一种等位基因特异性基因表达检测法，用于验证遗传关联的功能基础

摘要

表型相关的遗传关联通常在功能层面上仍不明确。本方法旨在通过分析对转录的SNP呈杂合状态的细胞，评估表型相关遗传标记对基因表达的影响。该技术利用MALDI-TOF质谱法精确测量等位基因特异性的引物延伸产物，实现定量分析。

摘要

与常见复杂性状显著相关的遗传位点数量正在持续增加。然而，大多数这些关联在分子水平上尚未被阐明。DNA变异影响表型的机制之一是基因表达，研究表明基因表达对复杂性状尤其重要¹。

该方法在细胞环境中检测特定DNA序列对基因表达的影响。其原理是通过分析携带一种与疾病相关的DNA序列（即风险变异）拷贝的细胞，来测量来自某个基因两个等位基因的转录本的相对丰度^2,3。因此，本方法所用的细胞必须满足两个基本的基因型要求：细胞在DNA风险变异位点和DNA标记位点上均需为杂合状态，其中DNA标记通常是能够区分转录本染色体来源的编码多态性位点（图1）。DNA风险变异与DNA标记的等位基因频率无需相同，但必须明确这些遗传标记之间的相位（单倍型）关系。此外，选择表达目标基因的细胞类型也至关重要。本实验方案具体描述了从成纤维细胞中提取核酸的操作步骤，但该方法同样适用于其他类型的细胞，包括原代细胞。

从选定的细胞系中提取DNA和RNA，并合成cDNA。利用设计用于靶向编码DNA标记物的引物延伸检测方法对DNA和cDNA进行分析⁴。引物延伸检测根据制造商的说明，使用MassARRAY（Sequenom）⁵平台进行。随后，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）分析引物延伸产物。由于所选标记物为杂合状态，因此在质谱图谱中将产生两个峰。每个峰的峰面积与转录本的丰度成正比，可利用MassARRAY Typer软件中的功能进行测量，从而计算等位基因比例（等位基因1 : 等位基因2）。将cDNA获得的等位基因比例通过基因组DNA测得的等位基因比例进行标准化，后者预期为1:1，以校正技术性偏差。标准化后等位基因比例显著偏离1:1的标记表明，在同一细胞中来自两条染色体的转录本数量存在差异，提示与表型相关的DNA变异可能影响了基因表达。应使用实验对照来验证结果。

方案

1）细胞培养

1. 选择表达目的基因的细胞类型。
2. 选择在目的基因内对DNA风险变异位点和转录编码多态性均为杂合状态的细胞系（图1）。
3. 根据供应商提供的说明培养所选细胞系，并准备2个10 cm的培养皿，分别用于DNA和RNA的提取。
4. 当细胞达到80%融合度时，开始进行细胞收获，并按照下述实验步骤或使用市售试剂盒提取DNA和RNA。

2）DNA 提取

1. 移除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤，并向培养皿中加入 500 μ裂解液（0.6% SDS，100 mM NaCl，50 mM Tris，20 mM EDTA 和 50 μg/mL RNase A
2. 在室温下轻轻摇动培养板20分钟。
3. 将细胞裂解液刮入微量离心管中，在37℃孵育 °C 过夜。
4. 加入蛋白酶K至终浓度为100 μg/mL，37℃孵育 °C 过夜。
5. 用等体积的酚-氯仿（pH 8）抽提DNA，重复一次，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提。
6. 用1/10体积的沉淀剂沉淀DNA^th 3 体积的 3 M NaCl 和 2.5 体积的 100% 乙醇
7. 冰上静置5分钟，然后在4℃下以13,000 rpm离心30分钟 °C.
8. 用70%乙醇洗涤DNA，室温晾干，然后重悬于200 μL中 μL 的 TE。
9. 65℃孵育 °在室温下放置2天，然后在4°C下孵育10分钟。
10. 4°C 保存 °C 或长期保存于 -20 °C.

3）RNA 提取

1. 移除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤，加入 1 mL TRIzol，在室温下孵育 10 分钟。
2. 刮取细胞，反复吹打几次，转移至微量离心管中并孵育 5 分钟。
3. 在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 10 分钟。
4. 将上清液转移至新的离心管中，加入 200 μL 氯仿。
5. 充分振荡后，在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 10 分钟。
6. 将水相转移至新的离心管中，加入等体积的 70% 乙醇。
7. 将溶液上样至 1 或 2 个（根据体积决定）RNeasy 柱中，在最大转速下离心 30 秒。
8. 此后按照 RNeasy 试剂盒（Qiagen）的说明书操作。

4) 核酸样品制备

1. 使用 NanoDrop 分光光度计（Thermo Scientific）定量 DNA 和 RNA 浓度。
2. 根据制造商说明书，使用随机十聚引物和 SuperScript III 逆转录酶（Invitrogen）从 500–1000 ng RNA 制备 cDNA。

5) PCR 与引物延伸实验

1. 为每个DNA标记设计两对PCR引物，一对用于基因组DNA扩增，另一对用于cDNA扩增（图2）。将用于cDNA扩增的正向和反向引物分别置于不同的外显子中，以避免基因组污染。设计引物时应使PCR产物长度在100–500 bp范围内。
2. 配制10 μL PCR反应体系，包含0.5 U Immolase Taq（Bioline）、0.8 mM dNTPs、2 mM MgCl₂、每种引物0.2 M，以及20 ng的cDNA或DNA模板。每个样本进行四次独立的PCR反应。
3. 在针对每对引物优化的条件下进行PCR扩增，保持循环次数处于扩增的线性阶段。
4. 通过在37 °C下用外切酶I和虾碱性磷酸酶（SAP）处理PCR产物20分钟，去除多余的PCR引物和dNTPs。
5. 将每个PCR产物在384孔板上点样两次，从而使每个样本可获得8次测量值。
6. 使用Assay Design（Sequenom）软件设计延伸引物，确保同一引物可用于基因组和cDNA的PCR产物。设定引物长度为14–18 bp，并指定延伸混合物包含3ddNTPs的组合（图2）。
7. 按照制造商说明书，使用MassARRAY系统（Sequenom）进行引物延伸反应及MALDI-TOF/MS分析。
8. 典型的引物延伸反应包括：94 °C预变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环为94 °C 5秒、52 °C 5秒、72 °C 5秒。
9. 使用SpectroCLEAN树脂纯化引物延伸产物，并通过SpectroPOINT纳升级点样仪将产物转移至微阵列芯片上。
10. 使用SpectroREADER质谱仪通过MALDI-TOF技术对延伸后的寡核苷酸进行定量分析。

6) 统计分析

1. 使用 MassARRAY Typer 软件检查 MALDI-TOF/MS 结果，评估实验的整体质量。
2. 提取包含峰面积数据的等位分型报告。
3. 对每个单独的质谱图，计算等位基因1与等位基因2的峰面积之比（峰面积比）。
4. 针对每个 cDNA 样本，利用 Excel 中相应的函数，基于8次测量结果计算峰面积比的平均值和标准差。
5. 对基因组 DNA 同样基于8次测量结果计算峰面积比的平均值。
6. 将 cDNA 的平均峰面积比除以基因组 DNA 的平均峰面积比，以评估相对于预期1:1比例的偏差。

7) 实验对照

1. 为排除实验假象，至少重复实验三次。
2. 在可行的情况下，设计针对其他DNA标记物的检测方法。
3. 设计多对PCR引物以及可与正链和反链均退火的延伸引物。
4. 在可行的情况下，使用对DNA标记物呈杂合但不携带与表型相关的DNA风险变异的细胞系作为阴性对照（图1和图3）

8）代表性结果

图3展示了等位基因特异性表达分析的一个示例，其中包括质谱图谱的实例。该图显示了在4种不同模板上进行的4个等位基因特异性引物延伸产物的分析结果。上方的图谱表示对两个不同细胞系的基因组DNA分析所得结果，这两个细胞系在转录的编码多态性位点上均为杂合子。然而，只有细胞系A在风险DNA变异位点上为杂合子（图1）。下方的图谱表示从相同细胞系获得的cDNA分析结果。由于实验过程中的技术偏差，即使在基因组DNA分析中，第一个峰也始终高于第二个峰。因此，使用基因组DNA分析的结果对cDNA数据进行标准化处理。标准化后，细胞系A的等位基因比例显著偏离1（其中第二个峰相较于其他图谱更低），而细胞系B的等位基因比例则非常接近于1。这些数据表明，细胞系A携带一个与第二个峰所检测等位基因处于相同相位的DNA变异，该变异降低了被分析基因的表达水平。细胞系B则提供了一个非常理想的阴性对照。

图1. 细胞系筛选策略。 细胞系A和B在转录编码标记（三角形）上均为杂合状态，但只有细胞系A在风险DNA变异位点（圆形）上为杂合状态。风险变异的蓝色等位基因与较低水平的转录相关（可能是由于其本身具有直接效应，或因其与实际的功能性变异位点紧密连锁）。

图 2. 等位基因特异性引物延伸检测。 本图展示了以 cDNA（左侧）和基因组 DNA（右侧）为模板进行实验的操作流程。PCR 引物（灰色矩形）设计用于扩增一个杂合编码多态性位点（三角形）。为避免基因组污染，当以 cDNA 模板进行扩增时，PCR 引物结合于不同外显子的序列（浅蓝色条带）。PCR 产物随后作为模板用于引物延伸反应，延伸引物结合于多态性位点相邻的一个碱基位置，并加入适当的三种双脱氧核苷酸（ddNTPs）终止子（方块）和一种脱氧核苷酸（圆形），分别使引物延伸一个或两个碱基。所产生的引物延伸产物具有不同的质荷比，可通过 MALDI-TOF 质谱技术进行分离和定量。对应于 DNA 标记蓝色等位基因的产物量相对低于红色等位基因。

图3. 等位基因特异性表达检测结果。 该图显示了对细胞系A和细胞系B（图1）的基因组DNA和cDNA进行分析所获得的质谱结果。

讨论

该方法通过评估疾病相关DNA变异对基因表达的影响，实现对其功能效应的分析 体内 转录水平的等位基因特异性差异。本方案中，通过MALDI-TOF测定相对转录丰度，但也可采用其他可实现等位基因特异性定量的技术，如TaqMan。^6,7可以使用。该方法的主要局限性在于转录编码标记的可获得性。已有研究描述了基于此处所述原理但利用不同类别多态性的方法。haploChip检测通过使用位于基因转录起始位点或终止位点1 kb范围内的标记，来测量等位基因特异性表达，这些标记存在于利用RNA聚合酶II特异性抗体富集的染色质免疫沉淀材料中。⁸或者，当模板为异核RNA时，可使用内含子中的SNP⁹.

本文所述的特定实验方案结合单倍型芯片（haploChip）检测，已成功用于鉴定出一个与阅读障碍（或称读写能力障碍）相关的候选基因。最初，一项遗传关联研究发现了一段与阅读障碍相关的DNA序列，该序列跨越了三个基因¹⁰。等位基因特异性基因表达检测显示，在存在与阅读障碍相关的DNA变异的情况下，仅在这三个基因中的一个基因中观察到表达水平的变化，而其余两个基因则未见表达差异¹¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Sigma-Aldrich	P-4417-100TAB
SDS	Bio-Rad	161-0416
NaCl	VWR international	27788.366
Tris	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
RNase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308-500MG
苯酚:氯仿	Sigma-Aldrich	77617
氯仿	VWR international	100777C
乙醇	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
Trizol	Invitrogen	15596-018
RNeasy 试剂盒	Qiagen	74104
SuperScript III 逆转录酶	Invitrogen	18080-044
Immolase Taq	Bioline	BIO-21048
dNTP	Sigma-Aldrich	DNTP100A
外切酶1	New England Biolabs	M0293S
虾碱性磷酸酶	GE Healthcare	E70092Z
SpectroCLEAN 树脂	Sequenom	10053
MassEXTEND ddNTP/dNTP 混合物	Sequenom		根据实验设计而定
MassEXTEND 热测序酶	Sequenom	10052
仪器
预冷微量离心机	Eppendorf
NanoDrop 分光光度计	Thermo Fisher Scientific, Inc.
SpectroPOINT 纳升级点样仪	Sequenom
SpectroREADER 质谱仪	Sequenom