从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

摘要

在本视频中，我们将演示如何从小鼠眼球的睫状上皮中分离视网膜干细胞，并在体外培养以形成克隆性视网膜球体。所获得的球状细胞集落具有干细胞的核心特性：自我更新能力与多向分化潜能。

摘要

成年小鼠视网膜干细胞（RSC）是哺乳动物眼球睫状体上皮（CE）中一种罕见的静息态细胞^1,2,3睫状缘（CE）由非色素性内层细胞和色素性外层细胞组成，起源于CE单个色素细胞的克隆性RSC集落包含色素性和非色素性细胞，这些细胞可分化为神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）的所有细胞类型。关于球形集落内所有细胞是否均含有至少一定量的色素，目前仍存在争议。⁴；然而这些细胞仍具有形成视网膜神经层内各种细胞类型的能力^1-3在某些物种中，例如两栖动物和鱼类，其眼睛在受伤后具有再生能力。⁵然而，哺乳动物的眼睛并不具备这种再生能力。我们旨在鉴定出干细胞 体内 并理解维持哺乳动物视网膜干细胞处于静息状态的机制^6-8，即使在损伤后仍具有活性，并可作为细胞来源，通过移植帮助修复眼部损伤的物理或遗传模型^9-12在此，我们描述了如何从鼠眼分离睫状上皮细胞，并在体外培养中培育这些细胞以形成克隆性视网膜干细胞球。由于目前尚无已知的干细胞特异性标记物 体内这些球体是目前已知唯一能够前瞻性鉴定眼睫状上皮中干细胞群体的方法。

方案

1. 准备解剖溶液和酶溶液

1. 提前配制人工脑脊液（ACSF）和无血清培养基，并冷藏保存。
2. 称取犬尿酸（Kynurenic Acid）（0.2 mg/mL），加入10 mL高糖ACSF中，在37°C水浴中提前溶解，因其不易溶于水。
3. 称取胰蛋白酶（Trypsin）（1.33 mg/mL）和透明质酸酶（Hyaluronidase）（0.67 mg/mL），置于同一15 mL离心管中，-20°C保存备用；使用前将犬尿酸溶液加入此管，并用22 μm注射器滤器过滤。
4. 称取胰蛋白酶抑制剂（Ovamucoid：1 mg/mL），溶于温热的无血清培养基中，并用22 μm注射器滤器过滤。
5. 配制铺板培养基：含FGF2（10 ng/mL）和肝素（Heparin）（2 μg/mL）的无血清培养基。

2. 从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

1. 视网膜干细胞的分离在专门用于原代培养实验的无菌房间内进行。开始此操作前，先设置好解剖显微镜和冷光源，然后摆放好无菌的解剖器械。每个超净台均配备一个灼烧灭菌器，用于各步骤之间对器械进行灭菌。
2. 我们将从刚被摘除的小鼠眼球中分离视网膜干细胞，这些眼球在按照批准的动物伦理协议处死后，立即放入含有人工脑脊液（ACSF）的无菌培养皿中。
3. 在解剖显微镜下，用镊子清洁眼球：去除附着在角膜/巩膜交界处的毛发和结缔组织。然后将眼球转移至另一含有 ACSF 的新培养皿中。
4. 用齿镊轻轻固定眼球使其保持静止，使用斜面显微解剖剪剪除眼外肌。如果视神经仍附着在眼球上，也一并去除。在此过程中尽量避免挤压眼球。将眼球转移至另一含有 ACSF 的新培养皿中。
5. 接下来使用弯头显微解剖剪将眼球沿中线剪成两半：从视神经处开始，沿角膜中央剪开，最终回到起始的视神经位置。若两半眼球大小大致相等，则更有利于下一步操作。
6. 用两把镊子夹住角膜部分，轻轻将两半眼球分开。去除并丢弃晶状体、玻璃体以及神经视网膜，仅保留眼球壳。将眼球壳转移至另一含有 ACSF 的新培养皿中。
7. 现在我们准备分离睫状体上皮。首先，将眼球壳调整方向，使角膜位于右侧，视网膜色素上皮（RPE）位于左侧。用直头镊子在 RPE 侧轻轻固定眼球壳。
8. 接着，使用解剖刀轻轻下压（而非来回锯动）将角膜和虹膜从睫状体上皮上切下。
9. 随后，将睫状体上皮从 RPE 上切下。使用无齿镊将一段睫状体上皮转移至另一含有 2 mL ACSF 的 35 mm 培养皿中。
10. 以相同方法，从另一侧眼球壳中分离睫状体上皮。
11. 待两段睫状体上皮均收集完毕后，将组织条转移至含有 2 mL Dispase 的 35 mm 培养皿中。将培养皿连同组织条一起放入 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。
12. 10 分钟后，将组织条从 Dispase 溶液转移至另一含有 2 mL 过滤后的胰蛋白酶、透明质酸酶和犬尿酸的培养皿中。将培养皿置于 37 °C 条件下继续孵育 10 分钟。
13. 现在回到解剖显微镜下操作。用直头镊固定巩膜，使用弯头无齿镊的底部轻轻刮擦，将睫状体上皮从巩膜上分离。
14. 将巩膜从培养皿中移除。此时培养皿中仅应保留目标细胞和酶解液。
15. 使用火焰抛光的棉塞玻璃移液管，将上述溶液转移至 14 mL 离心管中。轻轻吹打溶液约 30 次，使上皮细胞充分解离。
16. 将离心管以 1500 RPM 离心 5 分钟。离心结束后，小心取出离心管，因为此时细胞容易从管底脱落。
17. 用火焰抛光的移液管小心吸除大部分上清液，然后向细胞沉淀中加入 1 mL 含血清-free培养基的胰蛋白酶抑制剂。使用小口径棉塞移液管吹打约 50 次，直至形成单细胞悬液。
18. 再次以 1500 RPM 离心 5 分钟。
19. 吸除上清液，并替换为 1 mL 铺板培养基。使用火焰抛光的玻璃移液管轻轻吹打，重悬细胞。
20. 细胞计数后，按所需密度接种至 24 孔板中。我们通常以 10 个细胞/μL 的密度进行铺板，即先在每孔中加入培养基，再加入细胞悬液，最终每孔培养液体积为 500 μL。
21. 将培养板放入 37 °C CO₂ 培养箱中，期间避免移动，直至 7 天后观察并计数形成的细胞球。

3. 视网膜干细胞的分离结果

1. 当该操作成功实施后，分离的睫状体上皮细胞在解离并低密度接种培养后应呈现如下形态（图1）。
2. 培养7天后，对形成的视网膜干细胞球进行计数。只有直径超过75 μm且呈游离悬浮状态的细胞球才可被计为干细胞来源的细胞球（图2）。然而，部分细胞增殖能力有限，会形成不符合尺寸标准的类球体，此类结构不计入干细胞来源的细胞球；此类类球体的示例如下所示（图2）。

4. 典型结果

图1.

图2.

讨论

本方案描述了如何从小鼠眼睛的睫状体上皮中分离视网膜干细胞^1-3。分离睫状体上皮条带的方法可能有所不同，但本方案已优化了获得单细胞悬液所用的酶和操作步骤。此外，分离得到的睫状体上皮条带应避免含有大量视网膜色素上皮（RPE）或角膜组织，因为这些组织似乎会对每只眼睛所能分离得到的球状体总数产生不利影响。同时，我们配制的无血清培养基最初是为脑源性神经球设计的¹³，也非常适合视网膜干细胞球的培养。还应注意，在细胞接种并放入培养箱后，应避免扰动细胞，以防止生长中的球状体发生聚集¹⁴。

视网膜干细胞形成克隆球后，可对其进行计数，以获得每只眼球中干细胞的预期数量。随后可将这些细胞球解离为单个细胞，并进行传代培养以确定其自我更新能力，或通过不同组合的生长因子和/或蛋白质诱导其分化为神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）中的各类细胞类型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Stemi 2000 显微镜	Carl Zeiss, Inc.
冷光源	Carl Zeiss, Inc.	KL1500	双臂光纤照明
弯曲微型 Vannas 剪刀	Fine Science Tools	15000-10
斜角 Vannas 剪刀	Fine Science Tools	15005-08
#7 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11272-30	无齿
#5 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11251-10	直头
精细镊子	Fine Science Tools	11051-10	有齿弯曲
#3 手术刀柄	Almedic	2586-M36-10
#10 手术刀片	Almedic	2580-M90-10
电热灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
Dispase	VWR international	CACB354235
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T1005
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H6254
犬尿烯酸	Sigma-Aldrich	K3375	1000 IU
胰蛋白酶抑制剂	Roche Group	10109878001
35 mm 培养皿	VWR international	CA354235
24 孔板	VWR international	CA73521-004
带棉塞移液管	VWR international	14672-400	火焰抛光
14 mL 管	Falcon BD	352057	聚苯乙烯
无血清培养基			配方参见编号 13
FGF2	Sigma-Aldrich	F0291
肝素	Sigma-Aldrich	H3149	100 IU