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无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

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DOI：

10.3791/2236

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2010年7月15日

 , 
1GIBCO, Life Technologies

本文内容

摘要

以下方案提供了将人诱导性多能干细胞（iPS细胞）适应于无饲养层培养的详细说明，使用完全 KnockOut 血清替代无饲养层培养基（KSR-FF）。细胞适应后，还提供了持续传代维持的操作指导。

摘要

2006年发现人类和小鼠成纤维细胞可被重编程生成诱导多能干细胞（iPS细胞）1-3，其特性与胚胎干细胞极为相似，这一发现为药物研发、细胞治疗和基础研究提供了宝贵的新型多能细胞来源。

多年来，GIBCO 培养基和试剂一直处于多能干细胞研究的前沿。添加 Knockout 血清替代物的 Knockout DMEM 是胚胎干细胞生长以及当前诱导多能干细胞（iPS 细胞）培养的首选培养基3-9。这一黄金标准培养基体系现在可通过添加 Knockout SR 生长因子混合物实现无饲养层培养。

传统的人类胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）培养方法需要使用小鼠或人类成纤维细胞饲养层，或饲养层条件培养基。这些培养方法耗时费力，难以扩大规模，且由于培养条件未明确定义，难以维持hiPS细胞的未分化状态。Invitrogen开发了Knockout SR生长因子混合物，可帮助您轻松将hiPS细胞培养转为无饲养层体系，同时继续使用Knockout SR培养基。

方案

注意：为保持无菌培养条件，本方案中的所有操作均需采用无菌实验室技术，并在超净工作台内进行。

开始之前，确保所有培养基已平衡至 37°C 并适当充气。

制备Geltrex包被的培养皿

注意：有关 CELLstart 包被培养皿的使用，请参见附录

  1. 在 2-8°C 条件下缓慢解冻一管 Geltrex（1 mL），并用 99 mL Knockout D-MEM/F-12 以 1:100 的比例稀释。轻轻混匀溶液。

    注意：某些 iPS 细胞系可能需要不同的 Geltrex 稀释比例以获得最佳生长效果。替代稀释比例请参见附录。
  2. 用 Geltrex 溶液覆盖每块培养皿的整个表面（35 mm 培养皿使用 1 mL，60 mm 培养皿使用 1.5 mL）。
  3. 用封口膜密封每块培养皿以防止干燥，并在 37°C 下孵育 1 小时。

    注意：此时可将包被了 Geltrex 的培养皿密封后于 4°C 保存，最长可达 1 个月。请用封口膜密封每块培养皿，以防止 Geltrex 干燥。
  4. 使用前，将 Geltrex 包被的培养皿转移至超净工作台，并使其平衡至室温（约 1 小时）。

配制完全 KnockOut SR 无饲养层培养基

  1. 为配制 1 mL 浓度为 10 μg/mL 的碱性成纤维细胞生长因子（Basic FGF）溶液，无菌操作混合以下所列组分。分装溶液后于 -20°C 保存，可稳定长达 6 个月。

    碱性成纤维细胞生长因子（Basic FGF）10 μg
    D-PBS990 μL
    10% BSA10 μL


    注：BSA 可以相同浓度的 HSA 或 Knockout SR 替代。
  2. 为配制 50 mL 浓度为 2 mg/mL 的 Dispase 溶液，无菌操作混合以下所列组分。过滤除菌后于 4°C 保存，可稳定长达 2 周。

    Dispase100 mg
    D-PBS50 mL
  3. 为无菌配制 100 mL 完全型 KnockOut SR 无饲养层（KSR-FF）培养基，请将下表所列组分无菌混合。

    组分储存浓度终浓度体积
    Knockout DMEM/F12（货号：12660-012）-1X76.8 mL
    GlutaMAX-I（货号：35050-061）200 mM2 mM1 mL
    KnockOut SR（货号：10828-028）-20%20 mL
    KnockOut SR-GFC（货号：A10580-01）50X1X2 mL
    bFGF（货号：PHG0024）10 μg/mL20 ng/mL200 μL
    KSR-FF 培养基可在 2–8°C 保存，最长可稳定 1 周。
  4. 在将完全培养基预平衡至所需温度和气体条件前，无菌加入适量 2-巯基乙醇（储存液浓度为 55 mM），使其终浓度为 0.1 mM。例如，配制 100 mL KSR-FF 培养基时，加入 182 μL 的 55 mM 2-巯基乙醇（1:550 稀释）。或者，也可在配制完成的 1X 培养基中加入 2-巯基乙醇，并于 2–8°C 保存，最长可稳定 1 周。

将iPSCs适应于KSR-FF培养基

  1. 开始前，将已包被Geltrex的培养皿置于生物安全柜中，平衡至室温。
  2. 在MEF饲养层细胞上培养iPSCs，直至细胞融合度达到70-80%。有关基于MEF的培养方案，请参阅GIBCO小鼠胚胎成纤维细胞手册。
  3. 将所需体积的Dispase置于37 °C水浴中预热。所需体积详见下表1。
  4. 将所需体积的KSR-FF在37°C水浴中预平衡15分钟。所需体积详见下表1。
  5. 吸除培养皿中的培养基，加入适量Dispase溶液。将培养皿在37°C孵育3-5分钟。
  6. 吸除各培养容器中的Dispase溶液，并用D-PBS轻轻冲洗去除MEF饲养层细胞（2至3次）。
  7. 向每个培养容器中加入适量完全KnockOut SR培养基。使用细胞刮或5 mL移液器轻轻刮下细胞。

    注：难适应的iPS细胞系的替代适应方案见附录。
  8. 将每个培养皿中的细胞悬液收集至独立的15 mL锥形管中。用适量完全KnockOut SR培养基冲洗每个培养容器，并将D-PBS冲洗液加入含有细胞悬液的15 mL锥形管中。注意避免将细胞团块分散为单细胞。
  9. 以200 x g离心5分钟，使iPSCs沉淀。
  10. 吸除iPSC沉淀的上清液。根据传代比例（见表1），用适量KSR-FF培养基重悬细胞沉淀。不要将细胞团块进一步打碎至更小尺寸，因为较小的团块难以有效贴附于培养表面。

    注：我们建议iPSCs从iPSC MEF培养基直接传代至KSR-FF培养基后的前3代采用1:2的传代比例。通常1:3至1:5的传代比例是合适的，但以1:2传代可确保无饲养层培养适应过程中所需的较高细胞密度。
  11. 在将iPSCs接种至Geltrex包被的培养皿前，吸除预包被培养皿中残留的Geltrex溶液，并缓慢向每个培养皿中加入适量细胞悬液。注：接种前切勿冲洗培养皿。
  12. 将培养皿前后左右轻轻晃动数次，使细胞均匀分布于培养皿表面。轻柔地将培养皿放入37°C、含4至6% CO2的湿化培养箱中。每天更换为新鲜KSR-FF培养基。

使用无饲养层KSR培养基传代人iPS细胞

  1. 在显微镜下观察在完全KSR-FF培养基中生长的人iPSCs，确认细胞融合度达到70-80%，已准备好进行传代培养。参见图1。

    注意：如果克隆过于密集或过大，将导致分化程度增加。
  2. 在传代培养前，切除并移除任何已分化的iPSC克隆。
  3. 将所需体积的Dispase置于37 °C水浴中预热。所需体积的详细信息请参见下表1。
  4. 将所需体积的KSR-FF置于37 °C水浴中预平衡15分钟。所需体积的详细信息请参见下表1。
  5. 使用移液器吸除培养容器中的废弃培养基，并用D-PBS冲洗细胞两次。
  6. 向培养容器中轻柔加入预热的Dispase溶液（例如，每60 mm培养皿加入1 mL Dispase溶液）。轻轻摇晃培养容器，使溶液均匀覆盖整个细胞表面。
  7. 将培养容器在37 °C条件下孵育3分钟。
  8. 从培养箱中取出容器，吸除Dispase溶液，并用D-PBS轻柔洗涤细胞。
  9. 使用细胞刮棒轻柔地将细胞从培养皿表面刮下，并将细胞转移至无菌的15 mL离心管中。
  10. 用KSR-FF冲洗培养皿两次，轻柔“冲下”未脱落的细胞。将冲洗液与离心管中的细胞混合。
  11. 在室温下以200 x g离心5分钟，使细胞沉淀。
  12. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并弃去上清。
  13. 轻弹离心管，使细胞沉淀完全从管底脱离。
  14. 使用5 mL血清移液管，将细胞轻柔重悬于预平衡的KSR-FF中。切勿吹打。注意：此步骤中必须轻柔重悬细胞，避免用力，以防细胞损伤。
  15. 按所需传代比例将细胞接种至新的Geltrex包被的60 mm培养皿中，并前后左右轻轻晃动培养皿数次，使细胞在表面均匀分布。
  16. 将培养皿置于37 °C、含4%至6% CO2的湿化培养箱中培养。
  17. 次日，轻柔更换废弃培养基为KSR-FF，以去除细胞碎片。此后每天更换一次废弃培养基。每日观察iPS细胞生长状态，并根据需要进行传代（约每4-5天一次）。当细胞融合度达到70-80%时建议传代。有关iPS细胞的冷冻保存与复苏，请参阅我们题为“使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基进行人iPS细胞的冷冻保存与复苏”的实验方案。

预期结果

显微镜下的细胞培养；细胞生长研究；显微成像；生物学研究。
图1. 下方的相差显微图像显示了在Geltrex包被的培养皿中使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基培养的iPSCs。这些iPSCs表现出与hESCs相似的形态特征，具有较大的细胞核和较少的细胞质。（40倍放大）

组分35 mm 培养皿60 mm 培养皿100 mm 培养皿
完全 KnockOut SR 培养基2 mL4 mL10 mL
Geltrex 溶液1 mL1.5 mL4–5 mL
Dispase0.5 mL1 mL3–4 mL
用于洗涤的 D-PBS2 mL4 mL10 mL

表1. 推荐体积

请点击此处查看附录。

披露

本文作者受雇于 Life Technologies，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
敲除型DMEM/F12货号 12660-012注：有关替代 DMEM 产品的使用，请参见附录
GlutaMAX-I货号 35050-061
KnockOut血清替代物KnockOut SR，货号 10828-028
KnockOut血清替代物生长因子混合液KnockOut SR-GFC，货号 A10580-01
FGF-basic，人重组蛋白，10 μgbFGF，货号 PHG0024注：替代的bFGF包装规格见附录。
2-巯基–乙醇货号 21985-023
Dispase货号 17105-041注：替代的传代方法见附录。
Geltrex hESC鉴定级低生长因子基底膜基质，1 mL货号 A10480-01
杜尔贝科’不含钙和镁的D-磷酸盐缓冲液（D-PBS） 货号 14190-144
无菌组织培养罩
37℃培养箱°C
Pipette-Aid
37℃水浴°C
无菌刻度吸管（5 mL，10 mL）
离心
15 mL 离心管
60毫米组织培养处理培养皿

参考文献

  1. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
  5. Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
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  9. Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).

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