分子的三维结构能够提供其功能机制的独特理解。在接近原子分辨率下测定结构的主要方法是X射线晶体学。本文中，我们将演示当前获得适用于X射线晶体学结构解析的任意大分子三维晶体的方法。
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本文内容
摘要
摘要
利用生物大分子的三维结构推断其功能是现代生物学最重要的研究领域之一。原子分辨率结构的获得为理解蛋白质功能提供了深刻而独特的视角，并有助于揭示活细胞内部的运作机制。迄今为止，蛋白质数据库（rcsb-PDB）中86%的条目是通过X射线晶体学方法测定的大分子结构。
为了获得适合晶体学研究的晶体，大分子（例如蛋白质、核酸、蛋白质-蛋白质复合物或蛋白质-核酸复合物）必须被纯化至均一，或尽可能接近均一。样品的均一性是获得高分辨率衍射晶体的关键因素（Bergfors, 1999；McPherson, 1999）。
结晶需要使大分子达到过饱和状态。因此，应将样品浓缩至尽可能高的浓度，同时避免引起大分子的聚集或沉淀（通常为 2–50 mg/mL）。将样品引入沉淀剂可促进溶液中蛋白质晶体的成核，从而可能从溶液中生长出大的三维晶体。获得晶体主要有两种技术：蒸气扩散法和批量结晶法。在蒸气扩散法中，含有沉淀剂与蛋白质溶液混合液的液滴被密封在一个含有纯沉淀剂的腔室内。水蒸气随后从液滴中扩散出来，直到液滴与沉淀剂的渗透压相等（图 1A）。液滴脱水导致蛋白质和沉淀剂缓慢浓缩，直至达到相图中理想的晶体成核区。批量法则是通过将蛋白质与适量的沉淀剂混合，直接使蛋白质进入成核区（图 1B）。该方法通常在石蜡油/矿物油混合物下进行，以防止液滴中的水扩散出去。
本文将演示两种用于蒸汽扩散法的实验装置，即悬滴法和坐滴法，此外还包括油下批量结晶法。
方案
材料：
- 蛋白样品 - 溶菌酶（50 mg/mL）
- 悬滴法24孔板
- 坐滴法24孔板
- 微批量结晶96孔板
- 结晶溶液（ commercially available 或自制）
- 硅脂
- 5 mL 注射器（无鲁尔锁）
- 硅化盖玻片
- 光学密封膜
- 石蜡
- 0.1–2 μL 微量移液器（低吸附枪头）
- 镊子
- 专业擦拭纸
1. 悬滴/坐滴法操作步骤：
- 初步筛选时，可使用市售的试剂盒，这些试剂盒采用稀疏矩阵不完全因子法来设置试验条件。该稀疏矩阵不完全因子法基于已知的大分子结晶条件进行设计和选择（Carter 和 Carter，1979；Cudney et al.，1994；Jancarik 和 Kim，1991；Jancarik et al.，1991）。如果已知结晶条件，可构建一个范围较窄的筛选体系，在初始有效条件附近调整沉淀剂浓度和 pH 值。最常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG），其次是硫酸铵。这两种沉淀剂合计占所有记录在案的大分子结晶沉淀剂使用情况的约 60%（Gilliland et al.，1994；Kimber et al.，2003；Page e....
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结果
结晶通常被认为是X射线晶体学的瓶颈。通过采用沉淀条件的稀疏矩阵不完全因子筛选，通常会产生多种不同类型的蛋白质聚集和沉淀现象，其中包括大尺寸的单晶。如果蛋白质或沉淀剂的浓度过高，则会观察到无固定形状和大小的棕色物质（非晶态沉淀）。当溶液处于不饱和状态时，液滴通常完全透明，且不出现任何形式的沉淀。图3展示了多种沉淀现象与晶体的示例（Dessau et al., 2006）。更多沉淀现象及其详细解读可参见 http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html。
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讨论
本文中，我们描述并演示了蛋白质结晶的一般现行实验方案。由于该过程包含多个步骤，因此有一些注意事项需要特别关注。在处理极小体积（0.5–2 μL）液体时，液滴因蒸发而干燥是一个主要问题。因此，建议在环境条件严格控制的环境中操作（低气流、高湿度、温度稳定），并采用尽量减少液滴暴露于空气中的技术。基于这一原因，在井然有序的工作环境中操作至关重要。所有试剂应在设置实验板之前预先准备好，实验设备应触手可及（移液器、枪头、离心管、擦拭纸等）。
通常情况下，应在准备设置实验板前尽可能短的时间内将蛋白质从储存环境中取出。这样可以尽量减少环境因素对样品的影响。操作时必须握住蛋白管的管颈部分，而不是管底含有蛋白质的区域，以避免手温导致样品受热。采取上述预防措施，可最大限度地减小实验误差，从而提高实验结果的可重复性。
此处描述的实验方案有许多可能的修改方式。可以调整蛋白质浓度、蛋白质与沉淀剂的比例、温度（4°C - 37°C）、pH值，并可添加各种添加剂。另一种相对常用的蛋白质结晶方法是透析法。在此方法中，蛋白质溶液通过半透膜对沉淀剂溶液进行透析。.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了授予YM的伯纳姆惠康研究员奖以及授予MD的耶鲁大学布朗-考克斯博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 溶菌酶 | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24孔VDX板 | Hampton research | HR3-142 | |
| 24孔Cryschem板 | Hampton research | HR3-158 | |
| 道康宁真空润滑脂 | Hampton research | HR3-510 | |
| 硅化玻璃圆形盖玻片 | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% 石蜡油 | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88英寸宽Crystal Clear封板膜 | Hampton research | HR3-511 | |
| 96孔Imp@ct板（微批量板） | Hampton research | HR3-098 |
参考文献
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254....
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