Cryopreserving和恢复人类iPS细胞血清替代馈线中使用完整的基因敲除

摘要

这一协议描述为cryopreserving淘汰赛SR冻存介质的人类iPS细胞，这些细胞恢复完整的基因敲除SR直属免费（KSR - FF）介质或进纸器为基础的基因敲除的SR介质的详细过程。

摘要

在2006年的发现，人类和小鼠成纤维细胞可以重新编程，以产生iPS细胞与胚胎干细胞非常相似^的特质1-3创造了一个有价值的新来源，为药物开发，细胞治疗和基础研究的多能干细胞。

GIBCO公司媒体和试剂已在多年的多能干细胞研究的前沿。淘汰赛的DMEM淘汰赛血清替代补充是胚胎干细胞的生长和现在的iPS细胞培养^3-9的首选媒体。这个黄金标准的媒体系统现在可以用于馈线自由的文化，除了与基因敲除的SR生长因子鸡尾酒。

传统的人类ES和iPS细胞培养的方法需要使用鼠标或人类成纤维细胞饲养层，或馈线条件培养基。这些文化的方法是劳动密集型，规模是难以维持臀部细胞的未分化由于未定义的条件。 Invitrogen公司开发了淘汰赛的SR生长因子鸡尾酒，让你轻松转换你的臀部和胚胎干细胞培养，馈线，同时仍保持了您的使用基因敲除的SR。

方案

注意:要保持无菌培养条件下，所有在本议定书的程序进行使用无菌实验室做法，并在层流罩下进行。

开始之前，确保任何媒体平衡至37 ° C和适当的毒气。

准备Geltrex涂层的培养皿

注意:使用CELLstart涂层的培养皿见附录。

1. 解冻之一Geltrex（1毫升）慢慢在2-8℃管和1:100，稀释在99毫升淘汰赛D-MEM/F-12。轻轻混合解决方案。
   
   注:有些iPS细胞系可能需要不同Geltrex的最佳生长的稀释。替代稀释见附录。
2. 每个培养皿的整个表面覆盖Geltrex溶液（1毫升为35毫米的菜，为60毫米的菜1.5毫升）。
3. 密封每盘用封口膜，以防止干燥和1小时的菜在37 ° C。
   
   注意:此时你可能会储存在4 ° C的Geltrex涂层的培养皿中，长达1个月。每个菜用封口膜密封，以防止干燥Geltrex。
4. 之前使用，转让Geltrex涂层菜的层流罩，并允许他们平衡至室温（约1小时）。

准备完整的基因敲除SR馈线中

1. 为了准备1毫升10微克/毫升的基本的FGF解决方案，在无菌条件下混合下面列出的组件。分装的解决方案，并在-20 ° C存储长达6个月。
   

   基本的FGF	10微克
   D - PBS	990μL
   10％的BSA	10微升

   
   注:可与牛血清白蛋白HSA或在相同浓度的基因敲除的SR取代。
2. 为了准备50毫升2毫克/毫升Dispase解决方案，在无菌条件下混合下面列出的组件。过滤消毒的解决方案，并储存在4 ° C至2周。

   Dispase	100毫克
   D - PBS	50毫升

3. 要准备100毫升的完整的​​基因敲除的SR馈线免费（KSR - FF），在无菌条件下表中列出的组件结合起来。
   

   组件	股权集中度	终浓度	卷
   淘汰赛的DMEM/F12（部件没有。12660-012）	-	1X	76.8毫升
   GlutaMAX - I（货号35050-061）	200毫米	2毫米	1毫升
   基因敲除SR（货号。10828-028）	-	20％	20毫升
   淘汰赛SR - GFC（部件没有。A10580 - 01）	50X	1X	2毫升
   碱性成纤维细胞生长因子（部件。PHG0024）。	10微克/毫升	20毫微克/毫升	200微升

   
   您可能会储存在2-8℃KSR - FF介质长达一个星期。
4. 就在预平衡温度和气体的完全培养基，在无菌条件下加入终浓度为0.1毫米2巯基乙醇所需的量（55毫米股票浓度） 。例如，要准备100毫升KSR - F的F培养基中添加182μL，2 - 巯基乙醇（1:550稀释），另外55毫米，2 - 巯基乙醇可添加到1X完成介质和存储长达一个星期在2-8 ° C。

准备冻结/冷冻保存介质

冻存介质包括两个媒体;冷冻介质，并冻结中等B.他们是在不同时期的细胞，并且必须保持分离。他们每个冻存中等总量的50％需要。需要中等的超低温冷冻保存的总体积为1毫升为每个被冻结的小瓶。 90％融合60毫米菜的胚胎干细胞可用于银行2瓶的人类胚胎干细胞冻存媒体。

一个额外的2 - 5ML准备足够的量，以确保每个冻存液盘盈。

冷冻介质中，终体积（50％）:	50％的DMEM/F12	50％KSR
冷冻培养基B（终体积的50％）:	80％的DMEM/F12	20％DMSO

例如:

如果你冻结了20瓶细胞，你会需要20ML超低温冷冻保存的介质。共24mL冷冻保存液中添加盘盈4ML。这意味着你将需要冻存液12mL（24mL的50％）和冷冻培养基B（50％），24mL 12mL。

冷冻介质中，（12毫升）:	6毫升的DMEM/F12	6毫升KSR
冷冻培养基B（12毫升）:	9.6毫升的DMEM/F12	2.4毫升二甲基亚砜

最终组成的超低温冷冻保存中等，65％的DMEM/F12，25％KSR，和10％DMSO。

Cryopreserving iPS细胞

1. 预温的Dispase所需的音量在37℃水浴。所需的卷的详细信息，请参阅下面的表1。
2. 在37℃水浴for15分钟中预平衡KSR - FF所需的量。所需的卷的详细信息，请参阅表1below。
3. 从文化的船只使用吸管吸用过的介质，并与D - PBS冲洗细胞两次。
4. 轻轻预热Dispase解决方案添加到培养容器（例如，1毫升每60毫米培养皿Dispase解决方案）。摇动培养容器的整个细胞表面涂层。
5. 3分钟，在37℃孵育培养容器。
6. 从孵化器中取出容器，吸Dispase解决方案，并轻轻的D - PBS洗涤细胞。
7. 轻轻刮去使用细胞刮刀的文化菜表面的细胞，细胞转移到无菌的15ml离心管。
8. KSR - FF冲洗培养皿两次，轻轻的"喷涂"不沾边的任何细胞。池冲洗15ML管细胞的媒介。
9. 在200 XG离心管在室温下5分钟沉淀细胞。
10. 小心吸出，而不会干扰细胞沉淀上清，将它丢弃。
11. 准备足够数量的离心管。一旦细胞在用DMSO接触，他们应该被分装，冷冻2-3分钟内。
12. 轻轻一抖管，完全逐出试管底部的细胞沉淀，轻轻吹打向上和向下，使用5毫升血清吸管]重新暂停在冻存液A.中的细胞。团块均匀的混悬液，同等体积的冷冻培养基B中添加它，在下拉明智的方式，同时轻轻摇动混合细胞悬液。
    
    注:在这一点上，细胞在用DMSO接触，和必须进行有效的工作。一旦细胞接触与二甲基亚砜，他们应该被分装，冷冻2-3分钟内。
13. 分装到每个离心管的细胞悬液1毫升。
14. 快速放置小瓶先生冷若冰霜，迅速冻结]，并将其转移至-80 ° C过夜。
15. 经过隔夜存放于-80 ° C，细胞转移到液氮罐长期贮存。

IPSC的小瓶的解冻和细胞恢复

注:KSR - FF可取代含KSR - MEF的条件培养基，或KSR与馈线的使用语言。为媒体准备的说明见附录。

KSR - FF培养基，在50毫升管预温10ML。

1. 室温平衡Geltrex涂层菜肴适当数量和吸电镀前你从菜品的任何液体R细胞。
2. 小心地取出胚胎干细胞（或IPSC）从液氮储存罐瓶。
3. 在37℃水浴快速解冻冷冻细胞小瓶，直到小瓶仍然只是一个小冷冻块。
4. 喷雾小瓶，用70％异丙醇净化它，并将其转移到无菌组织培养罩。
5. 无菌操作转移到15 mL锥形管使用5毫升吸管的小瓶中的全部内容。
6. 冲洗用1毫升KSR - FF的小瓶和添加15 mL离心管。
7. 慢慢地，添加4毫升KSR - FF下拉明智的做法是在15毫升的锥形管的细胞。虽然加入培养基，轻轻地来回移动管混合的细胞。 （这减少了细胞的渗透压冲击）。
8. 离心15毫升细胞悬液，在1000RPM（200 × G）为2分钟，在室温下管。
9. 小心吸上清液丢弃，而不会干扰细胞沉淀。
10. 重悬细胞沉淀在预热KSR - FF（如4mL/60毫米菜）用5毫升吸管轻轻吸液管细胞的向上和向下，直至细胞沉淀完全散去。预计大于70％的可行性，但是如果生存能力是低于70％，它可能采取的细胞更长的时间才能达到汇合。
11. 使用相同的吸管，转移下拉明智的预平衡到室温Geltrex涂层的培养皿中的细胞悬液。
12. 放置在37℃孵化器的培养皿中，用4至6％，空气中的_CO 2饱和湿度。小心漩涡船只在北到南，东，西图案均匀地分布在细胞。
13. 轻轻流体改变培养皿中解冻后24小时，此后每天以去除细胞碎片，并提供新鲜的养分，直到大约70-80％的菜是融合。对于您的iPS细胞的持续培养和传代，请参阅我们的协议，名为"免费接驳文化和传代使用完整的基因敲除血清替代的人类iPS细胞直属免费中等"

预期结果

细胞应该是大约70-80％汇合前冷冻保存。 Dispase消化的结果，在卷曲和折叠沿菌落边缘的殖民地。收获后的细胞，它们是冷冻冷冻保存媒体的小团块。小瓶解冻后，细胞恢复，并附加小团块预涂菜。他们迅速成长，导致在5-6天的融合菜。

表1 - 推荐量

组件	35毫米菜	60毫米菜	100毫米菜
完整的基因敲除简中​​等	2毫升	4毫升	10毫升
Geltrex解决方案	1毫升	1.5毫升	4-5毫升
Dispase	0.5毫升	1毫升	3-4毫升
D - PBS漂洗	2毫升	4毫升	10毫升

请点击这里查看附录 。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
敲除 DMEM/F12		12660-012	注意：有关替代 DMEM 产品 GlutaMAX-I 的使用，请参见附录。No. 35050-061）
KnockOut 血清替代		10828-028
KnockOut 血清替代生长因子混合物		A10580-01
FGF-basic，人重组蛋白，10 &μ;g		PHG0024	注意：有关其他 bFGF 包装规格，请参见附录。
2-Mercapt–thanol		21985-023
分散酶		17105-041	注：参见附录了解替代传代方法
Geltrex 经 hESC 验证的低生长因子基底基质，1 mL		A10480-01
Dulbecco's 不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS）	14190-144
C
Pipette-Aid
水浴套装 37°C
无菌血清移液管（5 mL、10 mL）
离心
15 mL 离心管
60 mm 组织培养处理皿
液氮储存罐
异丙醇冷冻容器
1.5 mL 冻存管