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甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

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DOI：

10.3791/2264

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2010年12月20日

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1Department of Biochemistry / Analytics, caprotec bioanalytics GmbH, 2Institute of Organic Chemistry, RWTH Aachen University

本文内容

摘要

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia coli）全细胞裂解液中分离甲基转移酶，并通过质谱法（MS）对其进行鉴定。

摘要

基于功能性小分子-蛋白质相互作用来降低蛋白质组复杂性的方法有多种，例如亲和层析1或活性为基础的蛋白质谱型分析2。三功能捕获化合物（CCs，图1A）3构成了一种通用方法的基础，在该方法中，小分子探针（选择性功能，此处为S-腺苷-L-高半胱氨酸，SAH，图1A）与靶蛋白之间初始的平衡驱动相互作用，通过CC的独立光激活反应功能基团（此处为苯基叠氮化物）与靶蛋白表面发生光交联而被不可逆地固定。分选功能基团（此处为生物素）则用于在固相介质（此处为链霉亲和素磁珠）的帮助下，从复杂的生物混合物中分离CC-蛋白质偶联物。实验有两种可能的构型：“离珠”4或目前所描述的“在珠”构型（图1B）。选择性功能基团几乎可以是任何感兴趣的小分子（如底物、抑制剂、药物分子）。

S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM，图1A）在自然界中作为辅因子的使用频率可能仅次于ATP5, 6。它是所有生物体内主要的甲基供体，该化学反应由依赖SAM的甲基转移酶（MTases）催化，可对DNA7、RNA8、蛋白质9或小分子10进行甲基化。鉴于甲基化反应在多种生理过程（如基因调控、表观遗传、代谢等）中具有关键作用，对MTases的功能分析预计将在功能蛋白质组学中发挥与激酶分析相当的重要性。然而，目前尚缺乏用于此类分析的有效工具。我们近期开发了一种以S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）作为选择性基团的化学探针（CC），以填补这一技术空白（图1A）。

S-腺苷高半胱氨酸（SAH）是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）在甲基转移后产生的产物，已知是一种普遍的甲基转移酶（MTase）产物抑制剂11。由于天然辅因子SAM还被其他酶用于转移辅因子的其他部分或引发自由基反应，且SAM本身化学性质不稳定12，因此SAH成为共价探针（CC）靶向MTase的理想选择性功能基团。本文中，我们通过分析大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）DH5α菌株中的MTase及其他SAH结合蛋白，展示了SAH-CC与CCMS的应用价值。大肠杆菌是研究最为透彻的原核生物之一，已被广泛用作无数生物化学、生物学和生物技术研究中的模式生物。光激活交联可提高实验的产率和灵敏度，且可通过使用过量游离SAH进行竞争实验，便捷地验证结合特异性。

方案

1）制备 E. coli DH5α 细胞裂解液

  1. 接种2 mL培养液（试管中的LB培养基） E. coli 从甘油菌种中直接接种 DH5α 菌株，在 37°C、250 rpm 条件下振荡培养 8 小时。使用经高压灭菌的 LB 培养基（10 g/L Bacto-tryptone，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，pH 7.5）。
  2. 在1 L带挡板的摇瓶中加入250 mL LB培养基，接种2 mL菌液，在37°C、166 rpm的振荡培养箱中过夜培养。
  3. 接种四个带挡板的5 L摇瓶，每瓶装有2.5 L LB培养基，每瓶接种50 mL上述250 mL培养液，共四瓶，于37°C、166 rpm条件下培养至OD600 达到0.8时。
  4. 在4°C、3000 × g条件下离心20分钟收集细胞。后续操作在0–4°C或冰上进行。
  5. 将收获的细胞材料重悬于Milli-Q水中，合并至一个离心管中，在6000×g、4°C条件下进一步离心30分钟。
  6. 将所得的20 g细胞材料于-20°C或-78°C保存。
  7. 将细胞重悬于 100 mL 冰冷的细胞裂解缓冲液（6.7 mM MES，6.7 mM NaOAc，6.7 mM HEPES，1 mM EDTA，10 mM β-巯基乙醇，200 mM NaCl，pH 7.5，10% (w/v) 甘油；0.2 mM PMSF）中，分四次，每次 25 mL，在冰上使用超声破碎仪（例如 BANDELIN electronic GmbH 的 SONOPULS HD 2070）超声处理，每次 1 分钟，共进行三次。 & Co. KG，最大振幅，连续输出）
  8. 在 2370 × g 条件下于 2°C 离心裂解液过夜。
  9. 通过超滤（例如使用 Pierce 的 iCON 浓缩器，7 mL/9K）在 2370×g 和 2°C 条件下将上清液浓缩至 14 mL。
  10. 通过凝胶过滤在2°C下从小分子（如SAM或SAH）中去除黏稠的浓缩液（例如Pierce Zeba脱盐离心柱，10 mL，共四根；以1000×g离心2分钟去除储存缓冲液；每根柱子用5 mL冰浴细胞裂解缓冲液平衡四次，每次平衡后以1000×g离心2分钟去除缓冲液；每根柱子上样3.5 mL浓缩液；先以24×g离心45分钟，随后以1000×g离心2分钟，重复两次）
  11. 将所得的13 mL裂解液与13 mL预冷的甘油及Roche mini蛋白酶抑制剂混合片剂（无EDTA）混合。充分混匀并溶解片剂。
  12. 将裂解液于 -20°C 保存
  13. 通过Bradford法测定总蛋白浓度（本实验中为21 mg/ml）。Bradford试剂配制：将100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%（w/v）磷酸，待染料完全溶解后加水定容至1 L，使用前用Whatman #1滤纸过滤。

2）捕获实验（A）、竞争对照（C）、下拉实验（PD）、下拉实验的竞争对照（CPD）以及联合捕获实验加下拉实验（A+PD）

  1. 在捕获实验中，使用 SAH caproKit（caprotec bioanalytics GmbH），其中包括 SAH-CC、作为竞争物的游离 SAH、直径为 1 μm 的链霉亲和素包被磁珠（Dynabeads MyOne Streptavidin C1，Invitrogen Dynal）、5X 捕获缓冲液（5X CB，含 100 mM HEPES、250 mM 醋酸钾、50 mM 醋酸镁和 50% 甘油）以及 5X 洗涤缓冲液（5X WB，含 250 mM Tris HCl，pH 7.5、5 mM EDTA、5 M NaCl、42.5 μM 辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷）。
  2. 对于多个平行实验，建议配制水、捕获缓冲液和 E. coli 裂解液的主混合液，并在一条 200 μL PCR 管条的不同管中进行反应（推荐使用 0.2 mL Thermo-Strip，Thermo Scientific，AB-1114）。此处给出单个反应管的用量。将展示五个不同实验的结果，分别为捕获实验（A）、竞争对照（C）、下拉实验（PD）、下拉实验的竞争对照（CPD）以及联合捕获实验加下拉实验（A+PD）。
  3. 每管反应中，通过将 0.3 mL 5X WB 加入 1.2 mL Milli-Q 水中，配制 1.5 mL 1X WB。
  4. 在 200 μL PCR 管条中制备负载 SAH-CC 的链霉亲和素包被磁珠（caproBeads）。具体操作为：每份样品中，将 25 μL 100 μM SAH-CC 与 50 μL 10 mg/mL 链霉亲和素包被磁珠混合，在室温下剧烈振荡 2 分钟，使 SAH-CC 的生物素部分与磁珠表面的链霉亲和素结合；然后使用强磁铁（例如 caproMagTM 磁力装置，caprotec bioanalytics GmbH）将磁珠收集至 PCR 管条盖中。弃去上清液，用 200 μL WB 重悬磁珠，再次磁力收集（在 PCR 管条盖中），弃去洗涤液 WB。封闭管盖以防止磁珠干燥。
  5. 在新的 PCR 管中，于 0–4°C 下使用主混合液（见步骤 2.2）制备大肠杆菌 DH5α 全细胞裂解液分装样品。对于单个反应，加入适量 Milli-Q 水使最终反应体系体积为 100 μL，并加入 20 μL 5X CB。混匀后，加入 0.26 mg E. coli 裂解液，轻轻颠倒混匀。仅对 C 和 CPD 组，加入 20 μL 10 mM SAH 竞争溶液，并轻轻颠倒混匀（A、PD 和 A+PD 组则加入等体积 Milli-Q 水代替 SAH 溶液）。从 A 组中取 1 μL 样品用于后续分析（见下文）。
  6. 将 caproBeads 悬浮于相应的裂解液中，在 4°C 下孵育 3 小时，同时通过旋转保持磁珠悬浮状态，以允许 SAH 结合蛋白可逆地结合至 SAH-CC 的 SAH 选择性功能位点。
  7. 将 A、C 和 A+PD 组的悬浮液置于 caproBoxTM 装置中（caprotec bioanalytics GmbH 提供的用于在冷却条件下对生化样品进行紫外照射的设备），在 0–4°C 的封闭管中总照射 30 分钟，以在 SAH-CC 的反应性功能基团与 SAH 结合蛋白之间形成共价交联。具体操作为：每照射 2.5 分钟后，将样品从 caproBoxTM 中取出，浸入冰水中冷却约 15 秒（特别是管盖部分），多次颠倒混匀，短暂离心（约 2 秒）以去除管盖内残留的液体，然后放回 caproBoxTM 进行下一轮照射。
  8. 向 A 组中加入 20 μL 10 mM SAH 溶液，向 C、PD、CPD 和 A+PD 组中加入 20 μL Milli-Q 水，在 4°C 下孵育 10 分钟，以在 A 组中置换未与 SAH-CC 交联的 SAH 结合蛋白。孵育过程中通过旋转或间歇性手动重悬保持磁珠悬浮。
  9. 使用强磁铁（如 caproMagTM）收集各组中的 caproBeads，弃去上清液，并用 200 μL 1X WB 对磁珠进行六次洗涤（每次均通过重悬和磁力收集），最后用 200 μL Milli-Q 水洗涤一次。
  10. 磁珠可在 4°C 的 Milli-Q 水中保存数周。另有替代方案可用于捕获蛋白的后续处理与鉴定（见讨论部分）。
  11. 用 200 μL 60% 乙腈（ACN）洗涤磁珠三次，然后加入 200 μL 新鲜配制的 60% ACN/0.2% 三氟乙酸（TFA），在室温下剧烈振荡孵育 10 分钟，以将捕获的蛋白从磁珠上洗脱下来。使用 LC-MS 级试剂和水。
  12. 磁力收集磁珠，分离上清液，并使用离心浓缩仪（例如 GeneVac, Inc.，英国生产的 MiVac DNA 浓缩仪）将上清液完全蒸发至干。弃去磁珠。

3) 捕获蛋白质的SDS-PAGE

  1. 进行SDS-PAGE时，将从磁珠中洗脱的蛋白质（来自步骤2.12的蒸发后ACN/TFA溶液）溶解于20 μL SDS上样缓冲液（50 mM Tris HCl，320 mM β-巯基乙醇，2.5% SDS，0.05%溴酚蓝，10%甘油，pH 6.8）中。取步骤2.5中A组分的1 μL样品与19 μL SDS上样缓冲液混合；取该溶液5 μL用于SDS-PAGE分析（相当于反应体系的0.25%）。将样品在SDS上样缓冲液中95°C加热10分钟，随后冷却至室温。
  2. 采用SDS-PAGE进行分析（通用设置：OLS® ProPage 4-20% Tris/甘氨酸预制胶；OLS omniPAGE小型凝胶电泳系统；SDS电泳缓冲液：25 mM Tris碱，200 mM甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3；在冰浴冷却SDS电泳缓冲液条件下，180 V恒压电泳90分钟）。
  3. 使用与质谱兼容的银染方法对凝胶进行染色（例如Sigma公司的ProteoSilver银染试剂盒）。典型结果如图2所示。

4) 蛋白质的凝胶内胰蛋白酶消化及凝胶条带中肽段的提取

  1. 银染染色结束后，去除银染终止液，用 100 mL 去离子水（Milli-Q 水）清洗凝胶至少三次，每次 10 分钟。
  2. 将凝胶条带切下（例如使用洁净的手术刀），转移至 0.5 mL 离心管中，可于 -20°C 保存或直接进行后续处理。分别用 100 μL 水、100 μL 50% 乙醇、100 μL 水、100 μL 50% 乙醇各洗涤 15 分钟，并用纯乙醇洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤一次。
  3. 用 10 μL 胶内消化液（12.5 ng/μL 测序级胰蛋白酶溶于 50 mM 碳酸氢铵中；配制方法：将 7.5 μL 浓度为 0.5 μg/μL 的胰蛋白酶溶液（溶于 1 mM HCl）加入 292.5 μL 50 mM 碳酸氢铵溶液中）在 4°C 下重悬凝胶条带 45 分钟。吸除上清液，加入 20 μL 50 mM 碳酸氢铵（不含胰蛋白酶），于 37°C 摇床孵育过夜。
  4. 收集上清液。为提取肽段，将凝胶条带与 20 μL 5% 甲酸（FA）在振荡条件下孵育 15 分钟，加入 20 μL 乙腈（ACN），继续振荡孵育 15 分钟。将此次上清液与前次上清液合并，并重复肽段提取步骤一次。
  5. 将合并后的三次上清液完全真空离心干燥，溶于 10 μL 5% 甲酸中，通过超声（超声水浴仪，例如德国 Bandelin 的 Sonorex）并伴随振荡使其充分溶解，随后进行脱盐处理（步骤 5.2 及后续步骤）。

5) 捕获蛋白质的胰蛋白酶消化及LC-MS/MS肽段制备

  1. 将从磁珠中洗脱的蛋白质（步骤 2.12 中蒸发除去乙腈/TFA 溶液后的残留物）用 10 μL 50 mM 碳酸氢铵溶液通过超声水浴和涡旋溶解，加入 1 μL 浓度为 0.5 μg/μL 的胰蛋白酶（溶于 1 mM HCl），37°C 过夜孵育。
  2. 使用 C18 材料对捕获蛋白的胰蛋白酶消化肽段进行脱盐（例如 2–10 μL StageTips，20 μL 枪头，Proxeon Biosystems A/S，丹麦欧登塞；按厂家操作：先用 10 μL 50% 甲醇/5% 甲酸预处理，再用 10 μL 5% 甲酸平衡，加载捕获蛋白的肽段，用 10 μL 5% 甲酸洗涤，最后用 10 μL 50% 甲醇/5% 甲酸洗脱两次）。
  3. 将脱盐后的肽段（溶于 50% 甲醇/5% 甲酸）完全蒸发至干燥，加入 5.5 μL 0.1% 甲酸并在振荡及超声水浴条件下溶解，随后通过 nanoLC-MS/MS 分析样品。

6) 纳升液相色谱-串联质谱分析

  1. 将样品转移至样品板，并将样品板放入纳米流液相色谱（nanoLC）系统中（例如 Easy-nLC 液相色谱系统；Proxeon Biosystems A/S，丹麦）。
  2. 以含 0.1% 甲酸的水溶液作为流动相 A，含 0.1% 甲酸的乙腈溶液作为流动相 B。仅使用 LC-MS 级溶剂。
  3. 使用 5% 乙腈/0.1% 甲酸溶液，直接将 5 μL 肽溶液上样至预柱（例如 nanoflow Biosphere C18，5 μm，120 Å，20 × 0.1 mm；NanoSeparations，荷兰），该预柱连接至分析柱（例如 nanoflow Biosphere C18，5 μm，120 Å，100 × 0.075 mm；NanoSeparations，荷兰）。
  4. 在液相色谱过程中，以 400 nL/min 的恒定流速，在 80 分钟内采用线性梯度从 5% 乙腈/0.1% 甲酸逐步洗脱至 40% 乙腈/0.1% 甲酸，随后用 2 分钟升至 100% 乙腈/0.1% 甲酸，并在 100% 乙腈/0.1% 甲酸条件下维持 8 分钟，以洗脱肽段。
  5. 在高精度先进质谱仪上（例如 LTQ Orbitrap XL 质谱仪；Thermo Fisher Scientific，德国，配备纳米电喷雾离子源用于电喷雾电离（ESI）；Proxeon Biosystems A/S，丹麦）对洗脱的肽段进行质谱（MS）分析。
  6. 以数据依赖模式进行质谱分析，自动在轨道阱-MS（轮廓模式）和 LTQ-MS/MS（质心模式）采集之间切换。
  7. 通过设置自动增益控制的注入时间来控制质谱仪的扫描周期。
  8. 在轨道阱中采集全扫描质谱图（m/z 300 至 2000），在 m/z 400 处分辨率为 r = 60,000（在线性离子阱中累积至目标值 500,000 个电荷后进行）。
  9. 设置仪器依次分离信号最强的离子（最多五个，取决于信号强度），在线性离子阱中使用碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，目标电荷数为 10,000。生成的碎片离子在 LTQ 中记录。
  10. 为在 MS 模式下实现精确质量测定，使用电喷雾过程中从环境空气中产生的单电荷聚二甲基环硅氧烷背景离子（Si(CH3)2O)6H+（m/z 445.120025）作为锁质量，用于实时内部重校准。
  11. 对已进行 CID 选择的母离子动态排除 60 秒内再次被选中的可能。
  12. 设置电荷态筛选，并拒绝未指定电荷态的离子进行 CID 分析。
  13. 其他质谱参数如下：喷雾电压设为 1.6 kV，加热传输毛细管温度设为 200 °C，MS2 的归一化碰撞能量为 35%。进行 MS2 所需的最低信号强度为 500 计数。MS2 采集时应用激活参数 q = 0.25 和激活时间 30 ms。
  14. 为清洗液相色谱系统，在两次连续的 CCMS 测量之间执行一次空白运行。

7) 通过自动化序列数据库搜索进行肽段和蛋白质鉴定

  1. 使用蛋白质鉴定算法分析 MS/MS 数据（在本案例中，数据存储于原始文件中），例如 BioworksBrowser 3.3.1 SP1（Thermo Fisher Scientific，德国）中实现的 SEQUEST 算法，以及 Scaffold 3 软件（版本 Scaffold_3_00_03，Proteome Software Inc.，美国）中实现的 X!Tandem 算法（The Global Proteome Machine Organization；版本 2007.01.01.1）。
  2. 针对所研究生物体的最新 UniProtKB/Swiss-Prot 数据库版本（www.expasy.org）进行自动数据库搜索（本研究使用的数据库：Escherichia coli，K12 菌株，版本 57-11）。
  3. 在 SEQUEST 中进行自动数据库搜索时使用以下参数设置：前体离子质量容差为 5 ppm，碎片离子容差为 1 amu，完全胰蛋白酶特异性，允许最多两次漏切。设定以下可变修饰：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化；甲硫氨酸的氧化；天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺；赖氨酸和丝氨酸的乙酰化；赖氨酸的甲酰化；以及精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的甲基化。数据库搜索中不使用固定修饰。
  4. 将 SEQUEST 生成的 srf 或 dta 文件以及 out 文件导入 Scaffold 3 软件，该软件通过整合 SEQUEST 和 X!Tandem 的数据库搜索结果，对肽段指认和蛋白质鉴定进行概率评估。Scaffold 可用于方便地比较和可视化多个样品（在本案例中为 A、C、PD、CPD 和 A+PD）的蛋白质列表。
  5. 在 Scaffold 3 软件中设置参数，仅考虑由 Peptide Prophet 算法（参考文献13）指定的肽段指认概率 ≥ 95% 的肽段。对于多肽段指认的蛋白质，根据 Protein Prophet 算法13设定蛋白质鉴定概率 ≥ 95%。对于仅由单个肽段鉴定的蛋白质，将蛋白质概率任意设定为 ≥ 50%，并手动检查相应的肽段 MS/MS 谱图。对于包含相似肽段且仅凭 MS/MS 分析无法区分的蛋白质，软件将依据简约性原则进行归类。可采用反向蛋白质数据库方法估算肽段鉴定的假发现率，其值应< 1%。
  6. CCMS 实验的代表性结果见表 1、表 2 和补充表 S1（请注意，某些蛋白质的数据库信息尚未更新，例如 PrmB（又称 YfcB）或 RsmH（又称 MraW）），以及图 3。

8）代表性结果

表1：

蛋白ORF 分子量/kDa描述 底物 ACPDCPDA+PD
Dcm b1961 53.5DNA-胞嘧啶甲基转移酶 DNA (m5C)10001
RlmI b0967 44.423S rRNA m5C1962 甲基转移酶rRNA (m5C)17017020
RlmLb0948 78.923S rRNA m2G2445 甲基转移酶rRNA (m2G)1200010
TrmBb296027.3tRNA (鸟嘌呤-N(7)-)-甲基转移酶tRNA (m7G)1100013
CmoAb187027.8tRNA (cmo5U34)-甲基转移酶tRNA (mcmo5U)70004
RsmGb374023.416S rRNA m7G 甲基转移酶rRNA (m7G)60105
RsmHb008234.916S rRNA m4C1402 甲基转移酶rRNA (m4C)50007
RsmDb346521.716S rRNA m2G966 甲基转移酶rRNA (m2G)20002
RsmBb328948.316S rRNA m5C967 甲基转移酶rRNA (m5C)10000
MnmCb232474.4双功能蛋白，包含 tRNA (mnm(5)s(2)U34)-甲基转移酶tRNA (mnm5s2U)10000
PrmBb233035.050S 核糖体蛋白 L3 Gln150 甲基转移酶 蛋白 (Gln)1300015
CheRb188432.8趋化蛋白甲基转移酶蛋白 (Glu)00001
Cfab166144.9环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶小分子1500014
Tamb151929.0反式乌头酸 2-甲基转移酶小分子20003
CysGb336850.0亚铁血红素合成酶，包含尿卟啉原-III C-甲基转移酶小分子10002
SmtAb092129.8蛋白 smtA(?a)71008
MtnNb015924.45'-甲硫基腺苷/SAH 核苷水解酶小分子b3600039
GlnAb387051.9谷氨酰胺合成酶小分子c9000097
RplKb398314.950S 核糖体蛋白 L11蛋白甲基转移酶 PrmAd 的底物20002

a未（完全）表征

b无甲基化，但S-腺苷高半胱氨酸（SAH）的糖苷键发生断裂

c无甲基化，但SAH结合到ATP结合位点，这由以ATP为竞争物的CCMS实验显示（数据未展示）

d核糖体50S亚基蛋白L11甲基转移酶PrmA的底物；通过CCMS可重复地特异性鉴定（数据未显示）

表1： 通过CCMS实验鉴定出的甲基转移酶及其他选定蛋白质。表中数值表示每种蛋白质的非加权肽段谱图计数。样品为经SDS-PAGE/银染分析的重复样本（见图2）。与拉下实验（PD）相比，CCMS检测方法（A）鉴定出更多的甲基转移酶及其他SAH结合蛋白，且竞争对照组（C）中这些蛋白质几乎完全未被检出，表明其对SAH具有特异性。

表2：

 ACPDCPDA+PD
A111 (64)    
C65 (41)107 (46)   
PD25 (15)23 (13)61 (17)  
CPD23 (13)22 (12)20 (14)47 (14) 
A+PD87 (61)64 (41)23 (14)22 (12)124 (67)

表2： CCMS 运行中鉴定出的蛋白质总数以及各运行之间的蛋白质重叠情况。括号中为至少含有2个肽段的已鉴定蛋白质数量。从相似实验之间较高的蛋白质重叠率（主要是非特异性蛋白质）可以看出该方法具有良好的重复性（A 与 C 相比，尤其是 A 与 A+PD，以及 PD 与 CPD），特别是那些通过至少2个肽段稳定鉴定出的蛋白质。有关维恩图，请参见图3；有关所有已鉴定蛋白质的列表，请参见补充表S1。

显示 CC、SAH 和 SAM 分子合成途径的化学结构示意图。
图 1A： 三功能捕获化合物（CC）的化学结构。选择性功能部分用液滴框标出，反应性功能部分用星形框标出，分离功能部分用半月形框标出。化学性质稳定的 S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）是 S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）在被 SAM 依赖性甲基转移酶催化转移甲基基团后的辅因子产物，SAH 对此类酶具有产物抑制作用。

展示翻译和折叠过程的蛋白质合成序列示意图。
图1B： CCMS“在珠上”工作流程。通过其分选功能，CC被结合到磁珠上（a），所形成的caproBeads与复杂的蛋白质混合物孵育（b），在此过程中，CC的选择性功能与靶蛋白之间建立可逆结合平衡（c）。经紫外照射后（d），反应性功能形成共价交联。在洗涤携带捕获蛋白的磁珠（e）、将交联的CC-蛋白质复合物从磁珠上切割下来（f）以及胰蛋白酶消化（g）之后，可通过质谱分析胰蛋白酶肽段来鉴定所捕获的蛋白质。

protein electrophoresis result showing band separation; molecular weight ladder, labeled proteins
图2： SDS-PAGE/银染分析捕获的蛋白质（图1B中步骤f之后）。泳道说明位于凝胶上方（MW：分子量标记物，最右侧标注了标记条带对应的分子量；L：从反应体系中取出的0.25%样品） E. coli DH5a 全细胞裂解液，在图1B步骤b中加入caproBeads之前；A：在图1B步骤d紫外线照射后添加过量游离SAH的实验；C：在图1B步骤c和d期间以过量游离SAH作为竞争物的对照实验（用于确定非特异性结合的蛋白质）；PD：pull-down实验，即图1B中无紫外线照射步骤d且未添加游离SAH；CPD：使用SAH作为竞争物的pull-down对照；A+PD：联合实验加pull-down，即整个流程中未添加游离SAH。经胶内胰蛋白酶消化后，通过质谱分析鉴定出凝胶条带中切割下来的蛋白质，结果列于最左侧。显然，光交联可提高实验的得率和灵敏度，且可通过加入过量游离SAH的竞争实验便捷地验证其特异性。有关本图所示重复样本的CCMS实验所鉴定出的甲基转移酶及其他选定蛋白质，请见表1。

维恩图，基因数据重叠，过程A、C、PD的比较分析，显示交集
图3：维恩图说明在CCMS检测（A）、竞争对照（C）和pull down（PD）中鉴定出的蛋白质的重叠情况。左图：仅指MTases和SAH核苷水解酶的数量，参见表1。右图：所有鉴定出的蛋白质的数量，参见表2和补充表S1。括号中为至少鉴定到2个肽段的蛋白质数量。

讨论

在执行所述实验方案时，以下注意事项和说明可能有所帮助：a) 共价连接子（CC）的主要优势在于其能够与甲基转移酶（MTase）形成共价键，从而允许后续采用严格的洗涤条件。该共价交联通过紫外光（最大波长310 nm）引发的光化学反应实现。尽管普通室内光源仅含有少量紫外线，但仍需避免SAH-CC在受控且冷却的caproBox照射前长时间暴露于室内光或阳光下。b) 用于分离MTase的生物样品可能含有易于变性的蛋白质，因此必须始终保持样品低温，并在操作过程中避免产生泡沫。c) caproBox可将样品冷却至0–4 °C，但发射紫外光的灯管同时也会产生热量。因此，在照射前需短暂离心反应管，以防止附着在管盖或管壁上的蛋白质形成沉淀核心。d) 若磁珠（例如在洗涤液中）无法通过手动方式重悬，可将样品置于超声水浴中短暂施加超声处理。e) 0.2% TFA/60% ACN溶液需新鲜配制。我们发现，若溶液存放过久，可能导致捕获的蛋白质无法从磁珠上有效切割下来。f) 捕获蛋白质的最终分析通过LC-MS/MS完成。质谱分析是一种高度灵敏的方法，因此在最后步骤（步骤2.11及之后）中必须 exclusively 使用LC-MS级试剂。应避免外来蛋白源（如来自灰尘或实验操作者的角蛋白）对实验造成污染。特别是在最终的消化步骤中，建议保持工作区域清洁，佩戴手套和实验服，必要时佩戴发网，或理想情况下在超净工作台内完成操作。用于胰蛋白酶消化的50 mM碳酸氢铵缓冲液应使用LC-MS级水配制，经0.22 μm滤膜过滤后分装，于-20°C保存，并且每份分装仅使用一次，以避免污染。胰蛋白酶溶液（测序级，Roche，通过向冻干胰蛋白酶中加入1 mM HCl配制成0.5 μg/μl溶液）可在4°C保存数周。g) 为获得可靠的质谱图，ESI-MS/MS分析中必须保持稳定的喷雾状态。h) 若使用不同于本研究中的LC-MS/MS系统，则需针对具体设备单独优化检测参数和肽段鉴定算法。

针对所述实验方案，可进行以下修改：a) 除了使用60%乙腈（ACN）/0.2%三氟乙酸（TFA）从磁珠上洗脱蛋白（步骤2.11）外，也可直接在磁珠悬浮液中进行胰蛋白酶消化（体积同步骤5.1）；或者，对于SDS-PAGE分析，可在步骤2.9收集磁珠后，将其重悬于SDS上样缓冲液中，95°C加热10分钟以释放蛋白（可将整个悬浮液或仅上清液上样至凝胶加样孔中）。我们发现，即使经过多次水相洗涤步骤，在磁珠上直接进行胰蛋白酶消化时，磁珠仍会缓慢释放少量聚合物进入水相胰蛋白酶消化液中。该聚合物污染会干扰质谱对肽段的鉴定，可通过使用80%乙腈（至少洗涤三次）将聚合物从磁珠上彻底洗去。在完成80%乙腈洗涤步骤后，应在进行磁珠上胰蛋白酶消化前，用纯水洗涤磁珠一次。b) 可使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-horseradish peroxidase）结合ECL底物的Western印迹法，检测含生物素的交联剂（CC）与目标蛋白成功交联的情况。因此，既可在步骤3.2获得的凝胶进行转膜检测，也可直接取步骤2.7后的10 μl样品进行Western印迹分析——后者的检测灵敏度比凝胶银染高约10倍。需注意的是，在后一种情况下，除SAH-CC人工标记的生物素化蛋白外，内源性生物素化蛋白也会被同时检测到。c) 我们发现，具体采用“游离交联剂”模式（即交联反应在溶液中自由存在的CC与蛋白之间发生）4，还是采用本文所述的“磁珠结合”模式（图1B），其效果优劣取决于特定实验体系（包括裂解液性质、目标蛋白种类以及CC的选择性和反应活性功能）。

总体而言，该方法还应适用于任何先进的稳定同位素蛋白质或肽段标记技术，或通过二维凝胶电泳对捕获样品进行分析。在“离珠”配置中，还可实现对完整细胞内蛋白质的捕获（未发表结果）。此外，通过质谱肽段测序确定CC在蛋白质序列中邻近的交联位点，可以描绘出药物或辅因子在蛋白质上的结合位点。通过在选择性功能基团上采用不同的化学连接位置以及不同长度的连接臂，可探究小分子与蛋白质的结合模式。如本研究所示，还可鉴定出由选择性功能基团所靶向蛋白质的蛋白结合伙伴（如PrmA作用底物RplK），以及未知的小分子-蛋白质相互作用（如SAH与GlnA之间的相互作用）。综上所述，CCs额外具备的光交联反应活性，使得科学家能够以高灵敏度从复杂的蛋白质混合物中分离和鉴定低丰度蛋白质或功能蛋白质家族，并为研究小分子-蛋白质相互作用提供了一种额外的工具。

披露

Thomas Lenz、Olivia Grabner、Mirko Glinski、Mathias Dreger 和 Hubert Koster 均受雇于 caprotec bioanalytics GmbH, Inc，该公司生产本文所用的部分试剂。

致谢

本工作由人类前沿科学计划组织（HFSP 奖项 2007，RGP0058/2007-C）资助。我们感谢 Richard Roberts 教授发起该项目并进行富有成效的讨论。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SAH caproKit™caprotec bioanalytics GmbH1-1010-050 (50 次反应) 1-1010-010 (10 次反应)包含 SAH-CC、SAH 竞争物、链霉亲和素包被的磁珠、捕获缓冲液和洗涤缓冲液
caproBox™caprotec bioanalytics GmbH1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)用于在冷却样品的同时实现可重复的光激活
caproMag™caprotec bioanalytics GmbH1-5100-001便于无移液操作的磁性颗粒处理

参考文献

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甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析
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