本视频展示了从中肠胚期果蝇胚胎制备原代神经元培养物的方法。活细胞培养物的图像显示了接种后1小时的细胞状态，以及在碳酸氢盐为基础的限定培养基中生长2天后的分化神经元。这些神经元具有电兴奋性，并能形成突触连接。
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摘要
摘要
本视频展示了从中肠胚阶段的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎制备原代神经元培养的操作流程。视频演示了胚胎收集及其使用次氯酸钠溶液脱膜的方法。通过连接口吸管的玻璃移液器，我们展示了如何从单个胚胎中移除全部细胞。视频还演示了将每个胚胎的细胞分散至未包被的玻璃盖玻片上、体积为5 µL的小滴培养基中的操作方法。接种后1小时在显微镜下的观察图像展示了理想的细胞密度。在确定型培养基中培养时，存活的细胞大多数为神经母细胞，这些细胞在培养中可分裂一次或多次，并在12至24小时内开始延伸出神经突。体外培养2天后，在显微镜下观察可看到健康培养物中典型的神经突生长程度及分支情况。这些培养物置于简单的碳酸氢盐基础确定型培养基中，在22–24°C、5% CO2的培养箱内生长。神经突在培养的第一周内持续发育，当其与邻近细胞的神经突接触时，通常会形成具有功能的突触连接。这些培养中的神经元表达电压门控钠离子、钙离子和钾离子通道，并具有电兴奋性。该培养系统适用于研究调控神经元分化、兴奋性以及突触形成与功能的分子遗传和环境因素。
方案
一、果蝇胚胎收集
- 准备卵收集平板
- 将 200 ml dH2O 与 8 g 琼脂一起煮沸
- 冷却至 50°C
- 加入 2 ml 乙醇和 2 ml 乙酸
- 倒入 35 mm 塑料培养皿中，盖上皿盖
- 冷却后置于密封容器中，4°C 保存
- 可制备约 80 个平板
- 制备酵母糊
- 将弗氏活性干酵母溶于水中形成糊状物
- 微波加热 20–30 秒以灭活酵母（注意防止沸腾溢出）
- 储存于 10 cc 注射器（不带针头）中，4°C 可保存 2 周
- 果蝇： 用于收集卵的成虫通常在羽化后 3 至 14 天内产卵能力最强，前提是已提供新鲜食物。许多突变品系的生育力下降，表现为产卵率降低以及最适产卵年龄发生变化。通常，数百只成虫可构成一个良好的产卵群体。
- 操作步骤：在卵收集平板上均匀涂抹一层薄薄的酵母糊，以提供利于产卵的基质。将成虫转移至洁净的卵收集瓶中，并用胶带将收集平板固定在瓶口。不要将果蝇留在瓶中超过 3–4 小时，否则湿度上升会导致果蝇粘附在酵母糊或瓶壁上无法脱身。
二、使用次氯酸钠溶液去除胚胎卵膜
- 安装一个连接至抽滤瓶的布氏漏斗，并将抽滤瓶连接到抽气泵。在漏斗中放入一张 Whatman #1 滤纸。开启抽吸，用无菌蒸馏水润湿滤纸。
- 用洗瓶中的水流将收集板上的胚胎冲洗到滤纸上。
- 用数倍体积的无菌水冲洗胚胎，关闭抽气泵，然后加入一漏斗体积的 50% 次氯酸钠溶液（漂白剂）。让卵静置 5–10 分钟。卵壳在 1–2 分钟内即被溶解，但胚胎在漂白剂中停留时间越长，污染的酵母被杀灭得越多。挑出随冲洗从培养皿中脱落的成虫或幼虫。
- 用无菌蒸馏水将胚胎冲洗至一个无菌培养皿中（非组织培养级培养皿）。如果培养皿未预先润湿，许多胚胎会粘附在皿底。在此培养皿中用无菌水冲洗数次。
- 使用透射光观察胚胎，挑选出原肠胚中期阶段的胚胎。
三、单胚胎培养的制备
- 制备 DDM1（见第四部分的配方）
- 在培养前，倒掉胚胎培养皿中的水，并用无菌培养基覆盖胚胎。
- 准备3个35 mm的培养皿。每个培养皿中放入4个已灭菌的圆形盖玻片。在每张盖玻片上滴加5 µl培养基。使用Bellco品牌的低铅玻璃盖玻片。
Bellco Biological Glassware
800-257-7043
货号 #1943-00012 - 拉制一些较细的移液管。我们使用的移液管是在Narishige PP-83拉制仪上拉制的。移液管的具体尺寸并不关键，通常我们会拉得比所需更细，然后在与胚胎同一视野下折断尖端，以判断其大小。你既不希望一次性吸入所有胚胎，也不希望尖端过细导致吸入细胞耗时长达5分钟。应介于两者之间为宜。使用透射光观察胚胎，并通过连接在移液管上的口吸管将胚胎内容物吸出。将细胞轻轻吹出，尽可能靠近盖玻片表面，使其分散到已准备好的盖玻片上。你可能需要在高倍镜下进一步检查盖玻片，并以相同方式进一步分散细胞。
- 让细胞静置时间不超过10分钟。随后用培养基充满培养皿，并置于培养箱中，在使用限定培养基时需提供4-5% CO2环境，温度控制在22–24°C之间。我们常规使用23°C和95%的湿度。湿度至关重要，以避免蒸发。可将标准哺乳动物培养箱放置于冷室中，并将温度设定为23°C。
IV. 用于培养菌种的 DDM1 定义培养基
- 配制DMEM：取100 ml Ham's F12/DME培养基（DMEM）（Irvine Scientific #9052）。
- 加入0.476 g Hepes（20 mM）（Sigma #H-3375），混匀。
- 加入1.25 ml L-谷氨酰胺（200 mM）（Irvine Scientific #9317），混匀。
- 在超净台中使用0.2 µm醋酸纤维素注射器滤器过滤（需使用2个滤器）。
- pH值为6.64，渗透压为288 mOsm/kg。
- 将培养基分装至15 ml离心管中，每管10 ml。
- 4°C保存，不超过2周。
注意：始终使用经高压灭菌的过滤水，并在专用于培养基和添加剂的容器中配制。切勿将用于其他用途的pH电极或磁力搅拌子放入培养基中。在接种培养前，向DMEM中加入下所列的添加剂以配制DDM1。
- 向10 ml DMEM中加入：
- 100 µl 转铁蛋白（Transferrin）
- 100 µl 腐胺（Putrescine）
- 100 µl 硒（Selenium）
- 100 µl 孕酮（Progesterone）
- 50 µl 胰岛素（Insulin）
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讨论
从中期原肠胚阶段的果蝇胚胎制备的培养物中，神经元来源于神经母细胞前体，其中许多前体在体外分化之前会进行分裂。因此，该系统为研究在神经元发育极早期阶段起重要作用的遗传和环境因素提供了独特的机遇（Rohrbaugh 等，2003）。我们已证明，在简单定义培养基中培养的神经元可分化为具有电兴奋性的神经元，并能形成功能性突触连接（O Dowd，1995；Lee 和 O Dowd，1999）。结合突变体分析和/或药物干预，并利用标准的全细胞记录技术，该模型系统可用于探究基因和环境因素在电兴奋性发育及突触传递过程中的作用（Hodges 等，2002；Lee 和 O Dowd，2000；Lee 等，2003）。
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NS27501 对 DKOD 的支持。此外，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）教授资助项目也为本工作提供了额外支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Drosophila melanogaster | 动物 | 果蝇 | ||
| 转铁蛋白 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T-1147 | 100倍储存液：10 mg/ml 溶于水。使用0.2 µm 注射器滤器（醋酸纤维素）过滤。分装为220 µl 每份（用于20 ml DMEM），于-20°C保存。 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-6634 | 200倍储存液：10 mg/ml 溶于0.05N HCl。使用0.2 µm 注射器滤器（醋酸纤维素）过滤。分装为120 µl 每份（用于20 ml DMEM），于-20°C保存。 | |
| 腐胺 | Sigma-Aldrich | P-5780 | 100倍储存液：10 mM 溶于ddH₂O。使用0.2 µm 注射器滤器（醋酸纤维素）过滤。分装为220 µl 每份（用于20 ml DMEM），于-20°C保存。 | |
| 硒 | Sigma-Aldrich | S-5261 | 100倍储存液：3 µM 溶于ddH₂O。取0.0051 g 硒加入标记为A的15 ml 离心管中（3 mM 储存液），加入10 ml 无菌水。从A管取10 µl 加入含10 ml ddH₂O的B管中（得到3 µM 储存液）。将B管溶液通过0.2 µm 注射器滤器（醋酸纤维素）过滤。分装为220 µl 每份（用于20 ml DMEM），于-20°C保存。 | |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P-6149 | 100倍储存液：2 µg/ml。1. 向含有0.001 g 孕酮的瓶子中加入1 ml 100% EtOH；2. 加入49 ml ddH₂O；3. 取1 ml 上述溶液加入另一含9 ml ddH₂O的离心管中；4. 使用0.2 µm 注射器滤器（醋酸纤维素）过滤；5. 分装为220 µl 每份（用于20 ml DMEM），于-20°C保存。 | |
| DDM1 | 培养基 | 向10 ml DMEM中加入以下储存液：100 µl 转铁蛋白、100 µl 腐胺、100 µl 硒、100 µl 孕酮、50 µl 胰岛素。 | ||
| 培养皿 | ||||
| 盖玻片 | Bellco Glass | 1943-00012 | 低铅玻璃，已高压灭菌。 | |
| 滤纸 | Whatman, GE Healthcare | #1 | ||
| 10 cc 注射器 | 工具 | |||
使用该培养基制备的细胞培养物必须在约22–24°C、5% CO₂的培养箱中维持。我们使用标准的哺乳动物组织培养箱，并将其置于冷室中加热至23°C。始终使用高压灭菌并过滤的水，并在专用于培养基和添加剂的容器中配制。切勿将用于其他用途的pH计或磁力搅拌子放入培养基中。 |
参考文献
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
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