用于力学动态细胞培养的微加工平台

摘要

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。

摘要

系统探究的能力 体外 细胞对机械生物学刺激组合的响应在组织工程、药物发现或基础细胞生物学研究中受到现有生物反应器技术的限制，因为这些技术无法同时向培养细胞施加多种机械刺激。为解决这一问题，我们开发了一系列微加工平台，旨在以高通量形式筛选机械刺激的影响。在本方案中，我们演示了基于垂直位移微柱阵列的微致动器阵列的制备方法，该阵列构成了该技术的基础；并进一步展示了如何改造这一基础技术，以在二维和三维培养模式下实现高通量、机械动态的细胞培养。

方案

A. 装置描述与操作

采用多层软光刻技术¹在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中制备装置，该装置能够在微加工阵列中各个独立的细胞培养区域同时产生一系列机械条件。本实验方案首先描述了制备 pneumatically-actuated micropost 阵列的步骤，随后介绍对装置进行改造以实现在二维（2D）和三维（3D）培养模式下机械动态培养的步骤。所述微加工方法相较于现有的宏观系统提高了通量，特别适用于筛选多种机械条件的影响。

该装置的工作原理基于一组垂直驱动的微柱阵列。微柱加工在自由悬浮的膜片上，通过在驱动膜片下方施加正压和负压，使微柱上升或下降（图1）。该阵列的一个关键特征是，通过改变驱动膜片的尺寸，可利用单一压力源在阵列上实现多种垂直位移。该原理被用于在单个装置上快速筛选细胞对大量不同力学刺激条件的响应。

基于 Schaffer 等人等²提出的类似宏观尺度设计，我们的设计在支柱上方增加了一层悬浮且润滑的细胞培养膜，使细胞在培养膜相对于升高的加载支柱滑动时，能够经历二维基底形变。或者，通过光刻技术在加载支柱上图案化排列载有细胞的水凝胶阵列，可实现对三维培养中细胞的压缩刺激。以下为建立这些系统的详细操作步骤。

B. 气动微驱动器阵列的制备

制造气动微执行器阵列需要在多层PDMS结构中实现严格的对准。由于收缩引起的对准误差，这一过程具有挑战性。为解决此问题，我们采用了一种称为“三明治模具制造”的 fabrication 工艺³，该方法已被证明能有效消除这一问题⁴。

材料准备

1. 针对各个层级的单层或多层 SU-8 模具母版在洁净室中采用标准工艺制备。对于这些器件，母版厚度为 200–400 μm，具体取决于应用需求。使用前需将母版在 80 °C 下硬烘焙三天。
2. 将载玻片和 SU-8 母版在真空腔室中进行硅烷化处理，以防止固化后的 PDMS 粘附于材料表面。在通风橱内，将 60 μL 硅烷化试剂（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷）（United Chemical Technologies，宾夕法尼亚州布里斯托尔）移液至腔室内的培养皿中。将未处理的玻璃片和 SU-8 母版放入腔室，并在真空条件下放置过夜。
3. 裁剪两块泡沫垫（可在工艺用品商店购得）以及一张喷墨打印用透明胶片，使其尺寸略大于用于制作夹心模具的 SU-8 母版。

三明治模具制备

1. 多层器件的每一层都需要使用此方法模制的PDMS层。图1提供了三明治模具制备过程的示意图。
2. 将PDMS单体与交联剂按标准的10:1比例充分混合。取3 mL未固化的PDMS混合物滴加至先前制备的SU-8模具上，并在真空腔中脱气。
3. 将泡沫垫和SU-8模具放置在有机玻璃底板上。
4. 将透明胶片小心地压在未固化的PDMS上，注意避免夹入任何气泡。喷墨打印用透明胶片有一面粗糙、一面光滑，必须确保光滑面与未固化的PDMS接触。
5. 在透明胶片上方放置一片硅烷化玻璃盖片，再在其上覆盖第二块泡沫垫和一块有机玻璃顶板。然后使用C型夹具将整个三明治结构夹紧。
6. 将PDMS三明治结构置于80 °C烘箱中固化至少4小时。
7. 从烘箱中取出三明治结构，待其冷却后再拆除夹具。
8. 拆除夹具并拆开三明治结构，丢弃泡沫垫。小心地将透明胶片从SU-8模具上剥离，保留带有图案的PDMS薄膜。
9. 这些带有图案的PDMS层及其附着的透明胶片可储存在无尘环境中，直至使用。我们已成功使用存放达两个月的PDMS层，未观察到明显的不利影响。

构建多层装置

图2A展示了微驱动器阵列的制备示意图，图2B和图2C展示了驱动器的工作过程。制备该装置的步骤如下：

1. 最底层的图案化PDMS层通过三明治模具法制备。在这些实验中，使用了直径范围为600至1200 μm的圆形图案。
2. 然后将PDMS层转移至洁净的玻璃载片上。使用电晕放电装置对PDMS和玻璃表面进行氧等离子体处理，并使两个表面相互贴合。将该叠层置于80 °C的加热板上，以完成键合过程。随后可将透明基板剥离并丢弃。在此过程中，图案化PDMS薄膜始终未从刚性基底上释放，从而防止各层发生收缩。
3. 根据三明治成型步骤的成功程度，可能需要手动去除残留在SU-8结构与透明基板之间的未被挤出的薄层PDMS。此操作可在体视显微镜下使用25G针头完成。
4. 第二层三明治成型层作为所需膜片-柱结构的负复制模具而形成。这是因为大面积SU-8母模的制备具有挑战性，但若采用其他制造工艺，则可能省去此额外步骤。在本演示中，使用了直径为500 μm的圆形柱结构。该负复制模具经硅烷化处理后，暂时用双面胶带固定于玻璃载片上。将未固化的PDMS滴加、脱气后，在该三明治模具层上以1000 RPM转速旋涂45秒，形成厚度为60 μm的驱动膜片。旋涂后的PDMS层在80 °C下部分固化约20分钟，或直至PDMS表面发黏但触碰时不会永久变形。
5. 将玻璃载片和双面胶带从部分固化的PDMS层上移除，随后对该层进行等离子体处理，翻转后置于定制的对准装置中。该对准装置由安装在微操纵器（Siskiyou；Mission Viego, CA, USA）上的真空吸盘构成。将第一层PDMS同样进行等离子体处理后，放置于真空吸盘下方的旋转台（Newmark, Grants Pass, OR, USA）上，并利用Navitar 12倍变焦机器视觉系统（Navitar；Rochester, NY, USA）观察两层之间的对准情况。
6. 通过微操纵器对两层进行对准，并小心地使其接触。随后将三明治结构从对准装置中取出，在80 °C烘箱中进一步固化30分钟。之后可将透明基板和硅烷化的复制PDMS模具从器件上剥离并丢弃。器件随后在80 °C下完全固化至少四小时。
7. 根据所进行的机械刺激实验类型，可通过重复上述流程将额外的PDMS层键合至该基础器件上。不同类型机械刺激实验的具体细节见C和D节。

连接器

1. 设备完成后，可使用针头在连接点处打通PDMS层。
2. 随后可使用商用连接器（如Nanoport，Upchurch Scientific；Oak Harbor，WA，USA）与外部管路连接。为避免商用连接器的高度限制，从而能够使用标准培养皿作为装置容器，我们自行制备连接器，方法如下。
3. 将约35 g PDMS浇注并固化于Omni-well培养盘（Nunc；Rochester，NY，USA）中。将固化后的PDMS剥离，并切割成小段垫圈，再用打孔器在每段上打出一个1/8英寸的孔。
4. 使用一支18G钝头针从垫圈侧面钻取一段圆柱形孔洞。在取出18G针头前，先用较细的21G针头移除中心的PDMS芯。
5. 将约15 g PDMS浇注并固化于Omni-well培养盘盖中，剥离后切割成与垫圈相似尺寸的片状。将该片状PDMS用透明胶带清洁表面，经等离子体键合至垫圈顶部，再将整个单元等离子体键合至微流控芯片上，键合时打孔面朝下。
6. 将另一支钝头18G针从其彩色塑料鲁尔接头分离，插入已钻好的孔洞中，并用数滴PDMS密封固定。所制成的连接器性能良好、成本低廉，且具有足够的死体积，可在液体填充阶段有效防止气泡进入微通道。

C. 力学活性二维培养基质

可驱动的微柱阵列可用于在悬浮的聚合物薄膜上产生多种应变分布，细胞即培养于该薄膜上。将微柱升入润滑的薄膜中，会导致薄膜在微柱周围滑动并发生形变。使用圆形加载微柱可产生等双轴应变分布，但该设计具有良好的灵活性，可通过采用不同形状的微柱来生成多种应变场。为将驱动器阵列改造用于二维培养实验（示意图见图3）：

1. 如图3a所示，将第三层PDMS键合到装置上。第三层PDMS由双层结构组成：下层圆环与驱动微柱下方驱动腔的尺寸相匹配；上层圆环的直径比加载柱的直径大100 μm。一个200 μm宽的微通道将这些结构连接至连接区域，用于润滑加载柱和培养膜。
2. 按照前述方法制备并键合连接器至装置。
3. 在透明胶片的光滑面旋涂一层10–15 μm厚的PDMS（旋涂参数：4000 RPM，120秒），并在80 °C下固化至少4小时。
4. 对执行器施加低水平真空（使用Barnant Air Cadet抽吸泵），使柱阵列下降。
5. 对旋涂后的PDMS膜进行等离子体处理，并将其键合至驱动微装置上，随后置于80 °C热板上10分钟。此时，微柱和培养膜将短暂保持亲水性。
6. 用含90%甘油的去离子水溶液填充润滑通道。该溶液除起润滑作用外，还可长期维持PDMS的亲水性，降低摩擦系数。空气气泡会滞留在微柱与培养膜之间。将装置置于40 °C热板上，并持续向通道内注入润滑液，产生轻微压力升高。数分钟后，气泡将透过PDMS扩散，所有表面均被充分润滑。
7. 撤除负压，释放微柱。
8. 使用手术刀沿薄PDMS膜边缘切割，并小心地将透明胶片背衬从装置上剥离。
9. 在装置的细胞培养区域周围，使用手工切割的PDMS垫圈进行等离子体键合。
10. 将装置浸入70%乙醇中5分钟，随后在生物安全柜内经杀菌紫外灯照射45分钟，以完成灭菌。
11. 对表面进行等离子体处理，并在4 °C条件下与100 μg/mL胶原蛋白（或其他ECM蛋白）孵育过夜。
12. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗装置，并按照标准细胞培养规程，在10–15000个细胞/cm²的密度下接种细胞。

有关该平台上的微装置操作及生物学实验的详细表征已在其他文献中发表⁷。

D. 力学活性三维水凝胶

该装置的改进还可用于高通量压缩光图案化、含细胞的三维水凝胶。在此示例中，我们制备了直径为 350 μm 的聚乙二醇（PEG）水凝胶圆柱体，其中包埋了 C3H10T1/2 小鼠间充质干细胞，并在阵列上施加 5% 至 25% 的压缩应变。本方案可结合更先进的水凝胶光聚合化学方法使用。若要将该平台用于三维力学生物学实验（示意图见图 4）：

设备改装：

1. 在支架上涂覆一层1 μm厚的聚对二甲苯-C（Parylene-C），以降低气体渗透性，并改善聚乙二醇（PEG）水凝胶体系中的聚合时间。这将减少基于自由基的光聚合反应对细胞的毒性作用。使用透明胶带遮蔽支架周围的区域，并在PDS 2010 LabCoter 2系统（Specialty Coating Systems；Indianapolis, IN, USA）中进行涂覆。
2. 将已涂覆的装置从涂覆系统中取出，撕去透明胶带，使聚对二甲苯-C在支架表面形成一层均匀的包覆层。
3. 通过将玻璃盖玻片浸入含有2%（v/v）3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯的95%乙醇溶液中2分钟，使其发生甲基丙烯酰化⁸。
4. 将盖玻片用100%乙醇冲洗，并在100 °C下烘烤，使表面保留甲基丙烯酰基团。
5. 在培养皿中浇铸一层200 μm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）间隔膜，并将其切割成小片。取其中四片小片，通过等离子体键合方式固定在甲基丙烯酰化处理的盖玻片边缘周围。
6. 然后将这些间隔片通过等离子体键合连接至装置的PDMS区域，覆盖住已涂覆聚对二甲苯-C的支架。
7. 通过在70%乙醇中清洗，并在生物安全柜中暴露于杀菌紫外光下45分钟，对装置进行灭菌处理。

原位聚合：

随后通过光刻技术将含细胞的聚乙二醇水凝胶图案化至装置中^8,9，步骤如下：

1. 在未添加补充物的细胞培养基中配制10% w/v的PEGDA（3.4kDa，Laysan Bio；Arab，AL，USA）和10% w/v的PEG（8kDa，Sigma-Aldrich）溶液。
2. 将Irgacure 2959（Ciba Specialty Chemicals；Tarrytown，NY，USA）以100 mg/mL的浓度溶于1-乙烯基-2-吡咯烷酮中，配制光引发剂储备液。
3. 将上述两种溶液充分混合，得到含0.4% w/v光引发剂的混合溶液。使用0.45 μm针头滤器过滤该混合液，以实现灭菌并去除颗粒物。
4. 用胰蛋白酶消化细胞培养物，并在培养基中制备细胞悬液，其细胞浓度为所需终浓度的两倍。
5. 将细胞悬液与过滤后的水凝胶前体/光引发剂溶液按1:1体积比混合。
6. 使用长型25G针头将混合溶液注入微装置中，注意避免在装置内产生气泡。
7. 将打印好的透明掩膜与装置表面的对准标记对齐。设置紫外光照射系统，使装置表面的紫外光剂量达到17.5 mW/cm²。通过掩膜照射水凝胶195秒。该时间已针对本系统优化，实际应用中可能需要调整。
8. 用PBS洗去未聚合的水凝胶前体溶液，随后更换为细胞培养基。驱动加载柱以压缩水凝胶结构。

有关该平台上的微装置操作及生物学实验的详细表征已在其他文献中发表¹⁰。

E. 外周设备

经过改造的培养皿用于在设备操作期间维持细胞培养物的无菌状态。将一根钝化并剥去涂层的18G针头用环氧树脂固定在培养皿侧壁钻出的孔中。导管（Clay Adams Intramedic PE190；VWR International，Arlington Heights，IL，USA）压接至这些连接器，并与受控的电磁阀和压力源相连。

装置的压力由外部微泵提供。对于二维实验，使用电压控制的偏心隔膜泵（SP 500 EC-LC 4.5VDC；Schwarzer Precision，德国）产生30–55 kPa的正压。通过基于脉宽调制的电压控制器调节施加的电压，以控制压力输出。使用电磁阀和管路分配器（S10MM-30-12-3 和 MSV10-1；Pneumadyne，美国明尼苏达州普利茅斯）产生周期性压力波形。电磁阀通过12 V信号驱动，由方波函数发生器控制。

F. 装置表征与使用

在设备上进行成像

在设备上对细胞或颗粒进行成像时，一个常见问题是由于支撑加样柱的PDMS膜下方液滴凝结，导致光学分辨率不佳。这种凝结现象通常由培养箱内温度和湿度差异，或在固定后及显微镜载物台上产生。为解决此问题：

1. 将一个敞口储液罐连接至压力进样口，并用去离子水充满。为方便操作，我们使用带鲁尔锁接头的敞口注射器作为储液罐。
2. 将装置和已充满液体的储液罐放入真空腔室，并抽真空。
3. 等待5分钟，然后将腔室恢复至大气压。重复此过程两到三次。随着装置微通道中的空气被排出，储液罐中的水会随之进入通道，从而消除液滴冷凝物，为显微镜观察提供清晰的光学通路。
4. 使用明场或荧光显微镜对培养区域进行成像。

对于活细胞成像，此步骤可在将细胞接种到装置之前完成。然而，通道必须设计得足够大，以防止装置上各单元之间因黏滞效应导致压力损失。

通过珠追踪进行菌株表征

关于二维培养系统：

1. 将 1 μm 直径的荧光微球（Bangs Laboratories；Fisher, IN）用甲醇稀释至所需浓度。从原始浓度（1% 固体含量的微球缓冲液）按 1:150 稀释适用于我们的实验需求。
2. 对器件表面进行等离子体处理，并滴加 5–10 μL 微球悬浮液。
3. 等待甲醇完全蒸发。若微球浓度过低，可重复此步骤。
4. 在静态和加载条件下成像细胞培养区域。
5. 随后可在 ImageJ（NIH）中使用开源的自动颗粒追踪算法来追踪微球的位移。
6. 位移的大小、方向和位置参数可进一步用于数学模型，以表征器件表面的应变场。

可采用类似方法在三维系统中表征菌株。将一定量的荧光微球混入水凝胶前体溶液中。以聚乙二醇（PEG）水凝胶系统为例，其孔径远小于直径为1 μm的微球。微球被包埋在水凝胶中后，可使用共聚焦显微镜对系统进行成像。随后可追踪微球的位移，并对其进行分析，拟合至形变模型。

G. 代表性结果

图5和图6展示了器件制备、表征与操作的代表性结果。

图1. 三明治模具的制备过程。（A）将一张透明胶片小心地覆盖在SU-8模具上的未固化PDMS表面。（B）将该三明治结构置于泡沫、玻璃和金属组成的叠层中，在烘箱中加压固化。（C）拆开叠层并剥离透明胶片，留下带有图案的PDMS层³。经英国物理学会许可转载。

图2. 垂直驱动微柱在（A）静止状态和（B）驱动状态下的示意图。（C）制造微柱阵列所需的多层加工工艺示意图³。经英国物理学会许可转载。

图3. 对微致动器阵列进行改造以开展在可变形二维基底上培养的细胞实验的流程⁷。经英国皇家化学学会许可转载，http://dx.doi.org/10.1039/B914460A。

图4. 改造微执行器阵列以开展在三维光图案化水凝胶结构中培养的细胞实验的流程¹⁰。经Elsevier许可转载。

图5. （A）二维力学刺激培养的示例装置。红色染料用于标记驱动压力输送通道，蓝色染料用于标记润滑通道。（B）应变表征实验的示例图像。红色斑点表示珠子未变形时的位置，绿色斑点表示变形后的位置⁷。经英国皇家化学学会许可转载 http://dx.doi.org/10.1039/B914460A。

图6. (A) 用于三维压缩实验的示例装置。绿色染料用于标记驱动压力通道。(B) 微柱阵列的俯视图，(C) 水凝胶结构被图案化于微柱顶部。(D, E) 水凝胶结构中荧光微珠在 (D) 静止状态和 (E) 55 kPa 驱动压力下的侧向重构图像，展示了在三维培养系统中进行应变表征的过程¹⁰。经Elsevier许可转载。

讨论

尽管概念上简单，但器件制备确实需要一定的实验技巧和实践经验。特别是在二维细胞培养的情况下，器件中多层结构的对准可能具有挑战性，尤其是在大面积阵列上。从实际操作角度看，当多层之间相邻特征的间距公差为50 μm时，我们能够可靠地实现100%的对准成功率。我们还成功实现了低至15 μm公差的对准，但所需对准时间显著增加，且成功率较低。将掩模对准以在阵列上光刻图案化生物材料同样具有挑战性，但与水凝胶柱相比，可以将定位柱设计得足够大，从而缓解这一限制。

其他挑战涉及本方案所述材料上的细胞培养。在二维拉伸系统中，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为培养膜会将生物学研究限制在短期实验范围内，因为刺激6小时后，细胞对基底的黏附会受到显著影响。这一问题可通过将基质蛋白共价结合到PDMS表面¹¹来解决，或通过用更具临床相关性的聚氨酯材料替代PDMS细胞培养基底，以改善细胞黏附性并提高生物学实验的灵活性¹²。在所述的三维系统中，水凝胶化学组成仅作为示例性说明。长期培养贴壁细胞需要使用其他天然或合成水凝胶，或在聚乙二醇（PEG）基质中引入黏附性配体（可通过标...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 PDMS 单体与交联剂试剂盒	Dow Corning
SU-8 母模
硅烷化试剂：(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷	United Chemical Technologies
泡沫垫			工艺用品商店，1–2 mm 厚
喷墨胶片	Grand Toy
有机玻璃板
C 型夹			五金商店
显微操作系统	Siskiyou, Inc.
定制真空支架
视觉系统，Navitar 12 倍变焦	Navitar
连接管	VWR international	Clay Adam Intramedic PE190
钝头 18G 针头	Small Parts (www.smallparts.com)
偏心隔膜微型泵	Schwarzer Precision	SP 500 EC-LC 4.5V 直流
电磁阀	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
电磁阀阀组	Pneumadyne	MSV10-1
函数发生器
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯	Sigma-Aldrich
聚乙二醇二丙烯酸酯 3.4 kDa	Laysan Bio Inc.
聚乙二醇 8 kDa	Sigma-Aldrich
光引发剂 Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals
1-乙烯基-2-吡咯烷酮	Sigma-Aldrich
标准细胞培养试剂