我们详细介绍了一种用于斑块生物学二维血管内分子成像的新型近红外荧光（NIRF）导管 体内NIRF 导管可通过检测对斑块具有高亲和力的可激活型和靶向型近红外荧光染料的存在，从而实现对炎症等关键生物过程的可视化。该导管采用符合临床标准的工程设计和功耗要求，旨在应用于人类冠状动脉。以下研究描述了一种多模态成像策略，该策略利用一种新型的 体内 用于成像和定量蛋白水解活性炎症兔动脉粥样硬化斑块中炎症斑块的血管内近红外荧光导管。
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摘要
摘要
血管对损伤的反应是一种协调有序的炎症反应，由巨噬细胞在血管壁内积聚所触发，导致富含脂质的管腔内斑块积聚、平滑肌细胞增殖以及血管管腔进行性狭窄。这类易损斑块易于破裂，是大多数急性心肌梗死病例的基础。复杂的分子与细胞炎症级联反应由T淋巴细胞和巨噬细胞的募集及其对内皮细胞和平滑肌细胞的旁分泌作用所调控。1
动脉粥样硬化的分子成像已发展成为一种重要的临床和研究工具，能够实现对炎症及其他生物学过程的体内可视化。近年来多个实例表明，该技术可用于检测患者体内的高危斑块，并评估药物治疗对动脉粥样硬化的影响。4 尽管已有多种分子成像方法（特别是磁共振成像和正电子发射断层扫描）能够对颈动脉等大血管的生物学特征进行成像，但目前可用于冠状动脉成像的技术手段仍十分有限。2 高分辨率光学成像策略（尤其是近红外荧光成像，NIRF）的出现，结合可激活的荧光探针，显著提高了检测灵敏度，并推动了新型血管内成像技术的发展，从而改善了对人类冠状动脉粥样硬化的生物学成像能力。
近红外荧光（NIRF）分子成像利用特定带宽（650–900 nm）的激发光作为光子源，当该激发光照射到光学对比剂或荧光探针时，会发射出可在近红外窗口检测的荧光信号，该信号可通过适当的发射滤光片和高灵敏度电荷耦合相机进行检测。与可见光相比，近红外光在组织中的穿透深度更深，受血红蛋白、脂质和水等内源性光吸收剂的衰减作用显著减弱，并且由于近红外窗口内自发荧光降低，可实现较高的靶/背景比。在近红外“窗口”内成像可显著提升活体成像的潜力。2,5
利用可激活的近红外荧光探针已对炎症性半胱氨酸蛋白酶进行了深入研究10，并在动脉粥样硬化的发生中发挥重要作用。通过降解细胞外基质，半胱氨酸蛋白酶在动脉粥样硬化的发展及并发症中具有重要贡献。8特别是，半胱氨酸蛋白酶——组织蛋白酶B（cathepsin B）在实验性小鼠、兔以及人类动脉粥样硬化斑块中高表达，并与巨噬细胞共定位。3,6,7 此外，斑块中的组织蛋白酶B活性可被检测到 体内 利用一种先前描述过的1-D血管内近红外荧光技术6，结合一种可注射的纳米传感器试剂，该试剂由多聚赖氨酸聚合物主链衍生出多个近红外荧光染料（VM110/Prosense750，激发/发射波长 750/780 nm，VisEn Medical，Woburn，MA）组成，基线状态下可产生强烈的分子内淬灭。10 在组织蛋白酶B等半胱氨酸蛋白酶（已知与斑块巨噬细胞共定位）介导的靶向酶切反应后，荧光染料发生分离，从而显著增强近红外荧光（NIRF）信号。利用新型二维血管内NIRF导管对NIR荧光信号进行血管内检测，现已实现高分辨率、几何形态准确的成像 体内 检测炎症斑块中组织蛋白酶B的活性
与先前的1维光谱方法6相比，采用基于导管的二维近红外荧光（NIRF）成像技术进行动脉粥样硬化体内分子成像是一种新颖且具有前景的工具，该技术利用富含巨噬细胞斑块中增强的蛋白酶活性来检测血管炎症。11,12 以下研究方案描述了使用血管内二维NIRF导管，结合斑块生物学的关键特征，对斑块结构进行成像和表征的方法。该平台具有可转化性，当与现有的临床成像技术（包括血管造影和血管内超声（IVUS））结合时，可提供一种独特而新颖的多模态分子成像技术，能够区分炎性动脉粥样硬化斑块，并可在人体尺寸的冠状动脉中检测到血管内NIRF信号。
方案
体内 动物模型：实验性主动脉髂动脉粥样硬化的建立
1）基线血管造影与球囊去内膜术
- 在获取基线血管造影和进行球囊去内皮损伤之前，新西兰大白兔需饲喂高胆固醇（1%）饮食1周。选用该动物模型具有转化医学意义，原因如下：1）兔的主动脉-髂动脉血管直径与人类冠状动脉相当（2.5–3.5 mm）；2）高脂血症合并球囊损伤模型可诱导形成炎症性动脉粥样硬化，其炎症细胞（巨噬细胞）和分子（组织蛋白酶）与人类动脉粥样硬化相似。
- 在胆固醇喂养后，使用丙泊酚和氯胺酮对动物进行麻醉。采用15号手术刀片在颈部腹侧正中做约1英寸长的切口。通过钝性分离技术，暴露气管右侧筋膜下方的肌肉组织。沿结缔组织连接处分离左侧胸头肌，暴露右侧颈总动脉。将动脉与迷走神经分离后，在动脉近端和远端分别放置缝线环，以便牵拉和阻断血流。在动脉上做1至2 mm的斜行切口，插入5 French（外径1.67 mm）血管鞘，并通过鞘管动脉内给予肝素（1000 μ/mL，约150单位/kg）。
- 随后在2秒内注射造影剂（优维显）1至2 mL，以获取远端主动脉及双侧髂动脉的对照血管造影图像。
- 接着通过内皮去内皮化损伤髂股动脉和主动脉。在标准透视引导下，将3Fr Fogarty取栓导管置入远端髂股动脉，并用0.3至0.5 mL的造影剂（50%造影剂/50%生理盐水）或空气充盈球囊。随后在球囊充盈状态下将导管从右侧髂动脉和远端主动脉向近端回撤，直至左肾动脉开口处。完成球囊去内皮操作后，重复进行血管造影以确认血管通畅性。血管造影结束后，拔除所有导管和血管鞘，结扎近端右侧颈总动脉，使用4/0可吸收缝线缝合肌肉和筋膜，皮肤切口则用4/0不可吸收缝线缝合。
- 术后给予动物一次抗生素（头孢唑林，0.5克，肌内注射）治疗，并根据需要给予镇痛药物（如布托啡诺，0.01 mg/kg，肌内注射，每日两次）。球囊去内皮术后继续维持1%胆固醇饮食4周。第5周起，将动物饮食转换为0.3%胆固醇饮食。
兔动脉粥样硬化斑块的多模态整合成像
2) 利用可注射纳米传感器标记蛋白水解活性炎症斑块；血管造影，血管内超声（IVUS）及 体内 兔动脉粥样硬化斑块的血管内近红外荧光成像
- 球囊损伤后第八周，成像前24小时，通过耳缘静脉向兔体内静脉注射500 nmol/kg的Prosense/VM110（PerkinElmer）。
- 注射后24小时，对动物实施麻醉，并通过左侧颈总动脉建立动脉通路（见步骤1.2）。经动脉内给予肝素（150单位/kg）。按上述方法获取基线血管造影图像。
- 将IVUS导管装载至适用于临床冠状动脉的0.014英寸导丝上，并插入鞘管中。在透视引导下，将导丝的不透射线尖端置于右侧髂动脉远端。然后采用标准临床单轨技术将IVUS导管推进至近端髂动脉。
- 启动100 mm的回撤成像，记录图像。获取血管的纵向重建图像，并识别管腔内的斑块。
- 将NIRF导管11,12装载至0.014英寸导丝（单轨系统）上，小心地将导管插入鞘管，并将成像头端置于右侧髂动脉远端。
- 执行多次自动回撤成像（1 mm/秒纵向回撤速度，每分钟30圈），记录动脉粥样硬化区域内的荧光信号。记录图像，并根据信号范围进行适当的缩放和窗宽调整以进一步处理图像。
3) 安乐死与分离 离体 主动脉-髂动脉组织
- 通过静脉单次注射1cc安乐死试剂（含390mg戊巴比妥钠和50mg苯妥英钠的溶液）实施安乐死。
- 用0.9%生理盐水灌注动脉系统，直至下腔静脉无血液残留。辨认动脉粥样硬化性主动脉及髂动脉，并从周围组织中分离。此外，同时获取大小约为2×2 cm的肝、肾、脾和心肌小块组织样本。
- 此时可使用血管内近红外荧光（NIRF）成像导管进行离体（ex vivo）NIRF成像。将血管拉长，重新插入NIRF导管至近端主动脉，使成像头端位于右髂动脉或分叉处。随后进行多次自动回撤成像操作（同上，见2.6节）。
4) 离体 离体主动脉和髂动脉的荧光反射成像（FRI）
- 将解剖组织置于 10–20 cc 生理盐水中，并运送至进行 FRI 分析（Kodak Image Station 4000MM Pro，Carestream Health, Inc.）。
- 将主动脉和髂血管拉长以接近实际长度，并在多个波长下获取图像 [白光、绿色荧光通道（激发 495 nm，发射 515 nm）、Cy5（激发 565 nm，发射 670 nm）和 Cy7（激发 650 nm，发射 760 nm）]。每个波长使用一系列不同的曝光时间（0.1–30 秒），所获取的图像以 DICOM 或 16 位未缩放 TIFF 文件格式导出，用于进一步分析。作为阳性和阴性对照，器官（肝、脾、肾和心）在相似通道和曝光时间下成像。
- 在近红外通道（780 nm 以上）中，动脉粥样硬化动脉区域显示出信号增强。
5) 用于切片和免疫组织化学分析的组织包埋
- 识别正常组织区域（非损伤组织，即左侧髂动脉）和斑块区域，将小段5-10 mm的组织嵌入OCT（最佳切割温度）介质中。组织块保存于-80°C，直至切片。
- 进行标准的切片与免疫组织化学分析操作。进行苏木精和伊红染色、Ram-11染色以及组织蛋白酶B（Cathepsin B）染色。
多模态图像的分析与整合（血管造影、血管内超声、近红外荧光和荧光分子断层成像）
6）NIRF 与 FRI 图像的处理
- 使用 MATLAB 和 Osirix 软件分别处理包含 NIRF 和 FRI（近红外 780 nm 通道）回撤成像数据的 DICOM 文件。通过适当的窗宽设置以显示完整的信号强度范围，最终图像导出为 TIFF 文件。
- 将文件导入标准图像处理软件（可使用 Keynote）。根据参考点（如血管造影中的椎体、髂动脉分叉和肾动脉）对图像进行对齐，并识别正常血管区域和斑块区域。
- 手动勾画感兴趣区域（ROI）（针对正常组织和斑块区域），并分别使用 Osirix 和 MATLAB 获取 FRI 与 NIRF 图像的平均信号强度。为指导准确勾画，可参考血管的纵向 IVUS 图像，正常血管与斑块区域可被清晰识别。
- 计算斑块区域的靶区与背景（TBR）比值。
代表性结果：
完成上述实验方案后，我们能够识别并表征主动脉和髂血管内炎症斑块中组织蛋白酶（cathepsin）蛋白酶活性增强的区域。通过注射可激活的纳米探针（Prosense/VM110），可识别出具有蛋白水解活性的斑块。在近红外通道（750 nm）使用FRI成像时，这些斑块表现为明亮或信号强度高的区域。NIRF回拉图像中信号强度的增加与FRI结果一致，并可与IVUS图像配准，从而实现NIRF信号的解剖学定位。由FRI和NIRF计算得到的斑块靶本比（TBR）相似（见图3：NIRF平均TBR为4.2，FRI平均TBR为2.9）。对高信号斑块的免疫组织化学分析证实，RAM-11和组织蛋白酶B活性在斑块区域显著存在（数据未显示）。
图1. 二维近红外荧光（NIRF）导管示意图 为了拓展一维近红外荧光（NIRF）传感方法的临床应用潜力6，我们构建了一种新型的二维NIRF导管，用于血管内成像11,12。该定制导管包含一根光学纤维（直径125微米，封装于聚乙烯管中：2.9F），通过750 nm激光激发光源进行照射。激光以相对于光纤轴线90度的角度发射。该系统采用两个自动马达（旋转和直线运动），实现同步的360度成像和纵向回撤，从而获得真正的二维图像。图片经参考文献11许可使用。
图 2．示意图展示蛋白酶介导的纳米传感器 Prosense/VM110 的激活过程。图片经参考文献 10 许可使用。
图 3体内与离体斑块TBR（靶向/背景比值）
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讨论
炎症性高风险或易损斑块可能是大多数心肌梗死的主要原因。在症状出现之前识别此类斑块，对于预测临床预后和指导医学治疗具有重要意义。传统的冠状动脉成像方式（如X射线血管造影）通常侧重于管腔狭窄的表征，而非揭示高风险但通常非狭窄性病变的潜在生物学特征。血管内近红外荧光（NIRF）分子成像提供了一种可应用于心脏导管室的转化技术，该技术通过利用可识别斑块内活性巨噬细胞的纳米传感器，将斑块炎症的生物学特性纳入评估——巨噬细胞的存在是易破裂炎症斑块的细胞学标志。9
上述方案采用了一种多模态整合方法，结合血管造影、血管内超声（IVUS）和近红外荧光（NIRF）成像，以识别炎症性斑块。这种新型的二维NIRF导管利用了近红外荧光波段优异的光学特性，能够穿透血液检测分子特征，具有广阔的应用前景 体内 分子成像方法。纳米传感器Prosense/VM110偶联了在780 nm处发射荧光的荧光染料，并利用自猝灭机制，当组织蛋白酶B（在常驻巨噬细胞中高表达）未对其进行蛋白水解切割或激活时，荧光信号处于猝灭状态。该传感器可检测 体内 近红外荧光导管检测到的...
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披露
FAJ - 前顾问，VisEn Medical；荣誉酬金，Boston Scientific
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金（项目编号：R01 HL 108229）、美国心脏协会科学家发展基金（项目编号：0830352N）、霍华德·休斯医学研究所职业发展奖、Broadview Ventures、欧洲共同体第七个框架计划（FP7/2007-2013，项目编号：235689）以及麻省总医院William Schreyer奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Prosense 750 | Visen Medical | VM110 | 500 nmol/kg 静脉注射 |
| 肝素钠 | APP Pharmaceuticals | 401586D | |
| 头孢唑林 | NovaPlus | 46015683 | |
| 2% 盐酸利多卡因 | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | |
| 丁丙诺啡 | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 | |
| 氯胺酮 | Hospira Inc. | NDC 0409-2051-05 | |
| 1% 高胆固醇饮食 | Research Diets | C30293 | |
| 0.3% 高胆固醇饮食 | Research Diets | C30255 |
参考文献
- Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
- Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
- Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
- Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
- Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
- Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
- Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
- Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
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