培养基质中，使用规格为 10 cm × 10 cm × 10 cm 的花盆，培养条件为短日照周期（光照 8 小时，光强 130–150 μE m-2 s-1，温度 23°C；黑暗 16 小时，温度 20°C），相对湿度保持在 40–65%，培养 6 至 8 周5。根据文献描述5，定期使用市售肥料进行施肥。选择叶片尺寸大于 15 mm × 3....
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讨论
胞间连丝运输实验成功的关键在于获得高效的转化效率，从而产生具有统计学意义且易于检测的信号簇。为此，应使用从健康、健壮的植株上采集的叶片，并采用纯度高、浓度高的DNA制备物包裹金颗粒，以实现这一目标。
使用处于相同生长阶段的叶片对于确保检测的可靠性也至关重要。已知胞间连丝孔径会因组织发育阶段的不同而受到差异性调控7-11。许多植物物种的叶片以向基性方式发育，即从顶端向基部展开，叶片顶端部分比基部更成熟12。因此，不仅应选择发育阶段相同（通常通过叶片大小和在茎上的位置反映）的叶片用于每组实验，而且微轰击所针对的叶片区域也应位于相同的位置。
一些早期研究采用细胞自主性标记物，例如内质网锚定型绿色荧光蛋白（erGFP）11，以区分最初被转化的细胞与通过共质体运输获得测试蛋白的细胞。然而，后续一项研究表明，某些非细胞自主性蛋白与erGFP共表达时可诱导erGFP发生细胞间移动13，这质疑了erGFP作为初始转化标记物的可靠性，并显著增加了此类共表.......
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致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）、美国国家科学基金会（NSF）、美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）以及BARD向VC提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 直径为1.0 μm的金微粒 | Bio-Rad | 165-2262 | |
| 直径为0.6 μm的金微粒 | Bio-Rad | 165-2263 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel管路 | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios基因枪弹制备站 | Bio-Rad | 165-2420 | |
| 管路切割器 | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios基因枪 | Bio-Rad | 165-2432 | |
| 氦气调节器 | Bio-Rad | 165-2413 |
参考文献
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell....
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