本方案描述了一种非病毒性方法，用于将遗传载体递送至活体啮齿类动物大脑的特定区域。该方法包括质粒制备、微移液管制作、新生大鼠幼崽手术、载体的微量注射以及 体内 电穿孔
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
创建转基因动物是研究目的基因功能的常用方法 体内然而，在基因于整个生物体中表达或被敲除的情况下，许多基因敲除或转基因动物无法存活。此外，多种补偿机制常常使得实验结果难以解释。通过控制基因表达的时间或限制转染细胞的数量，可以减轻这些补偿效应。
产后非脑室微量注射结合体内电穿孔技术可将基因、siRNA 或染料分子直接靶向递送至新生啮齿类动物大脑的特定小区域。与传统的脑室注射技术相比，该方法能够转染非迁移性的细胞类型。通过本方法转染的动物可用于例如双光子体内成像，或急性脑切片的电生理实验。
方案
1. 引言
创建转基因动物是研究基因在活体动物中功能的强有力方法1 并揭示疾病机制2,3 以及用于调控细胞的特性4然而，该过程相当繁琐，极为耗时且成本高昂，因此有必要采用病毒注射等替代性基因递送方法5，新生小鼠心室注射联合电穿孔6 和 在子宫内 电穿孔7,8出生后非脑室注射与电穿孔方法具有一系列独特的优点：可使用非病毒性基因构建体；能够在目标区域实现局部表达模式； 原位 非迁移性细胞类型的转染，例如皮层星形胶质细胞。
在本视频中，我们演示了使用携带鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子驱动的增强型绿色荧光蛋白编码质粒（pCAG-EGFP）9，对新生大鼠脑进行出生后基因递送的详细操作流程。我们介绍了含质粒注射液的制备、细玻璃移液管的制作，以及在立体定位仪上组装微量注射装置的过程。随后，我们讲解了使用异氟烷对幼鼠进行麻醉、手术操作、注射过程，以及使用镊形电极和in vivo电穿孔仪进行体内电穿孔的方法。最后，我们简要讨论了实验中预期的结果、研究前景以及可能遇到的困难。
2. 电穿孔用质粒的制备
- 我们通常在200 μl薄壁管中制备10....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
将基因递送至活体啮齿类动物大脑的方法已较为成熟 在子宫内 电穿孔7,8,11,12 以及最近用于出生后电穿孔6然而，这些方法依赖于将质粒DNA注射到脑室内，这在某些应用中可能存在局限性。例如，这些方法无法靶向海马等特定脑区的细胞，也不能转染皮层星形胶质细胞等非迁移性细胞类型。非脑室注射联合电穿孔技术最初被用于向小脑神经元递送基因13我们的方案展示了非脑室注射法在大鼠脑其他区域的应用扩展。我们提出，本方法可作为向出生后大鼠脑特定目标区域递送基因的病毒方法的一种有效替代方案。5.
尽管本方法具有优势，但仍可能遇到一些困难，如下所述。
1. 动物的最佳年龄
在条件允许的情况下，应使用较年幼的新生大鼠幼崽，以提高转染效率和手术后的存活率。据我们经验，P0 天的幼崽体型过小，难以根据该年龄段可用脑图谱中的立体定位坐标，稳定地靶向大脑特定区域14。此外，P0.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 Ekaterina Karelina 协助完成视频音轨录制，Ivan Molotkov 提供 3D 动画，以及 Peter Blaesse 博士提供 CAG-EGFP 质粒制备。
本工作获得了芬兰国际流动中心、芬兰文化基金会以及芬兰科学院资助项目的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 2A-sa 型直头镊子，115毫米 | 设备 | XYtronic | XY-2A-SA | 使用前用70%乙醇处理以进行消毒 |
| 带有不锈钢加热垫的生物温度控制器 | 设备 | Supertech | TMP-5b | |
| 带灯丝的硼硅酸盐玻璃管 | 材料 | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | 玻璃针 |
| 一次性钻头 | 材料 | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| 杜尔贝科’10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS） | 试剂 | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 镊子，110 mm | 设备 | Fine Science Tools | 91150-20 | 手术操作前，使用70%乙醇进行消毒处理 |
| 伊灵微流控–电极拉制仪 | 设备 | 伊灵 | 50-2013 | 垂直电极玻璃拉制仪 |
| Ethilon 单丝聚酰胺 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | 材料 | 约翰逊 &安普和约翰逊 | EH7177H | 手术缝线 |
| Exmire 微量注射器 10.0 ml | 设备 | Exmire | MS*GLLX00 | 气密注射器 |
| 快绿 | 试剂 | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| 镊形电极 | 设备 | BEX | LF650P3 | 使用前用70%乙醇进行消毒处理 |
| Foredom 钻机控制器 | 设备 | Foredom | FM3545 | 外科钻头电源及控制系统。目前可用的类似产品为 Foredom 公司的微电机套件 K.1070 |
| Foredom 微型电机手柄 | 设备 | Foredom | MH-145 | 目前可获取的类似产品为微电机套件 K.1070（Foredom） |
| 小鼠气体麻醉平台 | 设备 | Stoelting 公司 | 50264 | 在立体定位仪上组装 |
| 异氟烷 | 试剂 | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| 微型敷料镊，105 mm | 设备 | Aesculap | BD302R | 手术操作前用70%乙醇进行消毒处理 |
| Microfil | 材料 | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | 微注射器填充毛细管 |
| 矿物油 | 试剂 | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil 注射器 10 微升 | 设备 | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | 汉密尔顿注射器 |
| 质粒 CAG-EGFP | 试剂 | 使用内毒素去除型质粒大提试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit，Qiagen）提取并纯化，溶于无核酸酶水中，浓度为1.5 mg/ml | ||
| 脉冲发生器 CUY21Vivo-SQ | 设备 | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller 电极凝胶 | 试剂 | Schiller AG | 2.158000 | 导电凝胶 |
| 小型动物立体定位仪 | 设备 | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–小鼠和新生大鼠适配器 | 设备 | Stoelting 公司 | 51625 | 在立体定位仪上组装。手术操作前，用70%乙醇处理耳杆以消毒。 |
| 学生用虹膜剪，直型，11.5 cm | 设备 | Fine Science Tools | 91460-11 | 手术操作前用70%乙醇进行消毒处理 |
| Sugi 吸收性棉签 17 x 8 mm | 材料 | Kettenbach | 31602 | 手术棉垫 |
| UMP3 微量注射泵和 Micro 4 微量注射泵控制器 | 设备 | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | 显微注射仪和控制器 |
| Univentor 400 麻醉机 | 设备 | Univentor | 8323001 |
参考文献
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
