通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。
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摘要
摘要
在活细胞中研究蛋白质相互作用是重要的研究领域，因为积累的相关信息不仅有助于工业应用，还能增进基础生物学知识。 Förster（荧光）共振能量转移（FRET）是一种常用技术，用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，其原理是处于电子激发态的供体分子与邻近的受体分子之间发生能量转移。目标蛋白质被标记上两种不同类型的荧光探针，并在生物细胞中表达。随后通常使用激光激发这些荧光探针，并收集和分析由荧光探针发射出的荧光光谱特性。有关蛋白质相互作用程度的信息即包含在这些光谱发射数据中。通常需要对细胞进行多次扫描，以积累足够的光谱信息，从而准确定量细胞内各个感兴趣区域的蛋白质相互作用程度。然而，在数据采集过程中，这些区域的分子组成可能发生改变，导致定量得到的表观FRET效率的空间分辨结果只能代表整个细胞的平均值。借助光谱分辨的双光子显微镜，我们仅需对感兴趣样品完成一次完整的激发扫描，即可获得全套光谱分辨的图像。基于这种像素级的光谱数据，可计算出细胞内FRET效率的空间分布图。通过将寡聚复合物中FRET的简单理论应用于实验测得的细胞内FRET效率分布，单次光谱分辨扫描即可揭示所研究寡聚复合物的化学计量比和结构信息。本文描述了制备表达膜受体（ sterile 2 α-因子受体）的生物细胞（酵母 Saccharomyces cerevisiae）的步骤，这些受体被标记上两种不同类型的荧光探针。此外，我们还阐述了使用光谱分辨双光子显微成像系统采集荧光数据时涉及的关键因素。本实验方案可推广应用于研究任何可在活细胞中表达并带有荧光标记的蛋白质。
方案
1. 质粒设计
目的蛋白与两种不同荧光标签之一进行融合，具体如下所述。荧光标签不仅可提供蛋白在细胞内定位的信息，还可提供有关蛋白同源寡聚化的定量信息1。荧光共振能量转移（FRET）技术2-4被用于获取有关蛋白相互作用的信息5-10。FRET 利用的是能量可在两个分子之间通过偶极-偶极相互作用发生转移的原理：当一个光学激发的分子（通常称为供体，D）与一个未激发的分子（通常称为受体，A）彼此靠近时，能量可从供体转移至受体11。在设计编码融合蛋白的质粒时，应牢记以下两个关键特征。
- 在FRET研究中，选择一对相容的荧光标签至关重要。理想情况下，荧光标签组合必须满足两个条件：供体标签的发射光谱与受体标签的激发光谱之间具有显著的波长重叠，以及激光脉冲光谱的中心波长与受体标签激发光谱之间具有较大的分离（即较大的斯托克斯位移）。绿色荧光蛋白的两种变体特别适合满足这些条件：以GFP2作为供体12, 1314，黄色荧光蛋白（YFP）12或其一种变体Venus15作为受体。Cerulean16也可用作供体，但效果相对稍弱。
- 在定量FRET成像中，最好每次（平均而言）仅激发分子复合物中的一个供体，以避免在含有多个供体和一个受体的复合物中，多个供体竞争向同一受体传递能量。这有助于简化理论模型和数据分析过程17。因此，信号水平通常较低。为补偿这一点，目标蛋白的表达水平应相对较高。可通过使用高拷贝质粒将蛋白基因导入细胞来实现高水平表达。
2. 酵母转化
最大限度提高表达目标蛋白构建体的细胞群体比例具有显著优势。为此，我们采用两种不同的质粒转化一种无法合成色氨酸或尿嘧啶的酵母营养缺陷型菌株（Saccharomyces cerevisiae），其中一种质粒含有色氨酸筛选标记，另一种含有尿嘧啶筛选标记。这些质粒还包含指导细胞表达目标蛋白的基因，目标蛋白分别与两种荧光探针之一进行标记。转化后的细胞培养于缺乏色氨酸和尿嘧啶的固体培养基平板上。至少应转化三类细胞：表达同时标记两种荧光探针的目标蛋白的细胞、仅表达带有供体荧光探针标记蛋白的细胞，以及仅表达带有受体荧光探针标记蛋白的细胞。
- 提前至少一天制备固体培养基平板（1.7 g/L 无氨基酸酵母氮源基础培养基，1.6 g/L 无尿嘧啶和色氨酸酵母合成缺陷型培养基，2% [w/v] 葡萄糖，2% [w/v] 琼脂），用于转化细胞的生长培养。若无污染，固体培养基平板在制备后可保存使用长达两个月。
- 对于每一对要转化的质粒，向锥形瓶中加入10 mL YPD培养基（10 g/L Bacto酵母提取物、20 g/L Bacto蛋白胨和2% [w/v]葡萄糖）。用待转化的营养缺陷型酵母菌株的单菌落接种YPD培养基。
- 将含有酵母培养物的锥形瓶置于实验室摇床中，通过圆周振荡作用处理样品，并在以下条件下过夜培养： 30° C次日早晨，通过定期取出少量培养液并检测其光密度（OD），开始监测细胞培养物的生长情况。转化时，细胞培养物的生长应处于对数中期，即光密度值为0.5–1.0。
- 沉积 5 μL 将两种质粒分别加入到每个需转化的质粒组合对应的无菌微量离心管中。
- 对于每一对要转化的质粒，加入 5 μL 向一个空的微量离心管中加入鲑鱼精子DNA（5 mg/ml）。将装有鲑鱼精子DNA的微量离心管下半部分浸入沸水中，持续5分钟。为防止微量离心管盖子在加热过程中弹开，仅将离心管的下半部分浸入水中。从沸水中取出后，将装有鲑鱼精子DNA的微量离心管置于冰上，至少冷却2分钟。
- 添加 5 μL 向含有质粒的每个微量离心管中加入鲑鱼精子DNA。
- 测量酵母培养物的光密度（OD），以确认其已达到对数中期（即OD读数在0.5至1.0之间）。
- 将酵母悬液在1000×g离心2分钟。
- 弃去上清液，用涡旋振荡器将酵母沉淀重悬于无菌去离子水中。
- 再次以1000xg离心悬浮液2分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于 T.E 缓冲液中的 0.1 M LiOAc 溶液（0.1 M LiOAc in T.E）中（配制方法：1.02 g LiAc，10 mL pH 7.4 的 1 M Tris 溶液，以及 10 mL pH 8.0 的 0.1 M EDTA 溶液）。0.1 M LiOAc in T.E 的体积应等于原培养体积的 1/100th YPD 培养基中原始酵母培养物体积的
- 分配 100 μL 将细胞分别加入含有质粒的各微量离心管中。轻轻弹动每根试管，以混匀细胞与质粒。
- 添加 400 μL 44% [w/v] 聚乙二醇（PEG）4000将溶液加入各微量离心管中。
- 轻轻混匀 PEG4000 用手指和拇指捏住微量离心管盖和管底，轻轻混合细胞与质粒。为避免细胞破裂，此步骤切勿使用涡旋振荡器。操作时，缓慢倒置离心管，再缓慢恢复至直立位置，并旋转离心管 90° 围绕其圆柱轴缓慢翻转，然后再缓慢倒转。重复此过程数次，使细胞沿微量离心管管壁的整个表面滑下。
- 将微量离心管放入 30° 孵育45分钟。
- 孵育45分钟后，将细胞从培养箱中取出，重复步骤14中所述的轻柔混匀操作。
- 将微量离心管放入 42° 水浴孵育15分钟。再次注意，仅将微量离心管的下半部分浸入水中。
- 之后 42° 孵育时，向微量离心管中加入 1 mL 灭菌去离子水。
- 将离心管放入台式微量离心机中离心5秒。使用移液器从离心管中移除上清液。
- 添加 100 μL 向每支微量离心管中加入无菌去离子水，并通过倒置混匀的方式将无菌去离子水与细胞混匀。
- 将单个微量离心管中的内容物加入可筛选该管中所含特定质粒的生长培养基平板中。加入4-6颗经灭菌的玻璃珠（直径1 mm）。轻轻摇动含有转化酵母细胞液滴和玻璃珠的平板，使细胞均匀分散在琼脂培养基表面。对每组转化细胞重复此操作。
- 将培养皿放入 30° 在培养箱中培养3-5天。3-5天后，生长培养基表面可见多个直径为1-3 mm的酵母菌落。此时，细胞已可进行光谱分辨双光子显微镜成像。
3. 光谱分辨双光子显微镜的校准
本研究中使用的光谱分辨双光子显微镜已在其他文献中详细描述18, 19。简而言之，采用一台高功率固态连续波激光器泵浦一台锁模钛宝石（Ti: Sapphire）激光器，后者产生波长范围约为 750 至 830 nm 的飞秒脉冲。激光束通过高数值孔径（NA）的显微镜物镜聚焦，在样品上形成一个衍射极限的光斑。由于双光子激发的概率较低，激发仅发生在光束焦点附近区域。通过一对正交的计算机控制扫描镜，可在样品平面内沿两个不同方向（在整个方案中称为 x 和 y 方向）移动激光焦点。样品中被照射体素产生的反向传播荧光发射，在到达 EM-CCD 阵列的像素之前，经由发射光路中放置的透射光栅分光为不同的光谱组分。因此，焦点区域内任意荧光分子/分子的完整光谱轮廓将在 CCD 阵列的一个维度（y 方向）上获得。通过调节两个扫描镜中其中一个的运动，可使激光焦点在样品内沿一条垂直于 y 方向的直线进行扫描。在 CCD 相机快门保持开启的状态下完成单线扫描，即可在激光束一次扫过样品的过程中，收集沿整条扫描线分布的荧光分子的光谱轮廓。在细胞内不同 y 位置上累积多次此类线扫描，可获得样品中大量荧光复合物的光游戏副本。由线扫描获取的图像经重建后，可得到样品在不同波长下的多个 x-y 荧光强度空间分布图18, 19。为了准确重建并计算对应于 x-y 荧光强度空间分布图的实际波长，必须使用具有明确表征荧光发射光谱的样品对线扫描方案进行校准。
- 光谱分辨双光子显微镜通过将激发光束的焦点在样品多个位置进行扫描，从而累积获取成像细胞中寡聚体复合物的光谱信息。
- 一对正交扫描镜用于将激光束的焦点在样品上沿两个不同方向移动。扫描镜的运动由计算机控制，并与CCD相机荧光强度数据的采集同步进行。
- 从线扫描数据中，可重建对应于特定波长光的荧光强度空间分布图。为准确重建 x-y 荧光强度空间图并计算对应于每幅图的实际波长，必须使用荧光素溶液校准线扫描程序。
- 开始校准程序时，将激发光谱中心设在800 nm波长处，该波长为供体标签GFP最大激发波长的2倍。2. 为了使激发光谱居中，调节激光腔内的棱镜以改变群速度色散。该棱镜安装在由计算机控制的线性电动平移台上。
- 使用与相机连接的计算机程序，向CCD芯片发送指令，将其温度降至可达到的最低温度，以减少暗噪声。
- 移液器 10 μL 将荧光素溶液滴加到显微镜载玻片上，盖上盖玻片，使样品在盖玻片与载玻片之间的区域均匀分散成一层薄层。
- 在盖玻片表面滴加一滴浸油
- 现在将显微镜载玻片固定到 x-y-z 移动载物台/样品台，并通过手动调节控制光学轴方向运动的线性驱动器，在光学轴方向上平移载物台/样品台。平移载物台/样品台，直至显微镜物镜接触到浸油液滴。
- 使用控制相机的计算机程序，切换到视频模式进行数据采集，使照射到CCD阵列上的发射光实时显示在计算机屏幕上。缓慢调节控制平移台沿光轴方向移动的千分尺，将样品调整至激光束的焦点位置。
- 当荧光素样品处于焦平面时，其发射光将在CCD阵列上呈现为一条清晰的亮线。使用控制相机的计算机程序，将CCD阵列的像素强度读数下载至计算机。在Image J中打开下载的强度值矩阵，通过荧光区域画一条线，测量CCD阵列上各像素强度随位置的变化。使用Image J命令“分析→轮廓分析”（Analyze→Plot Profile）生成荧光素样品发射光谱的图谱。
- 调节控制激光焦点在镜面上移动的增量参数 y 方向，使得相邻的 y 样品中不同位置导致荧光光谱峰值在CCD阵列的光谱维度上恰好移动一个像素。通过下载两种不同条件下的荧光素光谱强度值图像来监测这一现象 y 在样品的不同位置，使用 Image J 打开强度图像，并利用 Image J 的游标在每条荧光光谱中找到峰值像素位置。
- 保持CCD快门打开，将激光焦点在样品上进行扫描 x 方向。沿扫描线方向上每个体素发出的光应入射到CCD阵列上。
- 存储由此线扫描获得的CCD阵列数据，然后清除CCD阵列的像素。
- 移动激光焦点的位置以 y 根据本节第11步确定的量进行调整。
- 扫描激光束 x 沿样品方向再次移动，打开CCD阵列的快门并存储数据。
- 重复此行扫描程序，直至激光照射的物理区域比单个生物细胞的尺寸大约50%。
- 特定线扫描图像的行号与波长之间的关系应被用于重建图像，以获得多个 x-y 不同波长下的荧光强度空间分布图。为获得 x-y 特定波长（λ）下的荧光发射图像j），在第一次线扫描获得的图像中找到与该波长对应的行号。随后，下一次线扫描图像的相邻行即对应于该特定波长荧光发射图像的下一行。将所有对应于此波长的图像行堆叠起来，以获得 x-y 在该波长下获取样品的荧光强度空间分布图。对所有其他可获得的波长重复此步骤。
- 计算与每个相关的波长 x-y 荧光强度空间图，根据图像索引确定每幅重建图像的背景校正后归一化荧光强度（j）。相机在光谱维度上的像素位置与发射光子的波长之间呈近似线性关系；因此，重构后的 x-y 荧光强度空间分布图图像及其对应的波长也呈线性关系，并按如下方式计算：
其数值为 m 由：表示
在上述形式体系中，符号 λj 表示波长的 jth 重建图像。λ 的值最大 和 λ½ 从荧光素样品的发射光谱中提取，分别对应于荧光样品荧光强度达到最大值和半最大值时的波长。图像索引 j最大 和 j½ 分别对应于具有最大荧光强度以及最大荧光强度一半的重建图像。
4. 收集目标生物样本的数据
- 为获取样品数据，首先从培养箱中取出含有转化酵母菌落的培养板。应至少有三种类型的转化细胞，其半高全宽（FWHM）需满足要求：
- 表达同时标记了两种荧光探针的目标蛋白的细胞；
- 仅表达带有供体荧光探针标记蛋白的细胞；以及
- 仅表达带有受体荧光探针标记蛋白的细胞。
- 向微量离心管中加入 100 μL 的 100 mM KCl 溶液。使用移液器吸头从表达供体和受体荧光探针标记蛋白的细胞培养板上刮取 3–5 个酵母菌落，并将这些细胞接种至 100 mM KCl 溶液中。
- 取 10 μL 细胞悬液滴加到新的显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖液滴，并在盖玻片表面滴加一滴浸油。
- 手动关闭激光光路中的快门，以阻止激光照射到显微镜物镜。
- 将显微镜载玻片固定在 x-y-z 三维平移台上，并沿光轴方向移动载玻片/平移台，直至显微镜物镜接触浸油液滴。
- 由于发射光路中存在透射光栅，样品的宽场图像会严重模糊。因此，在透射光栅前的光路中放置一个半高全宽（FWHM）较小的带通滤光片。打开宽场照明光源，进入相机视频模式进行数据采集。在相机屏幕上观察细胞图像的同时，缓慢沿光轴方向移动平移台，直至细胞图像清晰对焦。
- 在 x 或 y 方向上移动平移台，使单个细胞位于激光束焦点位置。
- 关闭宽场照明光源，从发射光路中移除带通滤光片。
- 短暂解除激光束阻断（< 1 秒），同时观察 CCD 阵列接收到的信号。若在激光照射细胞期间 CCD 阵列检测到荧光信号，则对该细胞执行完整的荧光数据采集扫描。必须使用与先前校准步骤中确定的相同扫描参数，特别是扫描线数和 y 方向步进增量。
- 对大量表达同时标记供体和受体标签蛋白的细胞，重复上述细胞定位与荧光数据采集过程。
- 在获得表达双标记蛋白细胞的荧光图像后，对仅表达供体荧光探针标记蛋白的细胞和仅表达受体荧光探针标记蛋白的细胞，重复整个实验流程。
- 根据第 3 节所述方法，重建所有扫描数据，为每组数据生成光谱分辨的 x-y 荧光强度空间图。
5. 图像分析
单次扫描荧光生物细胞所获得的 x-y 荧光强度空间图中，每个像素均包含对应激发体素内分子复合物的完整光谱谱型。如果目标蛋白相互作用，则该光谱谱型将包含来自供体和受体荧光探针信号的混合成分。为了确定目标蛋白之间的相互作用性质，必须采集细胞内大量此类蛋白复合物的光谱谱型，并计算每个像素的表观FRET效率（Eapp），即通过FRET从供体荧光探针激发态转移至受体荧光探针的部分所占的比例。
- 确定第4节中所述的仅表达带有供体荧光探针标记蛋白的细胞的重建图像的背景校正后荧光强度，并将其归一化至最大值。由于每幅重建图像对应一个独立的波长（λj) 这组归一化的荧光强度值对应于供体探针测得的发射光谱， iD (λj).
- 对仅表达带有受体荧光标签蛋白的细胞重复步骤1，以获得受体探针的实测发射光谱， iA (λj由于受体探针的选择使其极少被激光源直接激发，因此仅含受体的样品所产生的信号将较低，可能与细胞固有的自发荧光信号处于同一数量级。因此，以这种方式测得的受体荧光光谱在进一步分析前可能需要校正，以消除自发荧光的贡献。
- 使用步骤1和步骤2中获得的归一化光谱，根据以下关系式，对共表达供体荧光探针标记蛋白和受体荧光探针标记蛋白的细胞的荧光发射光谱中每个像素进行光谱解卷积 I(λj)= kDAiD (λj) + k阿尔茨海默病iA (λj）的位置 I(λj）代表每个特定像素测得的荧光光谱。这些值 kDA 和 k阿尔茨海默病 分别与供体在受体存在下的荧光发射以及受体在供体存在下的荧光发射成正比 5.
- 使用以下公式计算每个像素处表观FRET效率，以描绘细胞内蛋白质相互作用：
。在此， QD 和 QA 分别为供体荧光探针和受体荧光探针的量子产率，且 wD 和 wA 分别为归一化后的供体和受体发射光谱的积分19, 20. - 最后，使用计算得到的数值绘制直方图 E应用程序 对于每个像素，其中特定情况发生的次数 E应用程序 出现的频次被绘制在对应特定数值的坐标上 E应用程序.
6. 直方图分析
为了从 E应用程序 直方图，每个直方图理论上均按以下公式用多个高斯函数的和进行拟合：
,
其中 Ai 是振幅，σi 标准差，以及 E0i 最可能的FRET效率 iith 高斯函数。不同的寡聚体大小和构型导致不同的数量（n） E0i 以及它们之间不同的相关性 1, 17例如，对于菱形四聚体，预计会出现五个峰，其表达式如表1所列。
表1. 五种高斯峰中心值与预测的菱形四聚体中成对FRET效率之间的关系。
这意味着在数据拟合过程中，只需调整一个 E0i 值——即对应于 Ep 的那个值，其余四个值则由 Ep 的值计算得出。
- 假设一个寡聚体模型，并确定用于拟合 Eapp 直方图的高斯函数数量1。通过调整 Ep、Ai 和 σi 来拟合直方图。请注意，直方图之间的相对位置由模型固定。最小化拟合的卡方值或其它拟合优度函数。
- 假设另一种可能的寡聚体模型，并重复步骤 1。
- 选择在所用参数数量下最能拟合数据的模型。这可能需要使用统计检验方法（例如每个自由度的卡方值）。
代表性结果
图1展示了对表达交配型α因子受体（Ste2p）的酵母细胞进行光谱分辨双光子显微测量后计算得到的kDA、kAD和Eapp空间分布图21, 22。
图 1. 表达 sterile 2 α-因子受体的酵母细胞。 通过对表达 sterile 2 α-因子受体（Ste2p）的酵母细胞进行光谱分辨双光子显微镜成像，并对每个像素位置应用光谱解卷积处理，获得供体（kDA）和受体（kAD）信号的二维图谱。荧光强度根据其数值被赋予伪彩色，比例尺以插图形式显示。通过 kDA 和 kAD 图像计算得到表观 FRET 效率的二维图谱。
使用从图1所示细胞的Eapp图谱中提取的数值绘制了直方图。图2显示的是与图1细胞测得的Eapp值（圆圈）相对应的拟合直方图。红色实线表示采用单个高斯函数之和（绿色实线）对实测数据进行的最佳拟合。
图 2. 表达 Sterile 2 α因子受体的酵母细胞的 Eapp 值直方图。 本图显示了对应于图 1 所示细胞测得的 Eapp 值（圆圈）的直方图。通过叠加各个高斯函数（实绿色线）来模拟测得的数值（实红色线）。高斯函数参数为：E01=16.7；A1=118.9；σ1=3.2；E02=25.1；A2=100.0；σ2=4.6；E03=32.6；A3=202.6；σ3=4.6；E04=40.1；A4=92.6；σ4=3.7；E05=50.1；A5=16.0；σ5=7.9。
图2直方图中数据拟合所需的高斯均值之间的关系见表1。高斯函数的数量及其相关性对应于预期数量及相关性 E应用程序 菱形四聚体寡聚复合物的数值。因此，从光谱分辨的双光子测量结果可以明显看出，Ste2p 寡聚复合物呈现菱形四聚体的构型 体内19.
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讨论
在本演示中，我们展示了如何在活体条件下测定蛋白质寡聚体复合物的大小和结构信息。in vivo。尽管所展示的数据来源于在酵母细胞中表达的特定膜受体（即 Ste2p），但该方法具有广泛的适用性，可应用于在任何类型细胞中表达的任何蛋白质，唯一前提是这些蛋白质需标记有适当的荧光标记物。未来对该实验方案的改进将包括提升仪器性能，以实现更高的扫描速度，从而尝试监测蛋白质寡聚体大小和结构随时间变化的动力学过程。
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致谢
本工作由威斯康星大学密尔沃基分校研究增长计划、威斯康星生物医学与健康技术研究所以及布拉德利基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白胨 | Fisher Scientific | BP1420 | |
| 酵母提取物 | Fisher Scientific | BP1422 | |
| 聚乙二醇 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| 不含 (NH4)2SO4 和氨基酸的酵母氮源基础 | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| 酵母合成培养基缺失补充剂 | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-1 | |
| 琼脂 | Fisher Scientific | S70210 | |
| 硫酸铵 | Fisher Scientific | A702-500 | |
| 氯化钾 | Acros Organics | 424090010 | |
| 亮氨酸 | Fisher Scientific | BP385 | |
| 组氨酸 | Fisher Scientific | BP382 | |
| 平场消色差无限远校正 100 倍油浸物镜 NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| 光谱分辨双光子显微镜 |
参考文献
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