稳定同位素示踪分析在发育期与成年期中间代谢流中的应用 秀丽隐杆线虫

摘要

本文描述了通过气相色谱-质谱联用技术对线虫Caenorhabditis elegans的中间代谢流进行稳定同位素示踪分析的方法。详细介绍了在琼脂平板上发育阶段或液体培养中成虫阶段暴露于同位素后，测定二氧化碳、有机酸和氨基酸中同位素富集度的技术流程。

摘要

稳定同位素示踪技术长期以来被用于灵敏地研究基因突变和/或药物治疗在细胞及哺乳动物模型中的代谢效应。本文详细描述了在线虫Caenorhabditis elegans中进行中间代谢和代谢通量稳定同位素示踪分析的具体方法。所述方法可用于分析整个线虫体内的游离氨基酸、标记的二氧化碳、标记的有机酸以及标记的氨基酸，这些线虫在从早期发育阶段起即暴露于含有稳定同位素的线虫生长培养基琼脂平板上，或在液体培养中从年轻成虫阶段开始接受不同药物处理。通过高效液相色谱法（HPLC）对用4%高氯酸提取的全虫样品中的游离氨基酸进行定量分析。采用全标记的¹³C-葡萄糖或1,6-¹³C₂-葡萄糖作为稳定同位素前体，利用质谱法追踪其标记碳在二氧化碳（包括气态和溶解态）以及在糖酵解、丙酮酸代谢和三羧酸循环通量相关代谢物中的分布情况。文中提供了代表性结果，以展示同位素暴露时间、不同细菌清除方案以及野生型线虫中不同线虫破碎方法的影响，同时比较了线粒体复合体III突变线虫（isp-1(qm150)）与野生型线虫之间同位素掺入程度的差异。在活体线虫中应用稳定同位素示踪分析，为在整体动物水平上实时研究由单个遗传疾病和/或药物治疗引起的代谢改变提供了新的手段。

方案

方案A：中间代谢过程中稳定同位素示踪分析 秀丽隐杆线虫 在NGM平板上培养。

*注意：在早期发育阶段或成虫早期开始同位素暴露（使用全标记的¹³C葡萄糖或1,6-¹³C₂-葡萄糖）后，可在年轻成年线虫群体中成功测定稳定同位素富集。本方案可在标准线虫生长培养基（NGM）平板上同时监测动物健康、发育和生长情况，而这一点在液体培养中较难实现。

1. 按照标准方法，准备含有 10 mL 线虫生长培养基（NGM）的 100 mm 培养皿。¹
2. 在 NGM 平板上均匀涂布 OP50 E. coli¹，并在室温下过夜干燥。
3. 将 500 μL 的 200 mM 1,6-¹³C₂ 葡萄糖（使平板终浓度为 10 mM）均匀加入平板中，过夜干燥。
4. 对处于产卵期的成年线虫进行漂白处理¹，将回收的虫卵接种至不含细菌或 1,6-¹³C₂ 葡萄糖的 NGM 平板上，于 20°C 培养过夜。
5. 次日，将孵化后处于 L1 期停滞状态的幼虫转移至预先涂有 1,6-¹³C₂-葡萄糖和 OP50 E. coli 的 NGM 平板（见上述步骤 #2）。将线虫培养至年轻成虫阶段（根据品系不同，需 48–72 小时），注意避免饥饿。
6. 用 3–4 mL S. Basal 缓冲液从平板中收集同步化的第一天年轻成虫线虫。
7. 将线虫转移至 50 mL Falcon 管中，加入 50 mL S. Basal 缓冲液洗涤。静置重力沉降 5 分钟，弃去上清液至约 5 mL。重复洗涤两次。
8. 通过计数三个 100 μL 样品来估算线虫数量²，并调整线虫浓度至 1000 条/mL S. Basal 缓冲液。
9. 用移液器将 1 mL（含 1000 条线虫）转移至 1.5 mL 塑料离心管中。
10. 加入 69 μL 含内标物（ε-氨基己酸）的 60% 高氯酸（PCA），使终浓度为 4% PCA 和 200 μmol 内标物。
11. 静置重力沉降 5 分钟，将上清液转移至另一管中并保存。
12. 使用塑料匀浆器（Kontes Pellet Pestle）和电动钻（Kontes Pellet Pestle Cordless Motor）对线虫样品匀浆 15 秒。通过光学显微镜观察确认线虫是否完全破碎，必要时重复操作。
13. 将步骤 #11 中获得的上清液与步骤 #12 的匀浆液合并。
14. 在 2250 rpm（1300 × g）下离心 5 分钟。
15. 将上清液转移至新的 7 mL 玻璃管中。将沉淀物保留用于后续蛋白浓度测定（详见下文步骤 #20）。
16. 使用 4N KOH 将样品 pH 调节至 7–8（中性）范围。
17. 将中和后的样品在 7 mL 玻璃管中以 2250 rpm（1300 × g）离心 5 分钟，以去除盐分。
18. 将上清液转移至新的 7 mL 玻璃管中。
19. 通过以下方法准备中和后的样品用于代谢物定量分析：
    1. 高效液相色谱法（HPLC）：取 50 μL 中和后的样品直接进样至 HPLC 系统。采用柱前衍生化结合邻苯二甲醛及荧光检测法（Varian 系统）进行游离氨基酸的定量分析，方法如前所述^3–4。
    2. 气相色谱/质谱联用法（GC/MS）：使用离子交换树脂（Bio-Rad）对剩余的中和样品进行提取，用于 GC/MS 分析氨基酸和有机酸的同位素富集度，具体步骤详见 PROTOCOL D。
20. 向步骤 #15 中保留的蛋白沉淀（置于 7 mL 玻璃管中）加入 1 mL 1N NaOH。
21. 将 NaOH 处理的蛋白样品在室温下置于旋转仪（Labnet* LabRoller Rotator）上旋转过夜，直至完全溶解。
22. 取 75–100 μL NaOH 处理后的蛋白溶液，采用标准方法（DC Protein Assay, Bio-rad）测定蛋白浓度。

方案B. 中间代谢中稳定同位素示踪分析 秀丽隐杆线虫 液体培养中的年轻成体

*注意：可在成年线虫产卵第一天开始于NGM平板（见上述方案A）或液体培养基中进行同位素暴露，以研究药物对中间代谢流的影响。我们更倾向于采用后一种方法，以最大限度提高稳定同位素和药理学试剂的使用成本效益。

1. 将同步化的第一天产卵期年轻成虫用含0.0005%胆固醇的S.基础培养基（通过向1L S.基础培养基中加入0.5 mL 1%胆固醇溶液（溶于95%乙醇）制备）稀释至每500 μL含2000只线虫。
2. 在25 mL锥形烧瓶中设置总体积约4 mL的培养体系，如下所示：

   处理方式：	无	“药物A”
   含胆固醇的S.基础培养基	3020 μL	3020 μL 减去“药物A”的体积
   稳定同位素（1,6-13C2-葡萄糖）	80 μL	80 μL
   K12 E. coli（OD660 2.5 至 3）	400 μL	400 μL
   年轻成虫线虫（2,000只）	500 μL	500 μL
   药物A（目标浓度）	-	按需添加

3. 用铝箔覆盖烧瓶，在20°C恒温振荡培养箱中以220 rpm振荡培养24小时。
4. 确保烧瓶未完全密封，因为中间代谢流及内源性线虫代谢物的同位素标记需要氧气。
5. 通过将4 mL培养液加入含有46 mL S.基础培养基的50 mL锥形塑料离心管中清洗线虫。静置5分钟使线虫自然沉降。用真空抽吸法去除上清液，保留约5 mL。再用S.基础培养基重复洗涤两次，每次加液至50 mL。
6. 将洗涤后的线虫浓缩至1.5 mL塑料离心管中，浓度为1000只/mL。
7. 加入69 μL 60%高氯酸（PCA）和2 μL 10 μM内标物（ε-氨基己酸），使终浓度达到200 μmol内标物和4% PCA。
8. 按照方案A中步骤#11–22处理样品。

方案 C-1. 通过追踪大气和溶解性二氧化碳中的标记碳，在培养皿中监测成虫对同位素的利用情况。

*注意：虽然方案A和方案B分别详细描述了在发育过程中的2-3天或成虫期的1天内监测同位素掺入线虫内游离代谢物的方法，但通过监测线虫释放的气态二氧化碳（CO₂）或线虫提取物中溶解的二氧化碳所含的标记，可在较短时间尺度（即数分钟至数小时）内对同位素掺入的成功与否及其动力学进行总体验证。在线虫于培养板上生长时，可喂食活的或灭活的细菌（方案C-1）。在液体培养中对线虫进行短期同位素暴露时，则无需细菌（方案C-2）。

1. 准备含有 10 mL NGM 琼脂的 100 mm 培养皿。在 NGM 平板上涂布活的或经紫外线灭活的 OP50 E. coli（如图 1 所示）。让平板在室温下过夜干燥。
2. 向已涂布 OP50 的 NGM 平板中加入 500 μL 的 200 mM 1,6-标记-¹³C₂-葡萄糖（使 NGM 平板上的最终同位素浓度为 10 mM）。让平板在室温下过夜干燥。
3. 获取在仅涂布 OP50 E. coli 的 NGM 琼脂平板上培养的同步化、产卵第一天的年轻成虫线虫。
4. 将 1000 条年轻成虫线虫转移至含有稳定同位素和 E. coli 的实验用 NGM 琼脂平板中（按上述步骤 #1–2 制备）。
5. 将实验用 NGM 平板（不加盖）放入定制的玻璃室中，玻璃室配备密封良好的三通旋塞，以便精确取样和更换气体环境。立即用光学透明的玻璃圆盘密封玻璃室。在玻璃圆盘与平板接缝处涂抹高真空润滑脂以确保密封。记录此时时间为“时间 0”。
6. 在 30、60、90 和 120 分钟时，使用 20 mL 注射器通过三通旋塞从玻璃室中抽取 10 mL 气体环境样本。将每次采集的大气样本转移至预先准备好的、顶部带有橡胶塞的 10 mL 玻璃管中，该玻璃管内含 1 mL 已经真空密封的 1 mM NaHCO₃ 溶液（溶于 0.1 N NaOH 中）。
7. 使用 20 mL 注射器通过三通旋塞向每个玻璃室中回注 10 mL 空气。在每次取样/回注气体后、继续在采集时间点之间孵育前，关闭旋塞与玻璃室的连接。
8. 通过橡胶塞向含有大气 CO₂ 样本的 10 mL 带塞玻璃管中注入 100 μL 的 20% 磷酸。
9. 抽取 2 mL 气体并注入预先充有氦气的 12 mL 蓝头自动进样瓶中，用于大气 CO₂ 测定。
10. 使用气体比率质谱仪（ThermoQuest Finnigan Delta Plus）分析“大气 CO₂ 样本”。
11. 在完成两小时同位素孵育并采集所有大气样本后，打开玻璃室。
12. 使用 3 mL S. 基础液将线虫从 NGM 平板上冲洗下来。
13. 在 50 mL Falcon 管中用 50 mL S. 基础液清洗线虫，重复清洗两次。
14. 将线虫浓缩至约 1000 条/mL，置于 7 mL 圆底玻璃管中。
15. 用橡胶塞对玻璃管进行真空密封。
16. 用注射器通过橡胶塞向玻璃管中加入 100 μL 的 20% 磷酸，以释放溶解的 CO₂。
17. 抽取 2 mL 气体并注入预先充有氦气的 12 mL 蓝头自动进样瓶中，用于溶解 CO₂ 测定。
18. 使用气体比率质谱仪（ThermoQuest Finnigan Delta Plus）分析“溶解 CO₂ 样本”。

替代方案（C-2）：通过追踪大气和溶解性二氧化碳中标记的碳，监测成虫在液体培养中的同位素利用情况。

1. 在铺有OP50大肠杆菌（E. coli）的NGM琼脂平板上培养同步化、产卵第一天的年轻成虫线虫。
2. 将线虫用50 mL S.基础液在50 mL Falcon管中洗涤。静置5分钟，使线虫自然沉降形成沉淀。弃去上清液至约5 mL。重复洗涤两次。
3. 将1000条年轻成虫线虫转移至含1 mL S.基础液的10 mL圆底玻璃管中。向线虫悬液中加入10.1 μL的1 M全标记¹³C-葡萄糖储备液，使终浓度达到10 mM。
4. 通过在敞口状态下通入流动的100%氧气2分钟，对含有线虫和同位素的圆底玻璃管进行氧合。随后立即用橡胶塞密封管口。
5. 将实验用圆底玻璃管置于20°C恒温振荡培养箱中，以220 rpm振荡。记录开始时间作为“时间0”。
6. 在30、60、90和120分钟时，使用10 mL注射器和25号针头穿过橡胶塞，从10 mL圆底玻璃管中抽取5 mL气体样品。
7. 将每次采集的气体样品转移至预先准备好的、装有1 mL含0.1 N NaOH的1 mM NaHCO₃溶液并已抽真空密封的10 mL带橡胶塞玻璃管中。
8. 使用10 mL注射器和25号针头，将5 mL空气通过橡胶塞重新注入每个含有线虫和同位素的实验用圆底玻璃管中。
9. 在各采样时间点之间，继续将含有线虫和同位素的10 mL圆底玻璃管以220 rpm振荡培养。
10. 通过橡胶塞向含有气体的、带橡胶塞的10 mL玻璃管中注入100 μL的20%磷酸溶液。
11. 抽取2 mL气体，注入预先充有氦气的12 mL蓝色顶盖自动进样瓶中，用于气相CO₂测定。
12. 使用气体同位素比质谱仪（ThermoQuest Finnigan Delta Plus）分析“气相CO₂样品”。
13. 实验结束后，在50 mL Falcon管中用50 mL S.基础液洗涤线虫。静置使线虫沉淀。用真空抽吸法将上清液减少至约5 mL。再用50 mL S.基础液重复洗涤两次。
14. 将线虫浓缩至约1000条/mL，置于7 mL圆底玻璃管中。盖上橡胶塞并进行真空密封。使用1 mL注射器和25号针头，通过橡胶塞加入100 μL的20%磷酸溶液，以释放线虫体内溶解的CO₂。
15. 抽取2 mL气体，注入预先充有氦气的12 mL蓝色顶盖自动进样瓶中，用于溶解CO₂测定。
16. 使用气体同位素比质谱仪（ThermoQuest Finnigan Delta Plus）分析“溶解CO₂样品”。

方案 D. 对方案 A 和 B 中的中和样品进行处理，用于气相色谱/质谱法分析氨基酸和有机酸。

1. 珠子准备：
   1. 分别向 1 L 烧杯中的 Ag 1 和 Ag 50 珠子中加入 1 N HCl。
   2. 使用磁力搅拌器搅拌每个烧杯 30 分钟。
   3. 用去离子水清洗珠子 10 次，直至洗液的 pH 值与水的 pH 值相同。
2. 层析柱准备：
   1. 在巴斯德移液管尖端最窄处上方插入一小团棉花。
   2. 每份样品准备两根层析柱，分别向其中加入带电荷的珠子，填充至柱高约三分之一。有机酸提取使用 AG1 珠子，氨基酸提取使用 AG50 珠子。
3. 样品处理：
   1. 向装有带电荷 AG1 珠子的层析柱中加入 500 μL 样品。若样品已处于中性 pH 值，则在加入 AG1 柱前无需对样品进行任何处理（参见 PROTOCOL A 第 19B 步）。
   2. 在将剩余样品加入 AG50 柱以提取氨基酸前，先加入 1 mL 的 0.1 N HCl。
   3. 让样品完全流经层析柱。
   4. 用水洗涤层析柱 10 次，直至洗出液呈中性（pH 7–8 范围）。
   5. 将层析柱洗脱至新的、已标记的 4 mL 玻璃样品瓶中：
      1. 有机酸提取：向 AG1 柱中加入 3 mL 的 3 N HCl。此步骤可实现对 3 碳物质（乳酸）、4 碳物质（天冬氨酸、琥珀酸、苹果酸）、5 碳物质（谷氨酸）和 6 碳物质（柠檬酸）中标记碳总数的同位素富集分析。
      2. 氨基酸提取：向 AG50 柱中加入 3 mL 的 4 N NH₄OH。此步骤可实现对 3 碳物质（丙氨酸）和 5 碳物质（谷氨酰胺）中标记碳总数的同位素富集分析。
   6. 将样品瓶置于 Reacti-Vap III 浓缩仪中过夜，直至完全干燥。

E. 质谱分析的样品衍生化与仪器设置

向每个样品瓶中加入50 μL乙腈和50 μL N-甲基-N-叔丁基二甲基硅烷三氟乙酰胺（MTBSTFA）。盖上瓶盖，混匀，并在60°C下孵育30分钟。每份样品取1-2 μL注入气相色谱/质谱仪（GC/MS）中。

F. 结果分析

1. 氨基酸峰的定量。通过高效液相色谱分析，每种氨基酸的定量是根据各峰面积相对于内标峰面积进行计算的。
2. 计算同位素富集度。每种物质的稳定同位素富集度在 Excel（Microsoft）中根据以下公式计算：校正后的原子百分过剩（APE）= (R_sa - R_st) × 100 / [(R_sa - R_st) + 100]，其中 R_sa 为样品的同位素比值，R_st 为标准品的同位素比值。
3. 评估样品间富集度的统计学差异。采用学生t检验（Student's t-test）评估样品间相对氨基酸含量及同位素标记差异的显著性。

代表性结果：

稳定同位素在年轻成虫蠕虫中被有效整合，这由大气 CO 中测得的标记碳所证实₂ 以及溶解的线虫 CO2。在线虫饲喂活的或经紫外线照射灭活的 OP50 的情况下 E. coli，比例 ¹³CO₂ 到 ¹²CO₂ 在溶解的蠕虫CO中含量更高₂ 相对于释放到大气中的 CO 的组分₂ （图1）。喂食线虫活的或灭活的OP50 E. coli 未显著改变所测得的 ¹³CO₂ 到 ¹²CO₂ 洗涤后线虫提取物中的比值（参见方案 C1）。

从幼虫早期开始长期暴露于稳定同位素，导致中间代谢物中同位素富集增加。在线虫发育期间持续喂食全标记的¹³C-葡萄糖和活细菌时，野生型年轻成虫线虫中间代谢物中各谷氨酸组分的校正碳标记原子百分比过剩值，显著高于仅在达到产卵成虫阶段后喂食标记细菌48小时的对照组动物（图2）。

清除时间对同位素富集的影响。无论同位素暴露的时间进程如何，所有在平板上培养的动物在进行下游GC/MS分析前，均需通过“清除”步骤去除同位素标记。清除方案的比较如图2所示，包括：在未添加同位素的NGM琼脂平板上接种活的新鲜细菌，让线虫摄食2小时；或在无细菌的NGM琼脂平板上摄食2小时；或在无细菌的NGM平板上摄食2小时或6小时。无论同位素暴露过程如何，在无细菌的NGM平板上清除2小时或6小时后，从年轻成虫全虫提取物中检测到的中间代谢物的同位素富集水平均无显著差异。相比之下，当动物在含有未标记细菌的平板上摄食2小时以清除过量同位素时，中间代谢物中的同位素富集程度较低。然而，当线虫从早期幼虫阶段即开始暴露于同位素时，+3、+4和+5标记物种的富集程度明显升高。因此，最优的清除方案确定为：线虫在接种了稳定同位素和细菌的NGM平板中孵育后，转移至未接种细菌的NGM平板中继续孵育2小时。值得注意的是，液体培养的线虫通过三倍体积的S.基础培养基洗涤以彻底清除同位素标记和细菌（见方案B）；对洗涤液进行GC/MS分析显示，第三次洗涤时已无显著的同位素富集。

虫体研磨可使中间代谢物的富集程度达到最高。为在类似处理条件下优化中间代谢物的富集百分比，比较了仅通过超声处理或超声联合研磨处理的虫体样品。图3显示，在同位素标记后，采用超声联合研磨破碎的虫体样品比仅采用超声破碎的样品具有更高的同位素富集度。这些数据表明，相较于超声处理，研磨能更有效地破碎更多的亚个体组分。后续研究进一步发现，单独使用研磨而不进行超声处理即可实现最大程度的同位素富集（数据未显示）。

整体线虫同位素暴露技术可用于分析中间代谢途径的通量。通过在发育阶段（方案A，图4A）或从成虫阶段开始（方案B，图4B）向活体线虫喂食稳定同位素标记的前体物质，可灵敏地检测多种代谢物的同位素富集情况，从而反映糖酵解（乳酸、丙氨酸）、丙酮酸代谢（丙氨酸）以及三羧酸循环（柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺）的代谢通量。使用全标记的¹³C-葡萄糖可对所有碳物种实现强效标记，而使用1,6-¹³C₂-葡萄糖则仅能对每种代谢物的+1标记物种实现强效标记。该技术能够灵敏地区分野生型线虫与线粒体呼吸链突变株（如复合体III线粒体呼吸链亚基突变体isp-1(qm150)）之间的中间代谢通量差异。图5展示了isp-1(qm150)突变株与N2野生型线虫在液体培养条件下，从产卵初期成虫阶段第一天起暴露于1,6-¹³C₂-葡萄糖24小时后，各代谢物绝对标记水平的差异（采用方案B，以K12 E. coli细菌作为食物来源）。目前，针对多种线粒体突变型线虫的其他稳定同位素研究正在进行中。

图1. 全标记的¹³C-葡萄糖稳定同位素被年轻成虫线虫有效吸收。 在喂食全标记的¹³C-葡萄糖并辅以紫外灭活或活体OP50细菌的平板（方案C1）上培养两小时后，野生型（N2）线虫中的¹³CO₂与¹²CO₂比值（校正后的原子百分超量，APE）。暴露于同位素两小时后，线虫代谢物中¹³C的掺入显著。蓝色和红色柱分别表示气相（“大气CO₂”）和液相（“线虫CO₂”）中的相对同位素富集程度。

图 2. 从早期幼虫阶段开始长时间同位素暴露，随后在无细菌的 NGM 琼脂平板上“清洗”线虫，可提高年轻成虫线虫游离谷氨酸的同位素富集水平。 图中显示了在 NGM 琼脂平板上饲喂全程普遍标记的¹³C-葡萄糖和 OP50 细菌的线虫（从 L1 幼虫阶段发育至具有 959 个体细胞的年轻成虫阶段（“L1”，参见方案 A）），或从线虫达到产卵年轻成虫第一天起开始饲喂 48 小时（“YA”）后，其谷氨酸种类的同位素富集情况。X 轴表示每种谷氨酸分子中被标记的碳原子总数。Y 轴表示富集百分比（校正后的过剩原子百分数，APE）。绿色柱表示在 PCA 提取前，经在不含同位素的 NGM 平板上喂食未标记 OP50 E. coli 两小时进行清洗的线虫。蓝色和灰色柱分别表示在 PCA 提取前，在无细菌且无同位素的 NGM 平板上清洗两小时或六小时的线虫。

图3. 通过研磨破坏线虫可使中间代谢物获得最大同位素富集。在未添加细菌的液体培养基中，野生型线虫经1,6-¹³C₂-葡萄糖处理24小时后，检测其+1柠檬酸物种中的碳同位素富集百分比（实验方案B）。黑色和灰色柱状图分别代表仅通过超声处理、以及通过超声联合研磨处理的线虫样本。在单碳标记的代谢物中，可最准确地评估1,6-¹³C₂-葡萄糖暴露后的同位素富集情况。相比之下，当使用全标记¹³C-葡萄糖时，每种代谢物的所有物种均会出现标记富集。

图 4. 代表性结果展示了线虫中间代谢物中同位素富集的程度，反映了糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环中的代谢通量。 校正后的原子百分比过剩（APE）在年轻成虫期野生型（N2 Bristol）线虫中测定，分别在以下条件下暴露于1,6-¹³C₂-葡萄糖后获得：（A）从L1阶段开始在平板上发育期间（方案A），或（B）从年轻成虫期产卵第一天起在液体培养中处理24小时（方案B）。当获得三个生物学重复的可靠同位素数据时，误差线表示标准差。

图5. 野生型和线粒体突变型线虫品系中四种氨基酸代谢物种类的绝对氨基酸定量。每种代谢物种类的绝对定量值通过将高效液相色谱法（HPLC）测定的游离氨基酸浓度（nmol/mg 线虫蛋白）乘以每种代谢物种类的校正后原子百分比过剩值（APE）计算得出。灰色和黑色柱状图分别代表野生型（N2 Bristol）和线粒体复合体III亚基突变品系（isp-1(qm150)）。柱状图表示每个品系三次生物学重复实验的平均值。

讨论

采用质谱法测定中间代谢物中的同位素丰度，能够极为详细地揭示关键的生化变化⁵。本文提供了详细的实验方案，用于利用这一高灵敏度和高特异性的方法，在遗传操作灵活的模式动物 C. elegans 中评估中间代谢通量。事实上，通过向活体动物喂食稳定同位素标记的代谢前体（如 ¹³C-葡萄糖），并在下游代谢物中测定同位素富集程度，可获得关于中间代谢途径通量的全新见解。我们已建立可靠的方法，用于对糖酵解、丙酮酸代谢以及三羧酸循环中的代谢通量进行稳健分析。该方法既可用于从早期幼虫发育阶段开始喂食稳定同位素的动物，也可用于从有丝分裂后成虫期开始喂食的动物。不同代谢物种类的同位素富集情况可与全虫游离氨基酸的高效液相色谱分析相结合（如前所述⁴），以确定虫体中游离丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺各组分的绝对同位素富集度。在1,000至2,000条同步化的年轻成虫期线虫样品中测定氨基酸和有机酸分析物时，可获得一致的同位素富集模式。该方法能够灵敏地区分核基因相关的线粒体突变株与野生型线虫之间中间代谢通量的异常差异。

该技术可用于研究与常见先天性代谢缺陷相关的特定生化通路中的流量变化。特别是，使用稳定同位素标记的葡萄糖可揭示与线粒体疾病相关的核心代谢通路中的碳流情况。事实上，我们的数据表明，该方法能够灵敏地区分核基因介导的线粒体复合体III亚基突变株（isp-1(qm150)）与野生型线虫之间在中间代谢流量上的异常差异。

需要注意的是，由于同位素暴露过程持续数天，所测定的同位素富集程度反映的是“稳态”富集值，而非在细胞模型中通过数分钟至数小时同位素暴露所测定的特定时间段内的可量化通量。在研究线虫发育过程中代谢通路通量时，另一个潜在的局限性在于特定突变株中幼虫发育时间存在差异。例如，已知许多严重的线粒体突变会导致线虫停滞在第三（L3）幼虫阶段⁶。因此，仅对存活至成虫阶段的个体进行同位素掺入分析，可能无法代表整个突变群体。然而，该方法可进行调整，以评估特定幼虫阶段（如L2阶段）中间代谢物的同位素掺入情况，而不必等待动物发育至成虫阶段。类似地，进入称为dauer的替代性幼虫阶段的个体，其代谢通量很可能显著改变（可能降低），与直接经历四个幼虫阶段的个体相比存在明显差异。未来的研究还可直接评估不同遗传背景下dauer阶段个体的同位素掺入情况。在动物达到年轻成虫阶段后（如方案B所述），开始进行固定时间（此处为24至48小时）的稳定同位素暴露，可消除发育周期差异带来的影响。虽然¹³C-葡萄糖仅能用于研究糖酵解、丙酮酸代谢和三羧酸循环的通量，但也可评估其他同位素示踪剂，以探究线虫中其他感兴趣生化通路的通路通量。例如，可利用¹⁵N-甘氨酸来评估线虫中氨基酸的周转情况。

该方法的另一个潜在局限性在于代谢物检测的灵敏度水平。根据我们的经验，使用本文所采用的高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法，至少需要500条年轻成虫期线虫，才能成功定量同位素掺入情况。使用灵敏度更高的仪器，例如超高效液相色谱（UPLC），可能进一步减少所需研究的动物数量，但我们预计这仍难以实现对单条线虫中代谢物及其同位素掺入种类的可靠定量。在本研究中，每次实验使用了1,000条线虫的群体规模，该数量可稳定检测每种品系中低丰度代谢物。然而，某些代谢物（如γ-氨基丁酸，GABA）仅能在更大规模的线虫群体中实现可靠定量，其数量级约为1×10⁶条动物⁴。

总之，稳定同位素分析提供了一种非侵入性且安全（非放射性）的方法，长期以来被用于研究先天性代谢缺陷。将该方法应用于C. elegans，可实现对整个生物体水平上发生的体内实时代谢变化进行新颖的探究，这些变化可能由单个遗传病和/或药物暴露引起。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
S. basal		1 第59页	方案A和方案B
胆固醇	Sigma-Aldrich	C-8503	方案B
OP50 大肠杆菌	秀丽隐杆线虫遗传学中心		方案A和方案C
K12 E. coli	秀丽隐杆线虫遗传学中心		方案B
NGM 琼脂	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	方案A、B和C
13C葡萄糖（全标记）	剑桥同位素实验室	CLM-1396	方案A和C
13C葡萄糖（1,6标记）	剑桥同位素实验室	CLM-2717	方案B
60% 高氯酸 (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	方案A和方案B
ε-氨基己酸（内标）	Sigma-Aldrich	A-2504	方案A和方案B
MTBSTFA	雷吉斯	270243	实验方案 E
乙腈	雷吉斯	270010	实验方案 E
AG 1-X8，100-200，氯离子型树脂	伯乐（Bio-Rad）	140-1441	方案A和方案B（有机酸提取）
AG 50W-X8，100-200，氢型树脂	伯乐（Bio-Rad）	142-1441	方案A和方案B（氨基酸提取）
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	方案 C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	方案 C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	方案 D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	方案A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	方案 D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	方案 D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	方案A和B
去离子水	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	方案 D
氦	Airgas	24001364	方案 C2
SMZ-800 变焦体视显微镜	尼康仪器公司	NI MNA41000	方案A、B和C
pH计	Fisher Scientific	S68167	方案A和方案B
台式离心机 - 5804R	Eppendorf	05-400-93	方案A和方案B
孵育平台摇床	新不伦瑞克科学公司	M1324-0004	方案B
Mini LabRoller 旋转混匀仪	Labnet International	H-5500	方案A和方案B
研钵杵	Kontes Corp	K749520-0090	方案A和方案B
钻孔	Kontes Corp	K749540-0000	方案A和方案B
1 L 玻璃烧杯	Fisher Scientific	02-539P
1 L 锥形瓶	VWR 国际公司	89000-368
25 mL 锥形瓶	VWR 国际公司	89000-356	方案B
7 ml 圆底玻璃管 + 橡胶塞	VWR 国际	VT6431	方案A、B和C1、C2
10 ml 圆底玻璃管 + 橡胶塞	VWR 国际公司	VT6430	方案 C2
蓝顶管	Labco	438B
50 ml 锥形塑料离心管	Falcon BD	14-959-49A	所有实验方案
1.5 ml 微量离心管	Fisher Scientific	02-681-320	方案A和B
注射器（1 mL，10 mL，20 mL）	BD 生物科学	301025, 301029, 301031	方案C1和C2
25号针头	Fisher Scientific	22-253-131	方案C1和C2
Poly-Prep 色谱柱	伯乐（Bio-Rad）	731-1550	方案 D
巴斯德吸管	VWR 国际公司	14673-043	方案 D
60 mm 培养皿	VWR 国际公司	25373-085	方案 C
带油脂密封三通旋塞的玻璃室（由1 L烧瓶底部切割制成）	定制		方案C
光学透明玻璃板	定制		方案 C
Reacti-Vap III 浓缩仪	赛默飞世尔科技公司	18826	方案 D
棉絮	VWR 国际公司	14224-516	方案 D
高真空润滑脂	道康宁	1597418	方案 C1
铝箔	Fisher Scientific	01-213-18	方案B
计时器	ISC Bioexpress	T-2504-5	方案 C
气体比率质谱仪	赛默飞世尔科技公司		方案 D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	方案 D
GC-MS	安捷伦科技	6980N/5973N	方案 D
高效液相色谱法	Varian 公司，Agilent	9010	方案 D