在体内 G蛋白偶联受体相互作用光谱分辨的双光子显微镜定量

摘要

通过采用一个光谱分辨的双光子显微成像系统，像素级别的地图福斯特共振能量转移（FRET）效率得到表达假设形成同源寡聚体复合物的膜受体细胞。从FRET的效率图，我们正在研究能够估计约低聚物复杂的化学计量信息。

摘要

在活细胞内蛋白质相互作用的研究是一个重要的研究领域，因为这些信息积累了双方利益的工业应用，以及增加基本的生物知识。福斯特（荧光）共振能量转移（FRET）技术已被捐助者之间的电子激发态的分子和附近的受体分子经常利用在活细胞内蛋白质相互作用的研究。感兴趣的蛋白质，是两个不同类型的荧光探针标记，并在生物细胞中表达。然后兴奋的荧光探针，通常用激光，和排放所产生的荧光探针的荧光光谱特性被收集和分析。有关蛋白质相互作用的程度信息嵌入在光谱的排放数据。通常情况下，细胞必须被扫描的次数，以积累足够的光谱信息准确量化地区的每一个细胞内的利益的蛋白质相互作用的程度。然而，这些地区的分子组成，在收购过程中可能会发生变化，限制了明显的FRET效率的定量值平均在整个细胞空间的决心。通过一个光谱分辨的双光子显微镜，我们能够获得利益的样本只有一个完整的激励扫描后的光谱解析影像的全套。从这个像素级的光谱数据，一个地图FRET整个细胞的效率计算。通过运用一个简单的理论低聚复合物的FRET实验获得的分配的FRET效率在整个细胞，单次扫描光谱解决，揭示正在研究有关的计量和结构低聚物复杂的信息。在这里，我们描述生物细胞 （酿酒酵母）表达两个不同类型的荧光探针标记的膜受体（无菌2α-因子受体）的准备过程。此外，我们说明了使用荧光光谱解决双光子显微成像系统数据收集所涉及的关键因素。使用此协议的可扩展研究可以在与它连接到一个荧光标记的活细胞中表达的任何类型的蛋白质。

方案

1。质粒设计

感兴趣的蛋白质融合两种不同的荧光标记，如下所述。荧光标记不仅提供有关细胞内的蛋白质的位置，而且还^蛋白 1的同源齐聚定量信息的信息。荧光共振能量转移^{（FRET）2-4}技术是用来积累有关的蛋白质相互作用^5-10的信息。 FRET技术利用能量转移的原则，可以从光激发态分子（通常称为捐助，D）会出现一个平淡的分子（通常称为受体，一个通过偶极-偶极相互作用^的 ）11，如果两个分子来在彼此接近。在设计编码的融合蛋白的质粒，应牢记两个关键特征，如下:

1. FRET技术研究的最重要的是选择一个对荧光标记的兼容。理想的情况下，荧光标记的组合必须满足两个条件:捐助标签的发射光谱，激发光谱和受体标记，和大量的激光脉冲频谱的中心波长和激发光谱之间分离的波长之间的一个明显的重叠承兑人（即Stokes位移大）。绿色荧光蛋白¹²的两个^变种中 ，有13个是特别适合于满足以下条件:作为^一个捐助者14和黄色荧光蛋白^（YFP）12或它的一个变种，叫^金星作为承兑人15的_绿色荧光蛋白2。西鲁林¹⁶也可以被用来作为捐助者，但与较为温和的结果。
2. 在定量的FRET成像，它是最好的，如果只有一个在分子复杂的捐助很高兴在一段时间（平均），没....

讨论

在此演示中，我们说明了如何确定的规模和在体内的蛋白质，低聚物复杂的结构信息。虽然所给出的数据是从一个特定的膜受体在酵母细胞中表达（即Ste2p），方法是包罗万象，它可应用于任何类型的蛋白质在任何类型的细胞，只规定表示，这些蛋白质与相应的荧光标记物标记。对本协议的未来修改将涉及加强文书，以达到更高的扫描速度，企图监视时间依赖性蛋白低聚物的规模和结构的变化。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白胨	Fisher Scientific	BP1420
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422
聚乙二醇 4000	Hampton Research	HR2-605
不含 (NH4)2SO4 和氨基酸的酵母氮源基础	Fisher Scientific	DF0335-15-9
酵母合成培养基缺失补充剂	Sigma-Aldrich	Y2001
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1
琼脂	Fisher Scientific	S70210
硫酸铵	Fisher Scientific	A702-500
氯化钾	Acros Organics	424090010
亮氨酸	Fisher Scientific	BP385
组氨酸	Fisher Scientific	BP382
平场消色差无限远校正 100 倍油浸物镜 NA=1.43	Nikon Instruments
光谱分辨双光子显微镜