在本视频中，我们演示如何在大鼠脑切片中以全细胞记录模式对多巴胺能神经元施加电导。该技术称为动态钳技术。
本文内容
摘要
摘要
神经科学家通过研究大脑中神经元之间的通信方式来探索大脑功能。许多研究者会观察一个或多个神经元在实验可控输入条件下的电活动变化。神经元的电活动可以在离体脑片上使用玻璃微电极的膜片钳技术进行记录。传统上，实验人员可以通过微电极直接注入电流、电刺激脑片中的其他细胞或残留的轴突连接，或者通过作用于记录细胞膜上受体的药理学手段来模拟神经元输入。
直流电刺激的优点是在记录位点（通常为胞体）能够以高时间精度传递预设的电流波形。然而，由于没有离子通道被实际打开，它不会改变神经元膜的电阻。电流刺激通常采用矩形脉冲，因此无法模拟离子通道的动力学特性。最后，电流刺激也无法模拟离子通道开放时细胞内发生的化学变化。
受体可通过电刺激或药物刺激进行物理激活。使用脑片电刺激时，实验者对受体激活的时间精度较高。然而，受体激活的空间精度有限，且刺激过程中被激活的具体成分尚不明确。后一问题可通过特异性药理学试剂部分缓解。但遗憾的是，药理学试剂的激活过程通常较慢，且其对记录细胞输入信号的空间精度也不明确。
动态钳技术允许实验者根据细胞膜电位的实时反馈，直接改变注入细胞的电流（Robinson 和 Kawai 1993，Sharp et al., 1993a,b；综述见 Prinz et al. 2004）。该技术使实验者能够模拟记录位点在受体激活后所发生的电学变化。施加电流的实时变化由硬件中实现的数学方程决定。
我们最近使用动态钳技术研究了通过激活黑质致密部多巴胺能神经元中的NMDA受体而产生动作电位簇的现象（Deister 等., 2009；Lobb 等., 2010）。在本视频中，我们演示了将NMDA受体电导引入多巴胺能神经元所需的操作步骤。
方案
1. 切片制备
- 使用振动切片机切割脑片。我们采用振动切片机（Microm HM 650V），按照德克萨斯大学圣安东尼奥分校机构动物护理和使用委员会的规定，从异氟烷麻醉的Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories）制备240 μm厚的水平中脑切片。
- 将切片保存在孵育 chamber 中，直至准备记录。我们使用一个加热至32°C并充满人工脑脊液（aCSF；单位为 mM）的孵育容器：126 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、4 MgCl2、2 CaCl2、10 dextrose、25 NaHCO3、1.3 ascorbic acid、2.4 sodium pyruvate 和 0.05 glutathione。
2. 电生理记录
- 将脑片转移至细胞内记录装置中，该装置内灌流温度为35°C的人工脑脊液（aCSF）。所用aCSF成分与1.2步骤相同，但使用2 mM MgCl2且不添加谷胱甘肽。对于水平切制的脑片，通常沿中线将其一分为二。
- 观察目标神经元。我们使用梯度对比成像系统观察黑质中的单个多巴胺能神经元。
- 使用电子电极拉制仪制备电极。我们采用P97型微电极拉制仪（Sutter Instrument Company）拉制电极，使其尖端电阻为4–10 MΩ。
- 用所需的内液填充电极。我们使用的内液成分（单位：mM）如下：138 K-葡萄糖酸盐、10 HEPES、2 MgCl2、0.2 EGTA、0.0001 CaCl2、4 Na-ATP、0.4 Na-GTP。使用1 M KOH将内液pH值调节至7.3，渗透压调节至270–275 mOsm。
- 在目标神经元上形成吉欧姆（gigaohm）级封接，随后通过负压破膜，建立全细胞记录模式。我们采用Multiclamp 700B放大器，并将放大器设置为“I=0”电流钳模式。
3. 使用动态钳技术进行电导应用
- 在动态钳制计算机上运行 RTXI（www.rtxi.org）。将包含 NMDA 受体的自定义模型加载到内存中。通过以下方程实时计算注入细胞的电流：
INMDA = -gNMDA * [1/(1+([Mg]/3.57) * e(-Vm*0.062))] * (Vm - ENMDA) 其中 gNMDA 为期望的电导（单位为 nS；默认设置为 0 nS），[Mg] 为镁离子浓度（在下文示例中设为 1.5 mM），ENMDA 为 NMDA 受体的反转电位（设为 0 mV），Vm 为从放大器测得的细胞膜电位（单位为毫伏）。 - 将动态钳制计算机的输出通过模数转换器连接至放大器的命令输入端。
- 将放大器设置为“IC”电流钳制模式。
- 在 RTXI 中输入所需的 NMDA 受体电导值（例如 40 nS）。此时应可观察到一连串时相性的动作电位爆发。或者，也可通过模拟输出向 RTXI 提供电导信号（图 1A，“g(t)”）。必须在 RTXI 中使用适当的缩放因子，将电压信号转换为西门子单位。
4. 代表性结果
图1A展示了使用动态钳技术施加电导的成功实验设置。利用该设置，我们对黑质致密部中的多巴胺能神经元进行了全细胞胞体记录。多巴胺能神经元通常以较低频率自发放电，呈现类似起搏器的放电模式。通过动态钳技术阶段性施加NMDA受体电导，可诱发动作电位的簇状放电（图1B）。
图1： 使用动态钳技术施加NMDA受体电导。A. 硬件设置示意图，显示细胞内记录装置与动态钳计算机之间的连接。B. 在黑质致密部多巴胺能神经元的全细胞记录中，施加40 nS的NMDA受体电导可诱发一连串动作电位。
讨论
本文所展示的动态钳技术通过允许实验者模拟受体激活的电生理效应，改进了传统的直接电流注入方法。在本视频中，我们展示了可将NMDA受体激活的效应添加至多巴胺能神经元的自发性活动，即诱发一连串动作电位的爆发。
由于硬件/软件实现具有灵活性，因此可以采用多种扩展方式。注入电流的符号可由负切换为正，代表去除激活受体对神经元影响的情景。模型神经元以一系列微分方程的形式表示，也可通过数值方法求解，使实验者能够研究小型神经网络。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由 MH084494（CJL）以及 MH079276 和 NS060658（CAP）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 无水葡萄糖酸钾 | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | 试剂 | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | 试剂 | Fisher Scientific | ||
| 乙二醇双(β-氨基–四氢呋喃-N,N,N’，N’四乙酸 | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | 试剂 | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | 试剂 | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO₃3 | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | 试剂 | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4，无水 | 试剂 | Fisher Scientific | ||
| 葡萄糖 | 试剂 | Acros Organics | ||
| NaCl | 试剂 | Fisher Scientific | ||
| CholCl | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| 丙酮酸钠 | 试剂 | Fisher Scientific | ||
| 抗坏血酸 | 试剂 | Acros Organics | ||
| 谷胱甘肽 | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| 奥林巴斯 BX51WI 显微镜（配备 40 倍物镜） | 显微镜 | 奥林巴斯株式会社 | ||
| 2 个模数转换器 | 仪器设备 | 任何供应商 | ||
| Multiclamp 700B 配 CV-7B 头级放大器 | 仪器设备 | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | 仪器设备 | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil 注射器针头 | 仪器设备 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 显微操作仪 | 仪器设备 | Siskiyou, Inc. | ||
| 监测 | 仪器设备 | 三视图 |
参考文献
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
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