用于力学动态细胞培养的微加工平台

摘要

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。

摘要

系统探究的能力 体外 细胞对机械生物学刺激组合的响应在组织工程、药物发现或基础细胞生物学研究中受到现有生物反应器技术的限制，因为这些技术无法同时向培养细胞施加多种机械刺激。为解决这一问题，我们开发了一系列微加工平台，旨在以高通量形式筛选机械刺激的影响。在本方案中，我们演示了基于垂直位移微柱阵列的微致动器阵列的制备方法，该阵列构成了该技术的基础；并进一步展示了如何改造这一基础技术，以在二维和三维培养模式下实现高通量、机械动态的细胞培养。

方案

A. 装置描述与操作

采用多层软光刻技术制备器件¹ 在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中制备，能够在微加工阵列中各个独立的细胞培养区域同时产生一系列机械条件。本方案首先描述了制造气动驱动微柱阵列的步骤，随后介绍了对装置进行改造以实现在二维（2D）和三维（3D）培养模式下机械动态培养的步骤。该微加工方法相较于现有的宏观系统提高了通量，特别适用于筛选多种机械条件的影响。

该装置的工作原理基于一组垂直驱动的微柱阵列。微柱加工在自由悬浮的膜片上，通过在驱动膜片下方施加正压和负压，使微柱上升或下降（图1）。该阵列的一个关键特征是，通过改变驱动膜片的尺寸，可利用单一压力源在阵列上实现多种垂直位移。该原理被用于在单个装置上快速筛选细胞对大量不同力学刺激条件的响应。

基于 Schaffer 提出的类似宏观尺度设计 等²我们的设计在柱体上方设置了第二层悬浮且润滑的细胞培养膜，使细胞在培养膜滑过升高的加载柱时，能够经历二维基底的形变。或者，也可通过光刻技术在加载柱上构建负载细胞的水凝胶阵列，从而实现对三维培养中细胞的压缩刺激。以下将详细介绍这些系统的搭建步骤。

B. 气动微驱动器阵列的制备

制造气动微执行器阵列需要....

讨论

尽管概念上简单，但器件制备确实需要一定的实验技巧和实践经验。特别是在二维细胞培养的情况下，器件中多层结构的对准可能具有挑战性，尤其是在大面积阵列上。从实际操作角度看，当多层之间相邻特征的间距公差为50 μm时，我们能够可靠地实现100%的对准成功率。我们还成功实现了低至15 μm公差的对准，但所需对准时间显著增加，且成功率较低。将掩模对准以在阵列上光刻图案化生物材料同样具有挑战性，但与水凝胶柱相比，可以将定位柱设计得足够大，从而缓解这一限制。

其他挑战涉及本方案所述材料上的细胞培养。在二维拉伸系统中，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为培养膜会将生物学研究限制在短期实验范围内，因为刺激6小时后，细胞对基底的黏附会受到显著影响。这一问题可通过将基质蛋白共价结合到PDMS表面¹¹来解决，或通过用更具临床相关性的聚氨酯材料替代PDMS细胞培养基底，以改善细胞黏附性并提高生物学实验的灵活性¹²。在所述的三维系统中，水凝胶化学组成仅作为示例性说明。长期培养贴壁细胞需要使用其他天然或合成水凝胶，或在聚乙二醇（PEG）基质中引入黏附性配体（可通过标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 PDMS 单体与交联剂试剂盒	Dow Corning
SU-8 母模
硅烷化试剂：(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷	United Chemical Technologies
泡沫垫			工艺用品商店，1–2 mm 厚
喷墨胶片	Grand Toy
有机玻璃板
C 型夹			五金商店
显微操作系统	Siskiyou, Inc.
定制真空支架
视觉系统，Navitar 12 倍变焦	Navitar
连接管	VWR international	Clay Adam Intramedic PE190
钝头 18G 针头	Small Parts (www.smallparts.com)
偏心隔膜微型泵	Schwarzer Precision	SP 500 EC-LC 4.5V 直流
电磁阀	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
电磁阀阀组	Pneumadyne	MSV10-1
函数发生器
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯	Sigma-Aldrich
聚乙二醇二丙烯酸酯 3.4 kDa	Laysan Bio Inc.
聚乙二醇 8 kDa	Sigma-Aldrich
光引发剂 Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals
1-乙烯基-2-吡咯烷酮	Sigma-Aldrich
标准细胞培养试剂