许多感染会引发强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，但有时反应细胞的数量与病原体的控制之间并不相关1。衡量CTL质量的一个指标是其特异性杀伤能力2。通过CFSE标记靶细胞可用于在体内（in vivo）研究CTL反应的质量3,4。
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摘要
摘要
羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于简便快速地标记目标细胞群体 体内 研究。这种标记方法传统上用于研究细胞增殖和迁移。在本文所介绍的方法中，我们缩短了过继转移后的观察时间，以检测表位特异性CFSE标记靶细胞的存活与杀伤情况4-6CD8+ T细胞克隆的特异性杀伤水平可反映免疫应答的质量，因为其数量可能具有误导性。随着时间推移，特异性CD8+ T细胞可能会出现功能耗竭，表现为细胞因子产生减少和杀伤能力下降7,8此外，某些CD8+ T细胞克隆的杀伤能力可能不如具有不同TCR特异性的其他克隆。9为实现有效的细胞介导免疫（CMI），必须鉴定出能够诱导足够数量且功能强健的应答T细胞的抗原。本文评估了在BALB/c小鼠中两个肽特异性T细胞克隆的细胞特异性杀伤百分比。
方案
1. 通过免疫诱导靶标特异性效应CTL（第0天）
- 开始之前，需确定一个特定的效应细胞：靶细胞系统。本示例为经典的 体内 CTL 检测中，我们将使用纯化的肽进行免疫，以诱导特异性的 CD8+ T 细胞。相同的肽将用于致敏同源靶细胞，从而建立特异性的效应细胞：靶细胞系统。或者，您也可以选择使用全病原体或蛋白质来获得特异性的效应细胞和靶细胞。
- 在生物安全柜内对工作台面进行去污，以确保注射过程的无菌性。通过先将多肽免疫剂置于 50 μg 纯化肽的导入 100 μL 含10% DMSO的PBS/小鼠溶液，置于2 mL离心管中。随后加入等体积的预冷不完全弗氏佐剂，并用1 mm珠子加至0.2 mL刻度线处以助混匀。自此步骤开始，直至注射前均需将免疫原置于冰上。用Parafilm封口膜密封管口。
- 使用珠磨机以最大转速混合乳液3分钟，混匀后立即将乳液放回冰上。所得乳液的稠度应类似于蛋黄酱。将乳液置于冰上静置 4° C 若时间允许（最长可达一周），过夜孵育，若观察到任何分层现象，需进一步混匀。
- 使用1 mL注射器和20或20.5号针头吸取乳状液，注意避免吸入微珠（微珠应大于针头孔径，但仍需留意）。
- 在尾根部进行小鼠皮下注射。我们使用改良的塑料50 mL离心管，以安全、轻柔地固定小鼠，便于注射。向小鼠注射0.2 mL乳剂。
2. 收集目标细胞（第8天）
- 需要使用未免疫的同系小鼠作为靶细胞来源。根据AAALAC标准对未免疫小鼠实施安乐死。
- 使用70%乙醇喷洒小鼠体表进行消毒，以尽量减少小鼠毛发或其他外部污染物带来的污染风险。
- 使用解剖剪在小鼠左侧体表皮肤上剪开一个小口。将皮肤掀开，暴露腹膜腔及内脏器官。
- 剪开腹膜，注意不要损伤其下方的任何器官。脾脏靠近体表，颜色与肝脏相似（深红色），但体积较小，呈肾形。感染小鼠的脾脏通常明显大于未感染对照组小鼠。
- 小心取出脾脏，操作时应轻柔，避免脾脏破裂成多个碎片，以最大限度回收细胞数量。立即将脾脏放入含有10 mL预冷培养基的15 mL锥形离心管中，并继续处理其余小鼠。
- 将15 mL锥形管中的内容物（培养基和脾脏）倒入玻璃组织研磨器中。用力研磨脾脏组织，直至所有组织失去原有颜色，此时可认为已从结缔组织中充分释放出全部细胞。
- 将研磨后的悬液通过70 μm细胞滤网过滤至50 mL锥形离心管中。用新鲜培养基冲洗研磨器，并将冲洗液一并通过细胞滤网。
- 在4°C下以1300 RPM离心7分钟，弃去上清液。
- 用10 mL预配的裂解试剂重悬沉淀，于37°C孵育7分钟。
- 加入最多50 mL新鲜培养基，按上述条件再次离心。
- 用50 mL新鲜培养基重悬细胞，并按上述条件再次离心（洗涤步骤）。*注意：此时若需获得纯化的靶细胞群体用于移植至受体小鼠，可进行磁珠分选特定细胞类型（例如巨噬细胞）。此外，此时也可向培养体系中引入实验性处理，以研究该处理对细胞特异性杀伤的影响。
- 计数细胞，并在96孔圆底组织培养板中每孔接种1 × 107个细胞，体积为100 μL。*此为每孔较高细胞浓度，但由于该检测时间较短，我们观察到在此浓度下细胞活力未受影响。
3. 靶细胞的处理与标记
- 用病原体特异性多肽或无关多肽对照脉冲处理相应细胞及重复样本：加入 1 μg/mL 多肽，4°C 孵育 1.5 小时，随后转移至 37°C 培养箱中继续孵育最后 30 分钟。在此期间准备 CFSE 试剂。
- 根据制造商说明书配制 CFSE，并稀释至 0.5 至 25 μM 之间的使用浓度。将“低”浓度 CFSE 配制成“高”浓度的十分之一。例如，对于[低]浓度，将 0.5 μL CFSE 加入 10 mL PBS 中；对于[高]浓度，将 5 μL CFSE 加入 10 mL PBS 中。标记前将配制好的 CFSE 预热至 37°C。
- 从培养箱中取出细胞培养板，在室温下以 1300 RPM 离心 7 分钟收集细胞沉淀。轻弹去除上清液。
- 通过向相应孔中加入 200 μL 适当的 CFSE 试剂，将细胞重悬于[低]或[高]浓度 CFSE 中，并在 37°C 孵育 15 分钟。
- 从培养箱中取出细胞培养板，再次在室温下以 1300 RPM 离心 7 分钟。轻弹去除上清液。
- 将细胞重悬于每孔 200 μL 预热的新鲜培养基中，并在 37°C 孵育 30 分钟。
- 从培养箱中取出细胞培养板，在室温下以 1300 RPM 离心 7 分钟。轻弹去除上清液。
- 将细胞重悬于每孔 100 μL PBS 中。
- 进行过继转移时，每只小鼠注射一份[低]标记细胞孔与一份[高]标记细胞孔的混合细胞。最终注射体积为 0.2 mL，其中包含 50% 特异性靶细胞和 50% 无关细胞。
- 切记保留部分标记细胞，用于数据分析时作为非转移对照组，并用于流式细胞仪检测（见图 1）。
4. 过继性转移
- 按照 AAALAC 标准对先前经肽段免疫的小鼠（本方案第 #1 部分）进行麻醉。
- 通过眶后途径向受体小鼠注射 0.2 mL 标记的靶细胞。
- 在处死受体小鼠前，等待 6 小时或预先确定的最佳时间。
5. 收集标记细胞
*注意：步骤 5.1 至 5.11 与步骤 2.1 至 2.11 相同
- 计数细胞，并将细胞以每孔100 μL体积接种到96孔圆底组织培养处理板中，每孔接种量为1 × 106个细胞。
- 向所有孔中加入100 μL 2%多聚甲醛，使终浓度为1%多聚甲醛，用于固定回收的和未转移的细胞。
6. 流式细胞术与数据分析
- 在流式细胞仪上运行样本并分析数据。
7. 代表性结果
在所得直方图中，表位特异性峰的降低是细胞特异性杀伤的指标（图1）。使用以下公式（见表1）计算细胞特异性裂解的实际值：
比率 = 无关百分比 : 表位特异性百分比（[低]峰:[高]峰），
特异性裂解百分比 = [1 -（未转移对照组比率 / 实验组比率）] × 100
图 1. 回收的 BALB/c 小鼠脾细胞的 CFSE 分析图谱。 数字表示高或低 CFSE 表型细胞的百分比。A) 未转移对照组。所有[高]CFSE 峰代表表位特异性靶细胞，而[低]CFSE 峰代表用无关肽段致敏的靶细胞。B) 从 PBS 免疫受体小鼠（对照）回收的 CFSE 标记细胞。C) 从两只不同肽段特异性受体小鼠回收的 CFSE 标记细胞，注意表位特异性峰减少。
图 2. 分析数据的图形表示。 每组小鼠（PBS、肽 A 和肽 B）均显示三个数据点。
| 样本 | CFSE 高百分比 表位肽刺激组 | CFSE 低百分比 无关对照组 | 低:高 比值 | 表位特异性杀伤百分比 |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| Peptide A | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| Peptide A | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| Peptide A | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| Peptide B | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| Peptide B | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| Peptide B | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NT Control | 47.4 | 52.6 | 1.11 | |
| Pep A NT Control | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| Pep B NT Control | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
表1. 代表性数据分析。 “NT”为未转染。
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讨论
该实验可经修改用于研究细胞的增殖能力，包括克隆扩增，因为CFSE在子代细胞中的分布相对均等10,11。此外，也可利用CFSE标记来研究细胞迁移6,12，但根据具体研究假设，可能存在更合适的方法，例如四聚体技术或生物发光成像13，这些方法也可与CFSE标记联合使用。
需要注意的是，CFSE 在流式细胞仪中会渗漏到多个通道，因此如果要进行表面标志物的共染色，选择PeCy7作为荧光染料较为合适，而PE的效果可能不佳。
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披露
无利益冲突声明。动物实验均依照威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指南与规定进行。
致谢
我要感谢 Bianca Mothé、Carla Oseroff 和 Marie-France DelGuercio 向我介绍免疫学检测方法和小鼠操作技术。G. A. Splitter 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1-RO1-AI-073558、GLRCE 资助项目 1-U54-AI-057153 以及 BARD 资助项目 US-3829-06 提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mm 玻璃珠 | Biospec 产品 | 11079110 | |
| 70 μm细胞滤筛 | BD 生物科学 | 352350 | |
| 96孔板 | Costar | 3799 | |
| 不完全弗氏佐剂 Adjulite’佐剂 | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特公司 | n/a | |
| Kontes 玻璃组织研磨器 | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| 针 | BD 生物科学 | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney塑料包装 | PM992 | |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 157-8 | |
| PBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse 裂解试剂 | BD 生物科学 | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11875-093 | |
| 注射器 | BD生物科学 | 309602 | |
| Vybrant CFSE 试剂盒 | Invitrogen | V12883 |
参考文献
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
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