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方法文章

通过非脑室途径质粒注射与电穿孔法向新生大鼠脑组织递送基因

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DOI：

10.3791/2244

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2010年9月17日

 ,  ,  , 
1Neuroscience Center, University of Helsinki, 2Faculty of Biological and Enviromental Sciences, University of Helsinki

本文内容

摘要

本方案描述了一种非病毒性方法，用于将遗传载体递送至活体啮齿类动物大脑的特定区域。该方法包括质粒制备、微移液管制作、新生大鼠幼崽手术、载体的微量注射以及 体内 电穿孔

摘要

创建转基因动物是研究目的基因功能的常用方法 体内然而，在基因于整个生物体中表达或被敲除的情况下，许多基因敲除或转基因动物无法存活。此外，多种补偿机制常常使得实验结果难以解释。通过控制基因表达的时间或限制转染细胞的数量，可以减轻这些补偿效应。

产后非脑室微量注射结合体内电穿孔技术可将基因、siRNA 或染料分子直接靶向递送至新生啮齿类动物大脑的特定小区域。与传统的脑室注射技术相比，该方法能够转染非迁移性的细胞类型。通过本方法转染的动物可用于例如双光子体内成像，或急性脑切片的电生理实验。

方案

1. 引言

创建转基因动物是研究基因在活体动物中功能的强有力方法1 并揭示疾病机制2,3 以及用于调控细胞的特性4然而，该过程相当繁琐，极为耗时且成本高昂，因此有必要采用病毒注射等替代性基因递送方法5，新生小鼠心室注射联合电穿孔6 和 在子宫内 电穿孔7,8出生后非脑室注射与电穿孔方法具有一系列独特的优点：可使用非病毒性基因构建体；能够在目标区域实现局部表达模式； 原位 非迁移性细胞类型的转染，例如皮层星形胶质细胞。

在本视频中，我们演示了使用携带鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子驱动的增强型绿色荧光蛋白编码质粒（pCAG-EGFP）9，对新生大鼠脑进行出生后基因递送的详细操作流程。我们介绍了含质粒注射液的制备、细玻璃移液管的制作，以及在立体定位仪上组装微量注射装置的过程。随后，我们讲解了使用异氟烷对幼鼠进行麻醉、手术操作、注射过程，以及使用镊形电极和in vivo电穿孔仪进行体内电穿孔的方法。最后，我们简要讨论了实验中预期的结果、研究前景以及可能遇到的困难。

2. 电穿孔用质粒的制备

  1. 我们通常在200 μl薄壁管中制备10 μl质粒注射溶液。该溶液足以用于多次实验。
  2. 将8 μl质粒溶液（参见材料与设备）与1 μl 10× PBS（参见材料与设备）以及1 μl 0.1% 快绿水溶液（参见材料与设备）混合。
  3. 注射溶液中质粒的终浓度应在1至3 μg/μl之间。质粒DNA浓度过低会降低转染效率，而过高则会使溶液过于黏稠，难以通过玻璃毛细管的细尖端进行注射。

3. 玻璃针制备

  1. 在制备玻璃移液管时，我们使用带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（参见材料与设备）和垂直电极玻璃拉制仪（参见材料与设备），并采用最大拉力和加热参数进行操作。
  2. 随后，我们使用一张纸片折断移液管尖端，使其尖端直径达到 10–20 μm。
  3. 我们在显微镜物镜下检查尖端的直径和形状。

4. 显微注射仪组装

  1. 使用一根细的聚合物毛细管（参见材料与设备），将一个 10 μl Hamilton 注射器（参见材料与设备）的约三分之一体积填充矿物油（参见材料与设备）。避免产生气泡！
  2. 然后用矿物油填充玻璃移液管，并将其插入 Hamilton 注射器中。避免产生气泡！
  3. 将装有玻璃移液管的注射器固定在连接控制器的显微注射仪上（参见材料与设备）。
  4. 将显微注射装置固定在立体定位仪上（参见材料与设备），使我们能够安全地将玻璃移液管的尖端浸入含有质粒注射溶液的管中。
  5. 当尖端接触溶液表面时，再深入 1 或 2 mm，并通过显微注射控制器吸取约 1 μl 的注射混合液。

5. 动物麻醉

本文所述所有操作均按照赫尔辛基大学动物实验规定进行。

  1. 每次实验时，我们使用一个气密注射器（见材料与设备）吸取约 2 ml 的异氟烷（见材料与设备）。
  2. 然后将注射器固定在麻醉机（见材料与设备）上，该麻醉机连接气流源、动物箱以及固定在立体定位仪上的面罩。
  3. 在麻醉机上，我们将气流速度调节至约 250 ml/min，异氟烷浓度调节至 4 %。
  4. 将幼鼠放入动物箱中 2 至 5 分钟。
  5. 当幼鼠停止活动时，将其放置在连接于立体定位仪的加热垫上。
  6. 将幼鼠头部的前部放入麻醉面罩中。
  7. 幼鼠进入深度麻醉状态通常需要 5 至 10 分钟。
  8. 通过夹尾测试检查麻醉深度，并将异氟烷输入量降低至约 1.5 至 2.0 %。

6. 手术、显微注射与电穿孔

  1. 用70%乙醇处理幼鼠头部皮肤。
  2. 使用小剪刀（见材料与设备）和细镊子（见材料与设备），从幼鼠颈背部至前额切开皮肤。
  3. 将皮肤向两侧弯折，并将耳杆轻轻插入颅骨的耳道以固定头部和皮肤。
  4. 在双目显微镜下定位颅骨上的前囟点。
  5. 利用立体定位坐标确定目标区域。
  6. 将注射移液管置于该区域上方，并在颅骨表面滴加25–50 nl注射溶液以标记位置。
  7. 在显微镜下，使用高速外科钻（见材料与设备）在标记点处轻柔、小心地钻孔，直至钻孔区域出现液体。
  8. 将电穿孔镊电极（见材料与设备）固定在颅骨两侧，并使用导电胶（见材料与设备）以提高导电性。
  9. 用小棉签（见材料与设备）吸除钻孔中的液体，并根据注射位点的坐标将玻璃针插入孔中。
  10. 以5–20 nl/sec的速度注入25–100 nl注射溶液。
  11. 迅速撤出移液管并立即进行电穿孔。电穿孔参数为：施加5次矩形脉冲，每次持续50 ms，电压99 V，频率1 Hz。
  12. 移除电极和耳杆。
  13. 使用钝镊（见材料与设备）和尖镊配合外科缝线（见材料与设备）缝合切开的皮肤。
  14. 将幼鼠放入保温舱中15–30分钟，以促进其从麻醉中恢复。
  15. 然后将幼鼠放回母鼠笼中。

7. 代表性结果

在成功转染的细胞中，外源基因的表达将在电穿孔后约10小时出现，并可持续数周保持稳定。

我们将质粒显微注射至出生后第2天（P2）Wistar大鼠幼崽的深层皮质层或纹状体区域，并进行了 体内 电穿孔操作如上所述。脑切片（400 μm 在2至6天（P4-P8）期间，使用振动切片机在冰冷的切片液（HEPES缓冲的Earle平衡盐溶液）中切取脑片（厚度为...）10使用蔡司Axioplan 2 LSM5 Pascal共聚焦显微镜（Zeiss，德国）在室温下的切片介质中进行图像采集。

深层皮质层和纹状体的注射部位包含大量转染细胞，这些细胞表达EGFP，位于直径约200-300 μm的紧凑区域内（图1A、B）。在转染细胞中，EGFP表达水平足够高，可对细小的细胞突起进行成像（图1C），包括具有不同形态棘突的树突（图1D）以及轴突束（图1E）。由于EGFP的强稳定性以及电穿孔后细胞仍保持良好的活性，因此能够追踪轴突的远端部分（距离胞体最远达1.5-2 mm），例如皮质终末（图1F）。

神经元成像；荧光显微镜、神经元结构、荧光分布、显微镜结果。
图 1. （A）P4 大鼠脑纹状体区域成功转染的细胞，显示质粒注射位点。（B）P5 大鼠脑深层皮质层（皮质表面下约 1000 μm）中转染的细胞。（C）P8 大鼠脑纹状体区域的一个转染细胞。（D）P8 大鼠脑纹状体区域转染细胞的树突突起；箭头指示不同类型的树突棘和丝状伪足。（E）转染细胞在侧支通路中的轴突。（F）转染细胞的轴突终止于 P8 大鼠皮质的软脑膜表面（箭头）。标尺：A、B、E 和 F 为 100 μm；C 和 D 为 10 μm。

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讨论

将基因递送至活体啮齿类动物大脑的方法已较为成熟 在子宫内 电穿孔7,8,11,12 以及最近用于出生后电穿孔6然而，这些方法依赖于将质粒DNA注射到脑室内，这在某些应用中可能存在局限性。例如，这些方法无法靶向海马等特定脑区的细胞，也不能转染皮层星形胶质细胞等非迁移性细胞类型。非脑室注射联合电穿孔技术最初被用于向小脑神经元递送基因13我们的方案展示了非脑室注射法在大鼠脑其他区域的应用扩展。我们提出，本方法可作为向出生后大鼠脑特定目标区域递送基因的病毒方法的一种有效替代方案。5.

尽管本方法具有优势，但仍可能遇到一些困难，如下所述。

1. 动物的最佳年龄

在条件允许的情况下，应使用较年幼的新生大鼠幼崽，以提高转染效率和手术后的存活率。据我们经验，P0 天的幼崽体型过小，难以根据该年龄段可用脑图谱中的立体定位坐标，稳定地靶向大脑特定区域14。此外，P0...

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致谢

感谢 Ekaterina Karelina 协助完成视频音轨录制，Ivan Molotkov 提供 3D 动画，以及 Peter Blaesse 博士提供 CAG-EGFP 质粒制备。

本工作获得了芬兰国际流动中心、芬兰文化基金会以及芬兰科学院资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2A-sa 型直头镊子，115毫米设备XYtronicXY-2A-SA使用前用70%乙醇处理以进行消毒
带有不锈钢加热垫的生物温度控制器设备SupertechTMP-5b
带灯丝的硼硅酸盐玻璃管材料Sutter Instrument Co.BF120-69-10玻璃针
一次性钻头材料MeisingerHP 310 104 001 001 008
杜尔贝科’10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）试剂Sigma-AldrichD1408
Dumont #5 镊子，110 mm设备Fine Science Tools91150-20手术操作前，使用70%乙醇进行消毒处理
伊灵微流控–电极拉制仪设备伊灵50-2013垂直电极玻璃拉制仪
Ethilon 单丝聚酰胺 6-0 FS-3 16 mm 3/8c材料约翰逊 &安普和约翰逊EH7177H手术缝线
Exmire 微量注射器 10.0 ml设备ExmireMS*GLLX00气密注射器
快绿试剂Sigma-AldrichF7252
镊形电极设备BEXLF650P3使用前用70%乙醇进行消毒处理
Foredom 钻机控制器设备ForedomFM3545外科钻头电源及控制系统。目前可用的类似产品为 Foredom 公司的微电机套件 K.1070
Foredom 微型电机手柄设备ForedomMH-145目前可获取的类似产品为微电机套件 K.1070（Foredom）
小鼠气体麻醉平台设备Stoelting 公司50264在立体定位仪上组装
异氟烷试剂Baxter Internationl Inc.FDG9623
微型敷料镊，105 mm设备AesculapBD302R手术操作前用70%乙醇进行消毒处理
Microfil材料World Precision Instruments, Inc.MF34G-5微注射器填充毛细管
矿物油试剂Sigma-AldrichM8410
NanoFil 注射器 10 微升设备World Precision Instruments, Inc.NANOFIL汉密尔顿注射器
质粒 CAG-EGFP试剂使用内毒素去除型质粒大提试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit，Qiagen）提取并纯化，溶于无核酸酶水中，浓度为1.5 mg/ml
脉冲发生器 CUY21Vivo-SQ设备BEXCUY21Vivo-SQ
Schiller 电极凝胶试剂Schiller AG2.158000导电凝胶
小型动物立体定位仪设备David Kopf Instruments900
St–小鼠和新生大鼠适配器设备Stoelting 公司51625在立体定位仪上组装。手术操作前，用70%乙醇处理耳杆以消毒。
学生用虹膜剪，直型，11.5 cm设备Fine Science Tools91460-11手术操作前用70%乙醇进行消毒处理
Sugi 吸收性棉签 17 x 8 mm材料Kettenbach31602手术棉垫
UMP3 微量注射泵和 Micro 4 微量注射泵控制器设备World Precision Instruments, Inc.UMP3-1显微注射仪和控制器
Univentor 400 麻醉机设备Univentor8323001

参考文献

  1. Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
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  5. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
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  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 6th edition, Academic Press. (2007).

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