使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人iPS细胞

摘要

本方案详细描述了使用KnockOut SR冻存液对人iPS细胞进行低温冻存，并在完全KnockOut SR无饲养层（KSR-FF）培养基或含饲养层的KnockOut SR培养基中复苏这些细胞的实验步骤。

摘要

2006年发现人类和小鼠成纤维细胞可被重编程以生成诱导多能干细胞（iPS细胞）^1-3，其特性与胚胎干细胞极为相似，这一发现为药物研发、细胞治疗和基础研究提供了宝贵的新型多能细胞来源。

多年来，GIBCO 培养基和试剂一直处于多能干细胞研究的前沿。添加 Knockout 血清替代物的 Knockout DMEM 是胚胎干细胞生长以及当前诱导多能干细胞（iPS 细胞）培养的首选培养基^3-9。通过添加 Knockout SR 生长因子混合物，这一黄金标准培养基系统现在可用于无饲养层培养。

传统的人类胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）培养方法需要使用小鼠或人类成纤维细胞饲养层，或饲养层条件培养基。这些培养方法耗时耗力，难以扩大规模，且由于培养条件未明确定义，难以维持hiPS细胞的未分化状态。Invitrogen开发了Knockout SR生长因子混合物，可帮助您轻松将hiPS和hES细胞培养转为无饲养层体系，同时继续使用Knockout SR培养基。

方案

注意：为保持无菌培养条件，本方案中的所有操作均需采用无菌实验室技术，并在超净工作台内进行。

开始之前，确保所有培养基已平衡至37°C并适当充气。

制备Geltrex包被的培养皿

注意：有关 CELLstart 包被培养皿的使用，请参见附录。

1. 在 2-8°C 条件下缓慢解冻一管 Geltrex（1 mL），并用 99 mL Knockout D-MEM/F-12 以 1:100 的比例稀释。轻轻混匀溶液。
   
   注意：某些 iPS 细胞系可能需要不同的 Geltrex 稀释比例以获得最佳生长效果。替代稀释比例请参见附录。
2. 用 Geltrex 溶液覆盖每块培养皿的整个表面（35 mm 培养皿使用 1 mL，60 mm 培养皿使用 1.5 mL）。
3. 用封口膜密封每块培养皿以防止干燥，并在 37°C 下孵育 1 小时。
   
   注意：此时可将 Geltrex 包被的培养皿密封后于 4°C 保存最多 1 个月。请用封口膜密封每块培养皿，以防止 Geltrex 干燥。
4. 使用前，将 Geltrex 包被的培养皿转移至超净工作台，并使其平衡至室温（约 1 小时）。

配制完全 KnockOut SR 无饲养层培养基

1. 配制1 mL浓度为10 μg/mL的碱性成纤维细胞生长因子（Basic FGF）溶液时，无菌混合下表所列组分。分装溶液，于-20°C保存，可稳定长达6个月。
   

   碱性成纤维细胞生长因子	10 μg
   D-PBS	990μL
   10% BSA	10 μL

   
   注意：BSA 可以在相同浓度下用 HSA 或 Knockout SR 替代。
2. 配制50 mL浓度为2 mg/mL的Dispase溶液，无菌混合下表所列组分。过滤除菌后，4°C保存，可使用长达2周。

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 mL

3. 无菌条件下，将下表所列组分混合，制备 100 mL 完全型无饲养层KnockOut SR（KSR-FF）。
   

   组分	储存浓度	终浓度	体积
   Knockout DMEM/F12（货号：12660-012）	-	1X	76.8 mL
   GlutaMAX™-I（货号：35050-061）	200 mM	2 mM	1 mL
   KnockOut SR（货号：10828-028）	-	20%	20 mL
   KnockOut SR-GFC（货号：A10580-01）	50X	1X	2 mL
   bFGF（货号：PHG0024）	10 μg/mL	20 ng/mL	200 μL

   
   KSR-FF 培养基可在 2–8°C 下保存最多一周。
4. 在将完全培养基预平衡至相应温度和气体环境之前，无菌地 加入所需体积的2-巯基乙醇 （55 mM 储存浓度）以达到 0.1 mM 的终浓度。例如，配制 100 mL KSR-FF 培养基时，加入 182 μL 的 55 mM 2-巯基乙醇（1:550 稀释）。或者，可将 2-巯基乙醇直接加入已配制好的 1× 完全培养基中，于 2–8°C 保存，最多可稳定一周。

配制冷冻/冻存培养基

冷冻保存培养基由两种培养基组成：冷冻培养基A和冷冻培养基B。它们需在不同时间加入细胞，且必须保持分离。每种培养基各占所需冷冻保存培养基总体积的50%。每个待冻存的冻存管需要1 mL的冷冻保存培养基总体积。一个汇合度为90%的60 mm培养皿的hESC可用于在冷冻保存培养基中建立2个冻存管的细胞库。

配制足量的每种冷冻培养基，额外多准备2-5 mL，以确保有足够的余量。

冻存液 A（终体积的 50%）：	50% DMEM/F12	50% KSR
冻存液 B（终体积的 50%）：	80% DMEM/F12	20% DMSO

示例：

如果要冻存20管细胞，您将需要20 mL冻存液。额外加入4 mL作为损耗补偿，总共需要24 mL冻存液。这意味着您需要12 mL冻存液A（24 mL的50%）和12 mL冻存液B（24 mL的50%）。

冻存液 A (12 mL)：	6 mL DMEM/F12	6 mL KSR
冻存液 B (12 mL)：	9.6 mL DMEM/F12	2.4 mL DMSO

冷冻保存液的最终成分为65% DMEM/F12、25% KSR和10% DMSO。

iPSC 的冷冻保存

1. 将所需体积的 Dispase 置于 37 °C 水浴中预热。所需体积的详细信息请参见下表 1。
2. 将所需体积的 KSR-FF 置于 37 °C 水浴中预平衡 15 分钟。所需体积的详细信息请参见下表 1。
3. 使用移液器吸除培养容器中的废弃培养基，并用 D-PBS 清洗细胞两次。
4. 向培养容器中轻柔加入预热的 Dispase 溶液（例如，每 60 mm 培养皿加入 1 mL Dispase 溶液）。轻轻摇晃培养容器，使溶液覆盖整个细胞表面。
5. 将培养容器在 37 °C 条件下孵育 3 分钟。
6. 从培养箱中取出容器，吸除 Dispase 溶液，并用 D-PBS 轻柔清洗细胞。
7. 使用细胞刮棒轻柔地将细胞从培养皿表面刮下，并将细胞转移至无菌的 15 mL 离心管中。
8. 用 KSR-FF 对培养皿清洗两次，轻柔“冲下”未脱落的细胞。将清洗液与离心管中的细胞合并。
9. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
10. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并弃去上清。
11. 准备足量的冻存管。一旦细胞与 DMSO 接触，应在 2–3 分钟内完成分装和冷冻。
12. 轻弹离心管，使细胞沉淀完全脱离管底，并用 Freezing Medium A 重悬细胞［使用 5 mL 血清移液器轻柔吹打混匀］。待细胞团块均匀悬浮后，逐滴加入等体积的 Freezing Medium B，同时轻柔摇晃细胞悬液以混匀。
    
    注意：此时细胞已接触 DMSO，操作必须迅速高效。一旦细胞与 DMSO 接触，应在 2–3 分钟内完成分装和冷冻。
13. 将 1 mL 细胞悬液分装至每个冻存管中。
14. 迅速将冻存管放入 Mr. Frosty 冻存盒［以实现快速冷冻］，并转移至 -80 °C 过夜。
15. 在 -80 °C 过夜保存后，将细胞转移至液氮罐中进行长期保存。

iPSC 冻存管解冻与细胞复苏

注意：KSR-FF 可替换为含 KSR 的 MEF 条件培养基，或用于饲养层的含 KSR 培养基。有关培养基制备说明，请参见附录。

在50 mL离心管中预热10 mL KSR-FF培养基。

1. 将适量的Geltrex包被培养皿平衡至室温，并在接种细胞前吸除培养皿中的任何液体。
2. 小心地从液氮储存罐中取出人胚胎干细胞（或诱导多能干细胞）冻存管。
3. 在37°C水浴中快速融化冻存管中的细胞，直至管内仅剩少量冰晶。
4. 用70%异丙醇喷洒冻存管表面以消毒，并将其转移至无菌细胞培养超净台中。
5. 使用5 mL移液器，在无菌条件下将冻存管内的全部内容物转移至15 mL锥形离心管中。
6. 用1 mL KSR-FF冲洗冻存管，并将冲洗液加入15 mL离心管中。
7. 缓慢地以逐滴方式向15 mL锥形离心管中的细胞悬液加入4 mL KSR-FF。在添加培养基的同时，轻轻前后晃动离心管以混匀细胞。（此举可减少细胞的渗透压冲击。）
8. 将含有细胞悬液的15 mL离心管在室温下以1000 rpm（200 × g）离心2分钟。
9. 小心吸除上清液并弃去，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
10. 使用5 mL移液器将细胞沉淀重悬于预热的KSR-FF培养基中（例如，每60 mm培养皿使用4 mL），并轻轻吹打细胞，直至细胞沉淀完全分散。预期细胞活力应高于70%；然而，若细胞活力低于70%，则细胞达到汇合所需时间可能更长。
11. 使用同一支移液器，将细胞悬液逐滴加入已平衡至室温的Geltrex包被培养皿中。
12. 将培养皿置于37°C、含4%至6% CO₂的湿化培养箱中。轻轻以南北、东西方向摇晃培养容器，使细胞均匀分布。
13. 复苏后24小时进行轻柔换液，之后每日换液一次，以清除细胞碎片并提供新鲜营养，直至培养皿中细胞汇合度达到约70–80%。如需继续培养和传代您的iPS细胞，请参考我们题为“使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基进行人iPS细胞的无饲养层培养与传代”的实验方案。

预期结果

细胞在冷冻保存前应达到约70-80%的融合度。Dispase消化会导致菌落边缘卷曲和折叠。收集细胞后，将其以小细胞团的形式悬浮于冻存培养基中进行冷冻。待冻存管解冻后，细胞会以小细胞团的形式恢复并贴附于预先包被的培养皿上。细胞生长迅速，5-6天内即可达到完全融合状态。

表1 - 推荐体积

组分	35 mm 培养皿	60 mm 培养皿	100 mm 培养皿
完全 KnockOut SR 培养基	2 mL	4 mL	10 mL
Geltrex 溶液	1 mL	1.5 mL	4–5 mL
Dispase	0.5 mL	1 mL	3–4 mL
用于洗涤的 D-PBS	2 mL	4 mL	10 mL

请点击此处查看附录。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
敲除DMEM/F12		12660-012	注：有关替代 DMEM 产品 GlutaMAX-I（货号 35050-061）的使用，请参见附录
KnockOut血清替代物		10828-028
KnockOut血清替代物生长因子混合物		A10580-01
FGF-basic，人重组蛋白，10 μg		PHG0024	注：替代的bFGF包装规格参见附录。
2-巯基–乙醇		21985-023
Dispase		17105-041	注：替代的传代方法见附录
Geltrex hESC认证低生长因子基底膜基质，1 mL		A10480-01
杜尔贝科’不含钙和镁的D-磷酸盐缓冲液（D-PBS）		14190-144
DMSO，500 mL	JT Baker	JT9224-1
无菌组织培养罩
37℃培养箱°C
Pipette-Aid
37℃水浴°C
无菌刻度吸管（5 mL，10 mL）
离心
15 mL 离心管
60 mm 组织培养处理培养皿
液氮储存罐
异丙醇冻存容器
1.5 mL 冻存管