许多感染会引发强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，但有时反应细胞的数量与病原体的控制之间并不相关1。衡量CTL质量的一个指标是其特异性杀伤能力2。通过CFSE标记靶细胞可用于在体内（in vivo）研究CTL反应的质量3,4。
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本文内容
摘要
摘要
羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于简便快速地标记目标细胞群体 体内 研究。这种标记方法传统上用于研究细胞增殖和迁移。在本文所介绍的方法中，我们缩短了过继转移后的观察时间，以检测表位特异性CFSE标记靶细胞的存活与杀伤情况4-6CD8+ T细胞克隆的特异性杀伤水平可反映免疫应答的质量，因为其数量可能具有误导性。随着时间推移，特异性CD8+ T细胞可能会出现功能耗竭，表现为细胞因子产生减少和杀伤能力下降7,8此外，某些CD8+ T细胞克隆的杀伤能力可能不如具有不同TCR特异性的其他克隆。9为实现有效的细胞介导免疫（CMI），必须鉴定出能够诱导足够数量且功能强健的应答T细胞的抗原。本文评估了在BALB/c小鼠中两个肽特异性T细胞克隆的细胞特异性杀伤百分比。
方案
1. 通过免疫诱导靶标特异性效应CTL（第0天）
- 开始之前，需确定一个特定的效应细胞：靶细胞系统。本示例为经典的 体内 CTL 检测中，我们将使用纯化的肽进行免疫，以诱导特异性的 CD8+ T 细胞。相同的肽将用于致敏同源靶细胞，从而建立特异性的效应细胞：靶细胞系统。或者，您也可以选择使用全病原体或蛋白质来获得特异性的效应细胞和靶细胞。
- 在生物安全柜内对工作台面进行去污，以确保注射过程的无菌性。通过先将多肽免疫剂置于 50 μg 纯化肽的导入 100 μL 含10% DMSO的PBS/小鼠溶液，置于2 mL离心管中。随后加入等体积的预冷不完全弗氏佐剂，并用1 mm珠子加至0.2 mL刻度线处以助混匀。自此步骤开始，直至注射前均需将免疫原置于冰上。用Parafilm封口膜密封管口。
- 使用珠磨机以最大转速混合乳液3分钟，混匀后立即将乳液放回冰上。所得乳液的稠度应类似于蛋黄酱。将乳液置于冰上静置 4° C 若时间允许（最长可达一周），过夜孵育，若观察到任何分层现象，需进一步混匀。
- 使用1 mL注射器和20或20.5号针头吸取乳状液，注意避免吸入微珠（微珠应大于针头孔径，但仍需留意）。
- 在尾根部进行小鼠皮下注射。我们使用改良的塑料50 mL离心管，以安全、轻柔地固定小鼠，便于注射。向小鼠注射0.2 mL乳剂。
2. 收集....
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讨论
该实验可经修改用于研究细胞的增殖能力，包括克隆扩增，因为CFSE在子代细胞中的分布相对均等10,11。此外，也可利用CFSE标记来研究细胞迁移6,12，但根据具体研究假设，可能存在更合适的方法，例如四聚体技术或生物发光成像13，这些方法也可与CFSE标记联合使用。
需要注意的是，CFSE 在流式细胞仪中会渗漏到多个通道，因此如果要进行表面标志物的共染色，选择PeCy7作为荧光染料较为合适，而PE的效果可能不佳。
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披露
无利益冲突声明。动物实验均依照威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指南与规定进行。
致谢
我要感谢 Bianca Mothé、Carla Oseroff 和 Marie-France DelGuercio 向我介绍免疫学检测方法和小鼠操作技术。G. A. Splitter 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1-RO1-AI-073558、GLRCE 资助项目 1-U54-AI-057153 以及 BARD 资助项目 US-3829-06 提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mm 玻璃珠 | Biospec 产品 | 11079110 | |
| 70 μm细胞滤筛 | BD 生物科学 | 352350 | |
| 96孔板 | Costar | 3799 | |
| 不完全弗氏佐剂 Adjulite’佐剂 | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特公司 | n/a | |
| Kontes 玻璃组织研磨器 | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| 针 | BD 生物科学 | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney塑料包装 | PM992 | |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 157-8 | |
| PBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse 裂解试剂 | BD 生物科学 | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11875-093 | |
| 注射器 | BD生物科学 | 309602 | |
| Vybrant CFSE 试剂盒 | Invitrogen | V12883 |
参考文献
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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