体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

摘要

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。

摘要

在活细胞中研究蛋白质相互作用是重要的研究领域，因为积累的相关信息不仅有助于工业应用，还能增进基础生物学知识。 Förster（荧光）共振能量转移（FRET）是一种常用技术，用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，其原理是处于电子激发态的供体分子与邻近的受体分子之间发生能量转移。目标蛋白质被标记上两种不同类型的荧光探针，并在生物细胞中表达。随后通常使用激光激发这些荧光探针，并收集和分析由荧光探针发射出的荧光光谱特性。有关蛋白质相互作用程度的信息即包含在这些光谱发射数据中。通常需要对细胞进行多次扫描，以积累足够的光谱信息，从而准确定量细胞内各个感兴趣区域的蛋白质相互作用程度。然而，在数据采集过程中，这些区域的分子组成可能发生改变，导致定量得到的表观FRET效率的空间分辨结果只能代表整个细胞的平均值。借助光谱分辨的双光子显微镜，我们仅需对感兴趣样品完成一次完整的激发扫描，即可获得全套光谱分辨的图像。基于这种像素级的光谱数据，可计算出细胞内FRET效率的空间分布图。通过将寡聚复合物中FRET的简单理论应用于实验测得的细胞内FRET效率分布，单次光谱分辨扫描即可揭示所研究寡聚复合物的化学计量比和结构信息。本文描述了制备表达膜受体（ sterile 2 α-因子受体）的生物细胞（酵母 Saccharomyces cerevisiae）的步骤，这些受体被标记上两种不同类型的荧光探针。此外，我们还阐述了使用光谱分辨双光子显微成像系统采集荧光数据时涉及的关键因素。本实验方案可推广应用于研究任何可在活细胞中表达并带有荧光标记的蛋白质。

方案

1. 质粒设计

目的蛋白与两种不同荧光标记物之一进行融合，具体如下所述。荧光标记不仅可提供蛋白在细胞内定位的信息，还可提供有关蛋白同源寡聚化的定量信息¹。荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）^2-4技术被用于获取有关蛋白相互作用的信息^5-10。FRET 利用的原理是：当两个分子彼此靠近时，可通过偶极-偶极相互作用，使一个光学激发的分子（通常称为供体，D）将能量转移至一个未激发的分子（通常称为受体，A）¹¹。在设计编码融合蛋白的质粒时，应牢记以下两个关键特征。

1. 在FRET研究中，选择一对相容的荧光标签至关重要。理想情况下，荧光标签组合必须满足两个条件：供体标签的发射光谱与受体标签的激发光谱之间具有明显的波长重叠，以及激光脉冲光谱的中心波长与受体标签激发光谱之间具有较大的分离（即较大的斯托克斯位移）。绿色荧光蛋白的两种变体^{12, 13}特别适合满足这些条件：以GFP₂作为供体¹⁴，黄色荧光蛋白（YFP）¹²或其一种变体Venus¹⁵作为受体。Cerulean¹⁶也可用作供体，但效果相对稍弱。
2. 在定量FRET成像中，最好每次仅激发分子复合物中的一个供体（平均而言），以避免在含有多个供体和受体的复合物中，多个供体竞争向同一受体传递能量。这有助于简化理论模型和数据分析过程¹⁷。因此，信号水平通常较低。为补偿这一点，目标蛋白的表达水平应相对较高。可通过使用高拷贝质粒将蛋白基因导入细胞，以实现较高的表达水平。

2. 酵母转化

最大化表达目标蛋白构建物的细胞群体比例具有显著优势。为此，我们转化一种无法合成色氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae），使用两种不同的质粒，其中一种含有色氨酸筛选标记，另一种含有尿嘧啶筛选标记。这些质粒还包含指导细胞表达目标蛋白的基因，目标蛋白分别带有两种荧光探针之一的标签。转化后的细胞培养在缺乏色氨酸和尿嘧啶的固体培养基平板上。至少应转化三类细胞：表达带有两种荧光探针标签的目标蛋白的细胞、仅表达带有供体荧光探针标签蛋白的细胞，以及仅表达带有受体荧光探针标签蛋白的细胞。

1. 准备固体培养基平板（1.7 g/L 无氨基酸酵母氮源基础培养基，1.6 g/L 无尿嘧啶和色氨酸酵母合成缺陷型培养基，2% [w/v] 葡萄糖，2% [w/v] 琼脂），用于转化细胞的生长培养，至少在细胞转化前一日完成制备。若无污染，该固体培养基平板在制备后可保存使用长达两个月。
2. 对于每一对要转化的质粒，向锥形瓶中加入10 mL YPD培养基（10 g/L Bacto酵母提取物、20 g/L Bacto蛋白胨和2% [w/v]葡萄糖）。用待转化的营养缺陷型酵母菌株的单菌落接种YPD培养基。
3. 将含有酵母培养物的锥形瓶置于实验室摇床中，通过圆周振荡作用对样品进行处理，并在30°C下过夜培养。次日早晨，通过定期取出少量培养液并检测其光密度（OD），开始监测细胞培养物的生长情况。在进行转化时，细胞培养物的生长应处于对数中期，即OD值为0.5–1.0。
4. 将每对拟转化的质粒各取5 μL，分别加入无菌微量离心管中。
5. 对于每一对需要转化的质粒，向一个空的微量离心管中加入5 μL鲑鱼精子DNA（5 mg/mL）。将装有鲑鱼精子DNA的微量离心管下半部分浸入沸水中，持续5分钟。为防止微量离心管盖子在加热过程中弹开，仅将离心管的下半部分浸入水中。从沸水中取出后，将含有鲑鱼精子DNA的微量离心管置于冰上，至少冷却2分钟。
6. 向每个含有质粒的微量离心管中加入5 μL的鲑鱼精子DNA。
7. 测定酵母培养物的光密度（OD），以确认其已达到对数生长中期（即OD读数在0.5至1.0之间）。
8. 将酵母悬液在1000×g离心2分钟。
9. 倒掉上清液，用涡旋振荡器将酵母沉淀重悬于无菌去离子水中。
10. 再次以1000×g离心悬浮液2分钟。
11. 弃去上清液，将沉淀重悬于 T.E 缓冲液中的 0.1 M LiOAc 溶液中（含 1.02 g LiAc、10 mL pH 7.4 的 1 M Tris 和 10 mL pH 8.0 的 0.1 M EDTA）。T.E 缓冲液中 0.1 M LiOAc 溶液的体积应为原体积的 1/100^th YPD 培养基中原始酵母培养物体积的
12. 将100 μL细胞分装至含有质粒的各微量离心管中。轻轻弹击每根管子，以混匀细胞与质粒。
13. 加入 400 μL 44% [w/v] 聚乙二醇（PEG₄₀₀₀将溶液加入各微量离心管中。
14. 轻轻混匀 PEG₄₀₀₀ 用细胞和质粒混合。为避免细胞破裂，此时切勿使用涡旋振荡器。为轻柔混匀，用食指和拇指捏住微量离心管盖和管底，缓慢将管子倒置，再缓慢恢复至直立位置。将管子沿其圆柱轴旋转90°，再次缓慢倒置。重复此操作数次，使细胞沿微量离心管管壁的整个表面积滑动混合。
15. 将微量离心管置于30°培养箱中孵育45分钟。
16. 孵育45分钟后，将细胞从培养箱中取出，并重复步骤14中所述的轻柔混匀操作。
17. 将微量离心管放入42°水浴中孵育15分钟。再次注意，仅将微量离心管的下半部分浸入水中。
18. 42°C 培养后，向微量离心管中加入 1 mL 灭菌去离子水。
19. 将离心管放入台式微量离心机中离心5秒。使用微量移液器从离心管中移除上清液。
20. 向每个微量离心管中加入 100 μL 灭菌去离子水，并通过倒置混匀的方式将灭菌去离子水与细胞混匀。
21. 将单个微量离心管中的内容物加入到选择性培养基平板中，该培养基用于筛选加入该微量离心管的特定质粒。加入4–6颗无菌玻璃珠（直径1 mm）。轻轻摇动含有转化酵母细胞液滴和玻璃珠的平板，使细胞均匀分散在琼脂培养基表面。对每组转化细胞重复此操作。
22. 将培养皿置于30°C培养箱中培养3-5天。3-5天后，可在培养基表面观察到多个直径为1-3 mm的酵母菌落。此时，细胞已可进行光谱分辨双光子显微镜成像。

3. 校准光谱分辨的双光子显微镜

本研究中使用的光谱分辨双光子显微镜已在其他文献中详细描述^{18, 19}。简而言之，采用一台高功率固态连续波激光器泵浦一台锁模钛宝石激光器，后者产生波长范围约为750至830 nm的飞秒脉冲。激光束通过高数值孔径的显微镜物镜聚焦，在样品上形成一个衍射极限的焦点。由于双光子激发的概率较低，激发仅发生在光束的近焦区域。利用一对正交的计算机控制扫描镜，可在样品平面内沿两个不同方向（在整个实验方案中称为x和y方向）移动光束焦点。样品中被照射体素产生的反向传播荧光发射，在到达EM-CCD阵列的像素之前，经由发射光路中放置的透射光栅将其色散为不同的光谱组分。因此，位于光束焦点区域内的任何荧光分子/分子的完整光谱轮廓将沿CCD阵列的一个维度（y方向）获得。通过调节两个扫描镜中的一个，可使激光焦点在样品内沿垂直于y方向的一条直线进行扫描。在CCD相机快门保持开启的状态下完成单线扫描，即可在激光束一次扫过样品的过程中，收集沿整条扫描线分布的荧光分子的光谱轮廓。在细胞内不同y位置处累积多次此类线扫描，可获得样品中大量荧光复合物的光谱信息。由线扫描获取的图像经重建后，可得到样品在不同波长下的多个x-y荧光强度空间图^{18, 19}。为了准确重建图像并计算对应于x-y荧光强度空间图的实际波长，必须使用具有明确表征荧光发射光谱的样品对线扫描方案进行校准。

1. 光谱分辨双光子显微镜通过将激发光束的焦点在样品多个位置进行扫描，从而累积成像细胞中寡聚体复合物的光谱信息。
2. 一对正交扫描镜用于将激光束的焦点在样品上沿两个不同方向移动。扫描镜的运动由计算机控制，并与CCD相机荧光强度数据的采集同步进行。
3. 从线扫描数据中，可重建对应于特定波长光的荧光强度空间分布图。为准确重建 x-y 荧光强度空间图并计算对应于每幅图的实际波长，必须使用荧光素溶液校准线扫描程序。
4. 开始校准程序时，将激发光谱中心设在800 nm波长处，该波长为供体标记物GFP最大激发波长的2倍。₂将激光腔内的棱镜沿其光路移动，以调节群速度色散，从而居中激发光谱。该棱镜安装在由计算机控制的线性电动位移台上。
5. 使用与相机连接的计算机程序，向CCD芯片发送指令，将其温度降至可达到的最低温度，以减少暗噪声。
6. 将10 μL荧光素溶液用移液器滴加到显微镜载玻片上，盖上盖玻片，使样品在盖玻片与载玻片之间形成均匀的薄层。
7. 在盖玻片表面滴加一滴镜油
8. 现在将显微镜载玻片固定到 x-y-z 在翻译阶段，通过手动调节控制载物台在光轴方向移动的线性执行器，沿光轴方向移动载玻片/载物台。持续移动载玻片/载物台，直至显微镜物镜与浸油液滴接触。
9. 使用控制相机的计算机程序，切换到视频模式以实时采集数据，使照射到CCD阵列上的发射光实时显示在计算机屏幕上。缓慢调节控制平移台在光轴方向上的微米尺，将样品移至激光束的焦点位置。
10. 当荧光素样品处于焦平面时，其发射光将在CCD阵列上呈现为一条清晰的线。使用控制相机的计算机程序，将CCD阵列的像素强度读数下载至计算机。通过在Image J中打开已下载的强度值矩阵，并在荧光区域划一条线，测量CCD阵列上像素强度随位置的变化。使用Image J命令“分析→轮廓分析”（Analyze→Plot Profile）生成图表，以展示荧光素样品的发射光谱。
11. 调整控制激光焦点在镜面上移动的增量参数 y 方向，使得相邻的 y 样品中不同位置导致荧光光谱峰值在CCD阵列的光谱维度上恰好移动一个像素。通过下载两种不同条件下的荧光素光谱强度值图像来监测这一现象 y 在样品的不同位置，使用 Image J 打开强度图像，并利用 Image J 的游标在每条荧光光谱中找到峰值像素位置。
12. 保持CCD快门打开，将激光焦点在样品上进行扫描 x 方向。沿扫描线方向上每个体素发出的光应入射到CCD阵列上。
13. 存储由此线扫描获得的CCD阵列数据，然后清除CCD阵列的像素。
14. 移动激光焦点的位置 y 根据本节第11步确定的量进行方向调整。
15. 扫描激光束在 x 在样品上施加反向电压，再次打开CCD阵列的快门并存储数据。
16. 重复此行扫描程序，直至激光照射的物理区域比单个生物细胞的尺寸大约50%。
17. 特定线扫描图像的行号与波长之间的关系应用于图像重建，以获得多个 x-y 不同波长下的荧光强度空间分布图。为了获得 x-y 特定波长（λ）下的荧光发射图像_j），在第一条扫描线所获得的图像中找到与该波长对应的行号。随后，下一条扫描线图像的相邻行即对应于该特定波长的荧光发射图像的下一行。将所有对应于该波长的图像行堆叠起来，以获得 x-y 在该波长下获取样品的荧光强度空间分布图。对所有其他可获得的波长重复此操作。
18. 计算与每个相关的波长 x-y 荧光强度空间图，根据图像索引确定每个重建图像的背景校正后归一化荧光强度j）。相机在光谱维度上的像素位置与发射光子的波长之间呈近似线性关系；因此，重构后的 x-y 荧光强度空间分布图像及其对应的波长也呈线性关系，计算公式如下：
    其数值为 m 由以下表示：
    在上述形式体系中，符号 λ_j 表示波长 j^th 重建图像。λ 的值_最大 和 λ_½ 从荧光素样品的发射光谱中提取，分别对应于发光样品荧光强度达到最大值和半最大值时的波长。图像索引 j_最大值 和 j_½ 分别对应于具有最大荧光强度和最大荧光强度一半的重建图像。

4. 收集目标生物样本的数据

1. 为获取样品数据，首先从培养箱中取出含有转化酵母菌落的平板。应至少有三类表达不同荧光探针标记蛋白的转化细胞，其半高全宽（FWHM）如下：
   1. 同时表达带有两种类型荧光探针标记的目标蛋白的细胞
   2. 仅表达带有供体荧光探针标记蛋白的细胞，以及
   3. 仅表达带有受体荧光探针标记蛋白的细胞。
2. 向一个微量离心管中加入 100 μL 的 100 mM KCl 溶液。使用移液器吸头，从共表达供体和受体荧光探针标记蛋白的酵母平板上刮取 3–5 个菌落，并将这些细胞接种至 100 mM KCl 溶液中。
3. 取 10 μL 细胞悬液滴加到新的显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖液滴，并在盖玻片表面滴加一滴浸油。
4. 手动关闭激光光路中的快门，以阻止激光照射到显微镜物镜。
5. 将载玻片固定在 x-y-z 三维平移台上，并沿光轴方向移动载玻片/平移台，直至显微镜物镜与浸油液滴接触。
6. 由于发射光路中存在透射光栅，样品的宽场图像会严重模糊。因此，在透射光栅前的光路中插入一个半高全宽（FWHM）较小的带通滤光片。打开宽场照明光源，进入相机视频采集模式。在相机屏幕上观察细胞图像的同时，缓慢沿光轴方向移动平移台，直至细胞图像清晰对焦。
7. 沿 x 或 y 方向移动平移台，将单个细胞移至激光束焦点位置。
8. 关闭宽场照明光源。从发射光路中移除带通滤光片。
9. 短暂解除激光束遮挡（<1 秒），同时观察 CCD 阵列接收到的信号。若在激光照射细胞期间 CCD 阵列检测到荧光信号，则对该细胞执行完整的荧光数据采集扫描。必须使用与前述校准过程中确定的相同扫描参数，特别是扫描线数和 y 方向步长。
10. 对大量共表达供体和受体标签蛋白的细胞，重复上述细胞定位与荧光数据采集过程。
11. 在完成对共表达两种标签蛋白细胞的荧光图像采集后，对仅表达供体荧光探针标记蛋白的细胞和仅表达受体荧光探针标记蛋白的细胞，重复整个实验流程。
12. 按照第 3 节所述方法，重建所有扫描数据，获得每组数据对应的光谱分辨的 x-y 荧光强度空间图谱。

5. 图像分析

单次扫描荧光生物细胞所获得的 x-y 荧光强度空间图中，每个像素均包含对应激发体素内分子复合物的完整光谱轮廓。若目标蛋白之间存在相互作用，则该光谱轮廓将包含来自供体与受体荧光探针的信号混合成分。为了确定目标蛋白之间相互作用的性质，必须采集细胞内大量此类蛋白复合物的光谱轮廓，并计算每个像素的表观FRET效率（E_app），即通过FRET机制从供体荧光探针的激发态转移至受体荧光探针的部分所占的比例。

1. 针对第4节中描述的、仅表达带有供体荧光探针标记蛋白的细胞的每幅重建图像，计算经背景校正后的荧光强度，并将其归一化至最大值。由于每幅重建图像对应一个独立的波长（λ_j) 这组归一化的荧光强度值对应于供体探针测得的发射光谱， i^D (λ_j).
2. 对仅表达带有受体荧光标签蛋白的细胞重复步骤1，以获得受体探针的实测发射光谱， i^A (λ_j由于选择的受体探针在激光光源激发下几乎不会被直接激发，因此仅含受体的样品所产生的信号将较低，可能与细胞固有的自发荧光信号处于同一数量级。因此，以该方式测得的受体荧光光谱在进一步分析前可能需要进行校正，以消除自发荧光的贡献。
3. 使用步骤1和步骤2中获得的归一化光谱，根据以下关系式，对同时表达带有供体荧光探针标记蛋白和受体荧光探针标记蛋白的细胞的荧光发射光谱中的每个像素进行光谱解卷积 I(λ_j)= k^DAi^D (λ_j) + k^{阿尔茨海默病}i^A (λ_j）的位置 我(λ_j）代表所测每个像素点的荧光光谱。数值的 k^DA 和 k^{阿尔茨海默病} 分别与供体在受体存在下的荧光发射以及受体在供体存在下的荧光发射成正比 ⁵.
4. 使用以下公式计算每个像素处反映细胞内蛋白质相互作用的表观FRET效率： 。在此， Q^D 和 Q^A 分别为供体荧光探针和受体荧光探针的量子产率，且 w^D 和 w^A 分别为归一化后的供体和受体发射光谱的积分值^{19, 20}.
5. 最后，使用计算得到的值创建一个直方图 E_应用程序 对于每个像素，其中特定情况发生的次数 E_应用程序 该值出现的频率被绘制在对应的具体数值上 E_应用程序.

6. 直方图分析

为了从 E_app 直方图中提取定量信息，需根据以下公式，用多个高斯函数的和对每个直方图进行理论拟合：
，
其中 A_i 为振幅，σ_i 为标准偏差，E_0i 为第 i^th 个高斯函数对应的最概然 FRET 效率。不同的寡聚体大小和构型会导致不同数量（n）的 E_0i 值及其不同的相关性^{1, 17}。例如，对于呈菱形的四聚体，可预测出五个峰，其表达式如表 1 所列。

表1. 菱形四聚体中五个高斯峰中心值与预测的成对FRET效率之间的关系。

这意味着在数据拟合过程中，只需调整一个 E_0i 值——即对应于 E_p 的那个值，其余四个值则由 E_p 的值计算得出。

1. 假设一个寡聚体模型，并确定用于拟合 E_app 直方图所需的高斯函数数量¹。通过调整 E_p、A_i 和 σ_i 来拟合直方图。注意，直方图的相对位置由模型固定。最小化拟合的卡方值或其他拟合优度函数。
2. 假设另一个可能的寡聚体模型，并重复步骤 1。
3. 选择在所用参数数量下与数据拟合最佳的模型。这可能需要使用统计检验方法（例如每个自由度的卡方值）。

代表性结果

图1展示了对表达不育2 α因子（Ste2p）的酵母细胞进行光谱分辨双光子显微测量后，计算得到的 k^DA、k^AD 和 E_app 空间分布图^{21, 22}。

图1. 表达不育2 α因子受体的酵母细胞。 通过对表达不育2 α因子受体（Ste2p）的酵母细胞进行光谱分辨双光子显微镜成像，并对每个像素位置应用光谱解卷积处理，获得供体（k^DA）和受体（k^AD）信号的二维图谱。荧光强度根据其数值被赋予伪彩色，比例尺以插图形式显示。通过k^DA和k^AD图像计算出表观FRET效率的二维图谱。

使用从图1所示细胞的E_app图谱中提取的数值绘制了直方图。图2显示了对应于图1细胞所测得的E_app值（圆圈）的拟合直方图。红色实线表示利用各个高斯函数之和（绿色实线）对实测数据进行的最佳拟合。

图 2. 表达 Sterile 2 α-因子受体的酵母细胞的 E_app 值直方图。 图中显示了对应于图 1 所示细胞测得的 E_app 值（圆圈）的直方图。通过叠加各个高斯函数（实心绿色线）来模拟（实心红色线）测得的值。高斯函数参数为：E₀₁=16.7；A₁=118.9；σ₁=3.2；E₀₂=25.1；A₂=100.0；σ₂=4.6；E₀₃=32.6；A₃=202.6；σ₃=4.6；E₀₄=40.1；A₄=92.6；σ₄=3.7；E₀₅=50.1；A₅=16.0；σ₅=7.9。

图2直方图中数据拟合所需的高斯均值之间的关系见表1。高斯函数的数量及其相关性对应于预期数量及相关性之间的关系 E_应用程序 菱形四聚体寡聚复合物的数值。因此，从光谱分辨的双光子测量结果可以明显看出，Ste2p 寡聚复合物呈现为菱形四聚体结构 体内¹⁹.

讨论

在本演示中，我们展示了如何在活体条件下测定蛋白质寡聚体复合物的大小和结构信息。in vivo。尽管所展示的数据来源于在酵母细胞中表达的特定膜受体（即 Ste2p），但该方法具有广泛的适用性，可应用于在任何类型细胞中表达的任何蛋白质，唯一前提是这些蛋白质需标记有适当的荧光标记物。未来对该实验方案的改进将包括提升仪器性能，以实现更高的扫描速度，从而尝试监测蛋白质寡聚体大小和结构随时间变化的动力学过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白胨	Fisher Scientific	BP1420
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422
聚乙二醇 4000	Hampton Research	HR2-605
不含 (NH4)2SO4 和氨基酸的酵母氮源基础	Fisher Scientific	DF0335-15-9
酵母合成培养基缺失补充剂	Sigma-Aldrich	Y2001
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1
琼脂	Fisher Scientific	S70210
硫酸铵	Fisher Scientific	A702-500
氯化钾	Acros Organics	424090010
亮氨酸	Fisher Scientific	BP385
组氨酸	Fisher Scientific	BP382
平场消色差无限远校正 100 倍油浸物镜 NA=1.43	Nikon Instruments
光谱分辨双光子显微镜