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一种等位基因特异性基因表达检测法，用于验证遗传关联的功能基础

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DOI：

10.3791/2279

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2010年11月3日

 ,  , 
1Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford

本文内容

摘要

表型相关的遗传关联通常在功能层面上仍不明确。本方法旨在通过分析对转录的SNP呈杂合状态的细胞，评估表型相关遗传标记对基因表达的影响。该技术利用MALDI-TOF质谱法精确测量等位基因特异性的引物延伸产物，实现定量分析。

摘要

与常见复杂性状显著相关的遗传位点数量正在持续增加。然而，大多数这些关联在分子水平上尚未被阐明。DNA变异影响表型的机制之一是基因表达，研究表明基因表达对复杂性状尤其重要1。

该方法在细胞环境中检测特定DNA序列对基因表达的影响。其原理是通过分析携带一种与疾病相关的DNA序列（即风险变异）拷贝的细胞，来测量来自某个基因两个等位基因的转录本的相对丰度2,3。因此，本方法所用的细胞必须满足两个基本的基因型要求：细胞在DNA风险变异位点和DNA标记位点上均需为杂合状态，其中DNA标记通常是能够区分转录本染色体来源的编码多态性位点（图1）。DNA风险变异与DNA标记的等位基因频率无需相同，但必须明确这些遗传标记之间的相位（单倍型）关系。此外，选择表达目标基因的细胞类型也至关重要。本实验方案具体描述了从成纤维细胞中提取核酸的操作步骤，但该方法同样适用于其他类型的细胞，包括原代细胞。

从选定的细胞系中提取DNA和RNA，并合成cDNA。利用设计用于靶向编码DNA标记物的引物延伸检测方法对DNA和cDNA进行分析4。引物延伸检测根据制造商的说明，使用MassARRAY（Sequenom）5平台进行。随后，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）分析引物延伸产物。由于所选标记物为杂合状态，因此在质谱图谱中将产生两个峰。每个峰的峰面积与转录本的丰度成正比，可利用MassARRAY Typer软件中的功能进行测量，从而计算等位基因比例（等位基因1 : 等位基因2）。将cDNA获得的等位基因比例通过基因组DNA测得的等位基因比例进行标准化，后者预期为1:1，以校正技术性偏差。标准化后等位基因比例显著偏离1:1的标记表明，在同一细胞中来自两条染色体的转录本数量存在差异，提示与表型相关的DNA变异可能影响了基因表达。应使用实验对照来验证结果。

方案

1）细胞培养

  1. 选择表达目的基因的细胞类型。
  2. 选择在目的基因内对DNA风险变异位点和转录编码多态性均为杂合状态的细胞系（图1）。
  3. 根据供应商的说明培养所选细胞系，并准备2个10 cm的培养皿，分别用于DNA和RNA的提取。
  4. 当细胞达到80%融合度时，开始进行细胞收获，并按照下述实验步骤或使用市售试剂盒提取DNA和RNA。

2) DNA 提取

  1. 移除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤，并向培养皿中加入 500 μL 裂解液（0.6% SDS，100 mM NaCl，50 mM Tris，20 mM EDTA）的 50 μg/mL RNase A
  2. 在室温下轻轻摇动培养板20分钟。
  3. 将细胞裂解物刮入微量离心管中，于指定条件下孵育 37 °C 过夜。
  4. 加入蛋白酶K至终浓度为 100 μg/mL 并在指定条件下孵育 37 °C 过夜。
  5. 用等体积的酚-氯仿（pH 8）抽提DNA，重复一次，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提。
  6. 用1/10体积的沉淀剂沉淀DNAth 3 体积的 3 M NaCl 和 2.5 体积的 100% 乙醇
  7. 冰上静置5分钟，然后在4℃下以13,000 rpm离心30分钟 4 °C.
  8. 用70%乙醇洗涤DNA，室温晾干，然后重悬于 200 μL TE的
  9. 孵育于 65 °C 10分钟，然后在室温下放置2天。
  10. 储存于 4 °C 或长期保存于 -20 °C.

3) RNA 提取

  1. 移除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤，加入 1 mL TRIzol，在室温下孵育 10 分钟。
  2. 刮取细胞，反复吹打几次，转移至微量离心管中并孵育 5 分钟。
  3. 在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 10 分钟。
  4. 将上清液转移至新的离心管中，加入 200 μL 氯仿。
  5. 充分振荡后，在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 10 分钟。
  6. 将水相转移至新的离心管中，加入等体积的 70% 乙醇。
  7. 将溶液上样至 1 或 2 个 RNeasy 柱（根据体积决定），在最大转速下离心 30 秒。
  8. 此后按照 RNeasy 试剂盒（Qiagen）的说明书操作。

4) 核酸样品制备

  1. 使用 NanoDrop 分光光度计（Thermo Scientific）测定 DNA 和 RNA 的浓度。
  2. 根据制造商说明书，使用随机十聚引物和 SuperScript III 逆转录酶（Invitrogen）从 500–1000 ng RNA 制备 cDNA。

5) PCR 与引物延伸实验

  1. 为每个DNA标记设计两对PCR引物，一对用于基因组DNA扩增，另一对用于cDNA扩增（图2）。将用于cDNA扩增的正向引物和反向引物分别置于不同的外显子中，以避免基因组污染。设计引物时应确保PCR产物长度在100–500 bp范围内。
  2. 配制10 μL PCR反应体系，包含0.5 U Immolase Taq（Bioline）、0.8 mM dNTPs、2 mM MgCl2、每种引物0.2 M，以及20 ng的cDNA或DNA模板。每个样本进行四次独立的PCR反应。
  3. 在针对每对引物优化的条件下进行PCR扩增，并控制循环次数处于扩增的线性阶段。
  4. 通过在37 °C下用外切酶I和虾碱性磷酸酶（SAP）处理PCR产物20分钟，去除多余的PCR引物和dNTPs。
  5. 将每个PCR产物在384孔板上点样两次，从而使每个样本可获得8次测量值。
  6. 使用Assay Design（Sequenom）软件设计延伸引物，确保同一引物可用于基因组和cDNA的PCR产物。设定引物长度为14–18 bp，并指定延伸反应混合物中包含3ddNTPs的组合（图2）。
  7. 按照制造商说明书，使用MassARRAY系统（Sequenom）进行引物延伸反应及MALDI-TOF/MS分析。
  8. 典型的引物延伸反应程序包括：94 °C预变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环为94 °C 5秒、52 °C 5秒、72 °C 5秒。
  9. 使用SpectroCLEAN树脂纯化引物延伸产物，并通过SpectroPOINT纳升级点样仪将产物转移至微阵列芯片上。
  10. 使用SpectroREADER质谱仪通过MALDI-TOF技术对延伸后的寡核苷酸进行定量分析。

6) 统计分析

  1. 使用 MassARRAY Typer 软件检查 MALDI-TOF/MS 结果，评估实验的整体质量。
  2. 提取包含峰面积数据的等位分型报告。
  3. 对每个单独的质谱图，计算等位基因1与等位基因2的峰面积之比（峰面积比）。
  4. 针对每个 cDNA 样本，在 Excel 中使用相应函数，基于8次测量结果计算峰面积比的平均值和标准差。
  5. 对基因组 DNA 同样基于8次测量结果计算峰面积比的平均值。
  6. 将 cDNA 的平均峰面积比除以基因组 DNA 的平均峰面积比，以评估其相对于预期1:1比例的偏离程度。

7) 实验对照

  1. 为排除实验假象，至少重复实验三次。
  2. 尽可能设计针对其他DNA标记物的检测方法。
  3. 设计多对PCR引物以及可与正链和反链结合的延伸引物。
  4. 尽可能使用对DNA标记物呈杂合但不携带与表型相关DNA风险变异的细胞系作为阴性对照（图1和图3）。

8) 代表性结果

图3展示了等位基因特异性表达分析的一个示例，并附有质谱图谱的实例。该图显示了在4种不同模板上进行的4个等位基因特异性引物延伸产物的分析结果。上方的图谱表示对两个不同细胞系的基因组DNA分析所得结果，这两个细胞系在转录的编码多态性位点上均为杂合子。然而，只有细胞系A在风险DNA变异位点上为杂合子（图1）。下方的图谱表示从相同细胞系获得的cDNA分析结果。由于实验过程中的技术偏差，即使在基因组DNA分析中，第一个峰也始终高于第二个峰。因此，利用基因组DNA分析的结果对cDNA数据进行标准化处理。标准化后，细胞系A的等位基因比例显著偏离1（其中第二个峰相较于其他图谱明显偏低），而细胞系B的等位基因比例则非常接近于1。该数据表明，细胞系A携带一个与第二个峰所检测等位基因处于相同相位的DNA变异，该变异降低了被分析基因的表达水平。细胞系B则提供了一个非常理想的阴性对照。

染色体图谱；杂合性比较；细胞系A和B；风险变异；编码标记。
图1. 细胞系筛选策略。 细胞系A和B在转录的编码标记（三角形）上均为杂合状态，但仅细胞系A在风险DNA变异（圆形）上呈杂合。风险变异的蓝色等位基因与较低水平的转录相关（可能是由于其本身具有直接效应，或因其与实际的功能性变异紧密连锁）。

PCR流程示意图，展示引物延伸至MALDI-TOF/MS分析用于DNA分型。
图2. 等位基因特异性引物延伸检测。 本图展示了针对cDNA（左侧）和基因组DNA（右侧）模板所进行实验流程的工作流程。PCR引物（灰色矩形）设计用于扩增一个杂合编码多态性位点（三角形）。为避免基因组污染，当以cDNA为模板进行扩增时，PCR引物结合于不同外显子中的序列（浅蓝色条带）。PCR产物随后作为模板用于引物延伸反应，该反应使用一条延伸引物，其结合于多态性位点相邻的一个碱基处，并加入适当的三种双脱氧核苷酸（ddNTPs）终止子（方块）和一种脱氧核苷酸（圆形），分别使引物延伸一个或两个碱基。所产生的引物延伸产物具有不同的质荷比，可通过MALDI-TOF质谱技术进行分离与定量。对应于DNA标记蓝色等位基因的产物量相对低于红色等位基因。

细胞系中等位基因比例的基因组与cDNA比较图；包含统计分析。
图3. 等位基因特异性表达检测结果。 该图显示了对细胞系A和细胞系B（图1）的基因组DNA及cDNA进行分析所获得的质谱结果。

讨论

该方法通过评估疾病相关DNA变异对基因表达的影响，实现对其功能效应的分析 体内 转录水平的等位基因特异性差异。本方案中，通过MALDI-TOF测定相对转录丰度，但也可采用其他可实现等位基因特异性定量的技术，如TaqMan。6,7可以使用。该方法的主要局限性在于转录编码标记的可获得性。已有研究描述了基于此处所述原理但利用不同类别多态性的方法。haploChip检测通过使用位于基因转录起始位点或终止位点1 kb范围内的标记，来测量等位基因特异性表达，这些标记存在于利用RNA聚合酶II特异性抗体富集的染色质免疫沉淀材料中。8或者，当模板为异核RNA时，可使用内含子中的SNP9.

本文所述的特定实验方案结合单倍型芯片（haploChip）检测，已成功用于鉴定出一个与阅读障碍（或称读写能力障碍）相关的候选基因。最初，一项遗传关联研究发现了一段与阅读障碍相关的DNA序列，该序列跨越了三个基因10。等位基因特异性基因表达检测显示，在存在与阅读障碍相关的DNA变异的情况下，仅在这三个基因中的一个基因中观察到表达水平的变化，而其余两个基因则未见表达差异11。

致谢

本工作由惠康信托基金（Wellcome Trust）资助，资助编号分别为 A.P.M. [076566/Z/05/Z]、J.C.K. [074318]，以及惠康信托人类遗传学中心的核心资助 [075491/Z/04]。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBSSigma-AldrichP-4417-100TAB
SDSBio-Rad161-0416
NaClVWR international27788.366
TrisSigma-AldrichT1503-1KG
EDTASigma-AldrichE5134-500G
RNase AQiagen19101
Proteinase KSigma-AldrichP2308-500MG
苯酚:氯仿Sigma-Aldrich77617
氯仿VWR international100777C
乙醇Sigma-Aldrich32221-2.5L
TrizolInvitrogen15596-018
RNeasy 试剂盒Qiagen74104
SuperScript III 逆转录酶Invitrogen18080-044
Immolase TaqBiolineBIO-21048
dNTPSigma-AldrichDNTP100A
外切酶1New England BiolabsM0293S
虾碱性磷酸酶GE HealthcareE70092Z
SpectroCLEAN 树脂Sequenom10053
MassEXTEND ddNTP/dNTP 混合物Sequenom根据实验设计而定
MassEXTEND 热测序酶Sequenom10052
仪器
预冷微量离心机Eppendorf
NanoDrop 分光光度计Thermo Fisher Scientific, Inc.
SpectroPOINT 纳升级点样仪Sequenom
SpectroREADER 质谱仪Sequenom

参考文献

  1. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
  2. Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
  3. Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
  4. Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
  5. Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
  6. Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
  7. Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
  8. Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
  9. Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
  10. Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
  11. Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).

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