蜜蜂（Apis mellifera）喙伸展反应经典条件反射中的行为药理学研究

摘要

我们展示了如何通过系统性给药的方式，在蜜蜂（Apis mellifera）的趋性嗅觉条件化范式中实施行为药理学方法。该方法能够以简单且可靠的方式研究学习与记忆形成的潜在机制。

摘要

蜜蜂（Apis mellifera）以其出色的交流能力、定向能力和强大的学习能力而闻名^1,2。由于蜂群的生存依赖于对食物资源的利用，采集蜂会学习并记忆不同花朵的位置及其回报价值。在自然环境中，采集蜂可在觅食点被轻松训练，学习与食物相关的信号，如气味或颜色。此外，在实验室条件下，通过训练个体束缚的蜜蜂产生喙伸展反应（proboscis extension response, PER），也可研究其趋利性关联学习^3,4。该学习范式能够以简单且高度可靠的方式，研究学习与记忆形成背后的神经元和分子机制^5-12。行为药理学方法常用于研究分子机制，通过系统注射药物，在学习和记忆形成过程中或之后干扰特定分子的功能^13-16。

本文展示了如何利用束缚法对蜜蜂进行PER条件化训练，以及如何通过向蜜蜂飞行肌注射药物实现全身给药。

方案

1. 从蜂巢中捕捉蜜蜂

1. 实验开始前一日下午2至4点之间，捕捉离开蜂巢的蜜蜂。操作时，将一个可透过紫外线的透明聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）金字塔形装置（高 = 30 cm，顶端 3.5 × 3.5 cm，底面 18 × 18 cm），底端开口、顶端封闭，置于蜂巢入口前方20–30 cm处，底面朝向蜂巢入口，使离开蜂巢的蜜蜂进入金字塔底部。随后关闭底端，将捕获的蜜蜂带回实验室进行后续处理。

2. 将蜜蜂从金字塔装置转移至玻璃小瓶中

1. 在实验室中，将金字塔形装置底面朝下放置。用毛巾等物品遮盖金字塔的侧壁使其变暗，但顶端保持暴露。由于蜜蜂具有正趋光性，当打开顶端时，蜜蜂会从顶端离开金字塔。通过将玻璃小瓶置于打开的顶端上方，可逐只将蜜蜂转移至小瓶中。每只蜜蜂使用一个独立的小瓶，因此当一只蜜蜂进入小瓶后，应立即关闭顶端。

3. 利用试管饲养蜜蜂

1. 将蜜蜂置于冰上冷却 2.5–3.5 分钟，使其在玻璃小瓶中 immobilized。建议观察蜜蜂状态，一旦其停止活动，立即从冰上取出。
2. 将一只 immobilized 的蜜蜂用胶带固定在小型塑料管中，使其能够自由移动喙，但头部、胸部和腿部不能移动。注意不要压迫其颈部。
3. 每只固定在塑料管中的蜜蜂均放入支架上的编号孔洞中，以便于操作和识别。在取出进行条件化训练或记忆提取后，塑料管必须放回原先的同一孔洞中。

4. 喂食蜜蜂

1. 在第一天傍晚（16:00–18:00）捕获蜜蜂后，用蔗糖溶液（0.88 M，将精制白砂糖溶解于自来水制得）饲喂至饱足。饲喂时，用蔗糖溶液触碰蜜蜂触角以诱发其 proboscis extension response（PER，喙伸展反应），随后让蜜蜂摄取一滴蔗糖溶液（4 μL）。需逐只反复饲喂蜜蜂，直至其触角接触蔗糖溶液时不再迅速且稳定地表现出 PER 为止。
2. 在实验期间的每个后续傍晚（16:00–18:00），蜜蜂需逐只饲喂四次，每次一滴蔗糖溶液（4 μL，0.88 M，将精制白砂糖溶解于自来水制得）。饲喂过程中应避免将蔗糖溶液涂抹在蜜蜂触角或喙部，且确保移液管未被蔗糖溶液污染。饲喂不应在训练地点或其附近进行，以避免蜜蜂将训练环境与蔗糖刺激建立关联。

5. 过夜保持束缚的蜜蜂

1. 将蜜蜂置于塑料碗中，在室温下饲养过夜。向碗中加入自来水（水位约0.5–1 cm高）。利用ELISA板作为平台，将装有束缚蜜蜂的架子置于水面以上。最后，用纸板盖住塑料碗。

6. 嗅觉条件反射

在实验的第一天上午（10点）进行嗅觉条件化训练。条件刺激（CS）为一种气味，非条件刺激（US）为蔗糖溶液。

1. 用移液器吸取4 μL气味物质（例如丁香油），滴加到一张圆形滤纸上（直径1.3 cm），然后将滤纸放入一支20 mL注射器中。操作应在通风橱内进行，并使用滤芯吸头以防止移液器被污染。
2. 将固定好蜜蜂的支架在训练开始前30分钟放置于训练区域附近，但需与单只蜜蜂接受训练时所处的排气管前方位置保持一定距离。
3. 训练包括三次气味（条件刺激，CS）与蔗糖溶液（非条件刺激，US，1.25 M）的配对，每次配对之间的间隔（ITI）为10分钟。通过音频播放器向实验者提供声音信号，以确保刺激开始、结束、持续时间及操作步骤的精确计时。每次学习试验开始时，先将蜜蜂置于排气管前10秒；在10秒即将结束前，将装有气味的注射器置于蜜蜂触角前方3 cm处。随后通过推动20 mL空气使气味持续释放5秒。在气味释放开始后的第3秒，用蘸有蔗糖溶液的牙签轻触蜜蜂双侧触角的远端鞭节，并让蜜蜂舔舐湿润的牙签4秒。条件刺激（CS）结束后13秒，将蜜蜂从训练环境中取出并放回支架。整个训练过程持续28秒。
   训练过程中需注意，蜜蜂的触角或喙部不得沾有蔗糖残留。因此必须确保牙签仅被蔗糖溶液润湿，而不能在其上形成蔗糖液滴。
4. 训练结束后，将支架重新放回容器中。
5. 实验过程中，实验者需观察并记录蜜蜂的行为，即在放置过程中以及CS和US呈现期间是否出现伸吻反应（PER）。

7. 记忆保持

1. 可在任意时间间隔（分钟至天）进行保留测试。在记忆测试开始前 30 分钟，将装有蜜蜂的架子放置在训练地点附近。
2. 记忆测试包括 5 秒的条件刺激（CS）呈现，不伴随非条件刺激（US）呈现。测试开始时，先将蜜蜂置于通风口前方 10 秒，随后按上述方法呈现 5 秒气味。在放置期间及条件刺激呈现期间，记录蜜蜂的行为，即是否出现喙伸展反应（PER）。
3. 实验结束时，再次用蔗糖溶液触碰蜜蜂的触角以诱发喙伸展反应，确保蜜蜂仍具备伸展喙的能力。

8. 全身注射

全身注射的时间点取决于实验设计。

1. 使用一次性皮下注射针（21 G）在盾片后部靠近飞行肌上方盾缝的角质层处打一个小孔¹⁷。
2. 通过角质层上的小孔，用玻璃毛细管将1 μL溶液注入飞行肌内。经过训练的实验人员每30秒可注射一只蜜蜂，从而实现对注射和条件化时间的精确控制。

9. 实验期间喂养蜜蜂

1. 在训练后的傍晚（16:00–18:00），将蜜蜂逐一喂食蔗糖溶液（4 μL，0.88 M，用自来水溶解的精制白砂糖），共喂食四次。喂食过程中需注意避免将蔗糖溶液沾染到蜜蜂的触角或喙部，同时确保移液管不被蔗糖溶液污染。喂食不应在训练地点或其附近进行，以避免蜜蜂将训练环境与蔗糖刺激建立关联。

10. 数据收集与数据分析

1. 实验过程中监测蜜蜂是否出现 proboscis 延伸反应。若蜜蜂在条件刺激（CS）开始后至非条件刺激（US）呈现前（训练阶段）或仅在条件刺激（CS）呈现期间（测试阶段）伸展出其 proboscis，并越过上下颚之间的虚拟线，则记为阳性反应。
2. 纳入分析的个体需满足两个条件：必须在整个实验过程中存活，并且在实验结束时对蔗糖溶液表现出非条件性的 proboscis 延伸反应（PER）。针对每次条件刺激（CS）的呈现，分别绘制在习得和保持测试中表现出 PER 的蜜蜂百分比。

11. 代表性结果：

本文展示了两个实验。

在第一个实验中，我们观察了磷酸盐缓冲盐水（PBS；单位为 mM：137 NaCl，2.7 KCl，10.1 Na₂HPO₄, 1,8 KH₂PO₄，pH 7.2）对学习和长期记忆形成的影响。将蜜蜂分为三组，每组进行三次条件刺激-非条件刺激（CS-US）配对训练，组间间隔为10分钟：未处理组、注射了1的组 μL PBS 30分钟，另设假注射组，其处理方式与PBS注射组相同但不注射PBS。训练后24小时，对所有三组动物均通过一次条件刺激（CS）呈现来测试记忆。在三次训练试验中，表现出条件反应的动物比例显著上升（图1，针对时间因素的重复测量方差分析F值_2,378=340,456, p < 0.05）。在条件化过程中，三组之间的PER未观察到差异（重复测量方差分析的组间因素F2, 189 = 1.299，p > 0.05）。在24小时保留测试中这一结果同样成立（F2, 187 = 0.752, p>0.05）时，未处理动物与PBS注射动物及假手术注射动物相比。

在第二个实验中，我们证明了在训练后30分钟系统注射蛋白质合成抑制剂茴香霉素（10 mM）可抑制训练后第三天和第四天的记忆保持。在记忆保持测试中，与注射PBS的对照组相比，注射茴香霉素的实验组表现出显著差异（图2，重复测量方差分析显示组间效应F1, 94=8.86，p < 0.05）。在第3天和第4天的记忆测试中均可观察到明显差异。该结果与Wüstenberg et al.¹⁸的研究结果相似，后者同样采用三次条件刺激-非条件刺激配对对蜜蜂进行条件化训练，但实验方案有所不同。

图1. 表皮损伤或注射PBS不影响习得和记忆保持。 动物接受三次条件刺激-非条件刺激配对训练（习得）。24小时后测试记忆保持情况（记忆保持）。在训练前30分钟，对两组动物进行表皮穿孔处理（损伤组、PBS组），其中一组注射1 μL PBS（PBS组）。第三组动物不做任何处理（无处理组）。图中显示各组动物在气味刺激下发生伸吻反应（PER）的百分比。方差分析（ANOVA）结果显示，各组在习得阶段（F2, 189 = 1.299, p > 0.05）和记忆保持阶段（F2, 187 = 0.752, p>0.05）均无显著差异。

图2. 在最后一次条件刺激-非条件刺激配对后40分钟注射茴香霉素，可降低训练后第三天和第四天的记忆保持水平。 动物接受三次条件刺激-非条件刺激配对训练（习得阶段），并在首次训练试验后1小时注射1 μL 10 mM茴香霉素（Aniso）或1 μL PBS。分别在24小时、48小时、72小时和96小时后检测记忆保持情况（记忆保持测试）。图中显示的是每组动物在气味刺激下表现出伸吻反应（PER）的百分比。方差分析（ANOVA）结果显示，训练后72小时和96小时，注射茴香霉素显著降低了记忆保持水平（F1, 94=8.86, p < 0.05）。

讨论

1. 捕捉蜜蜂：为采集有经验的采集蜂，可在早晨或下午进行捕捉，避免在幼蜂进行定向飞行的时段操作¹⁹。采集蜂分为采集花粉和采集花蜜两类。根据其对糖的敏感性及学习能力的不同，已观察到花粉采集蜂与花蜜采集蜂之间存在差异²⁰。为仅捕捉花蜜采集蜂，可在蜂巢附近设置装有蔗糖溶液的人工食物源，并在该处收集蜜蜂。返回蜂巢的花粉采集蜂可通过其后足上的花粉篮加以识别²⁰。
2. 固定与操作：应避免将蜜蜂长时间置于冰上冷却，因其可能影响蜜蜂的学习能力及实验结束前的存活率。将蜜蜂足部固定于管内时需小心操作，以防足部意外接触蔗糖溶液而产生刺激。这一点至关重要，因为已有研究表明，蜜蜂可通过足部接触蔗糖溶液而形成学习记忆^3,21。
3. 嗅觉条件化训练：条件化训练的次数、试验间间隔以及测试时间点可根据研究重点进行调整^3,22。
4. 饲喂：已知蜜蜂的饱食程度会影响其学习表现和记忆保持能力^3,23，因此在实验设计时必须考虑这一因素。
5. 注射：蜜蜂胸部存在气囊¹⁷，这些结构是呼吸系统的重要组成部分，对生存至关重要。因此在注射过程中应小心避免损伤气囊。若出现气泡释放，则提示气囊已受损。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20 毫升 Omnifix 注射器	B. Braun Medical	4616200 V
精制白砂糖（家用）	Kaisers 超市，德国柏林
丁香油	Bombastus，德国弗赖塔尔
Multipette plus 移液器	Eppendorf	4981 000.019
30 孔蜜蜂管架	自制
塑料管	自制
透紫外光的亚克力金字塔	自制		高 = 30 厘米，顶部 3.5 × 3.5 厘米，底部 18 × 18 厘米
胶带	Tesa，德国汉堡
Capillator 加样棒 1-5μl	Selzer
Capillator 吸头 1-5μl	Selzer
滤纸，厚度 0.16–0.2 毫米	Macherey-Nagel	MN 616 或 MN615	裁剪为直径 1.3 厘米的圆形片
一次性皮下注射针头	B. Braun Medical	4657683	直径 0.45 毫米