升结肠支架腹膜炎（CASP）——一种用于多微生物性腹腔脓毒症的标准化模型

摘要

升结肠支架腹膜炎（CASP）是一种高度标准化的啮齿类动物多微生物性腹腔脓毒症模型。本文描述了CASP的手术操作过程。CASP模型及其变体可用于系统性地研究与脓毒症相关的各种问题。

摘要

脓毒症仍然是全球重症监护病房中持续存在的难题。深入了解脓毒症复杂的发病机制，是建立新型治疗策略的前提条件。因此，需要能够高度模拟人类疾病并充分满足科学问题研究需求的动物模型。升结肠支架腹膜炎（Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP）是一种高度标准化的啮齿类动物多微生物性腹腔脓毒症模型。在该模型中，通过手术将一根小型支架植入小鼠或大鼠的升结肠，导致肠道细菌持续泄漏至腹腔。该操作可引发腹膜炎、全身性菌血症、肠道细菌引起的器官感染，以及多种促炎性和抗炎性细胞因子的全身性及局部释放。CASP模型的致死率可通过植入支架的直径进行调控。该模型的一种变体，即所谓的带干预的CASP（CASP with intervention, CASPI），模拟临床实践中的常规处理方式，允许通过第二次手术清除感染灶。CASP是一种易于掌握且高度可重复的模型，能紧密模拟腹腔脓毒症的临床病程，为免疫学、感染病学或外科学等多个科研领域的问题研究提供了重要途径。

方案

1. 小鼠的准备

1. 通过腹腔注射麻醉液（参见试剂表）使小鼠麻醉，并将其置于仰卧位。
2. 需用胶带将小鼠的四肢固定在板上，以确保手术过程中动物位置稳定。

2. 操作

1. 取一个常用于人体静脉注射的静脉套管，在距其尖端约2 mm处将塑料管作环形切割。我们使用三种不同规格的套管以控制死亡率（BD Venflon 18GA（1.2×45 mm，80 mL/min）；16GA（1.7×45 mm，180 mL/min）；14GA（2.0×45 mm，270 mL/min））。
2. 彻底消毒腹部皮肤后，沿中线切开约15 mm。沿腹白线切开腹肌和腹膜，打开腹膜腔。
3. 辨认盲肠末端，使用棉签小心地将盲肠、回肠末端和升结肠从腹腔内拉出。
4. 在回盲瓣远端15 mm处，用7/0缝线穿刺升结肠壁，注意避免损伤肠壁血管。通过两个外科结将缝线固定在结肠壁上。
5. 随后，用已准备好的套管在7/0缝线近端1–2 mm处穿刺升结肠。小心地将套管插入结肠，直至塑料管上的凹槽与浆膜层齐平。
6. 将7/0缝线的游离端绕过套管，并在塑料管的凹槽处打一个双结，确保结位于凹槽内。
7. 现在，取7/0缝线的针头，将其穿过结肠的对系膜侧肠壁。连续打两个外科结，以进一步将塑料管固定于结肠壁。剪除缝线末端。
8. 轻轻退出套管的金属部分，并在靠近（约1 mm）固定用7/0缝线处剪断塑料管。
9. 使用棉签小心地将盲肠内的粪便向结肠支架方向推挤，直至支架顶端出现少量粪便尖端。
10. 将肠管复位至腹膜腔内，并通过腹腔内注射0.5 mL生理盐水进行液体复苏。
11. 用连续缝合法（4/0缝线）关闭腹膜。
12. 用间断缝合法（4/0缝线）关闭皮肤。

3. 术后护理

1. 将动物放回笼中，笼内应备有足够的食物和水。为缓解疼痛，应定期进行腹腔注射强效镇痛物质（我们使用丁丙诺啡）。
2. 手术后的前两天内，需每6小时检查动物一次。

4. 假性 CASP

1. 执行步骤 1.1-2.4。
2. 不要穿刺结肠。仅执行步骤 2.6-2.8。
3. 执行步骤 2.10-3.2。

5. CASPI

1. 使用14G套管针，按照步骤1.1-3.1进行CASP操作
2. CASP术后5小时，需再次对动物进行手术。根据步骤1.1-1.2重新准备并麻醉小鼠
3. 打开腹壁缝线
4. 将带有支架的升结肠轻轻拉出
5. 小心剪断固定支架的缝线，并移除支架
6. 使用单个内翻缝合线（7/0）闭合结肠缺损处
7. 将肠道复位至腹腔内，并用10 mL生理盐水冲洗腹腔两次
8. 用连续缝合法（4/0）缝合腹膜
9. 用单个缝线（4/0）缝合皮肤
10. 执行步骤3.1-3.2

6. 代表性结果

手术后数小时内，动物会出现早期脓毒症的临床症状。该疾病的典型症状包括活动能力下降、毛发竖立、出汗、摄食量减少、体重减轻以及逃避行为减弱。发生严重腹膜炎并继发全身性感染的动物通常在48小时内死亡。根据植入的套管针尺寸不同，可产生不同的死亡率。使用14G套管针会导致100%死亡率，16G导致70%死亡率，而使用18G套管针可达到50%死亡率（图1a）。假手术组的存活率为100%。通常情况下，所有动物均在CASP术后前48小时内死亡。因此，在此时间点仍存活的动物均可视为存活者。然而，我们建议额外观察至少72小时，以发现CASP术后罕见的“晚期死亡”情况。

CASPI 的结果取决于 CASP 后支架移除的时间间隔。在 CASP 后 3 小时进行干预，动物的存活率为 45%；若在 CASP 后 5 小时移除支架，仅有 10% 的动物能够存活；而在 CASP 后 9 小时移除支架，则死亡率达到 100%（图 1b）。假手术组 CASPI 的存活率为 100%。对于 CASPI 实验设置，我们建议观察期为 10 天，因为通常会有一些动物在 CASP 后超过 48 小时才死亡。

CASP术后24小时对腹部解剖结构进行肉眼检查，可见典型的腹膜炎体征：水肿、血管扩张、肠壁充血发红、派尔集合淋巴结边界清晰、肠麻痹、游离液体以及脓性分泌物（图2）。

通过细菌学分析可显示全身性感染。CASP 术后12小时，可在腹腔灌洗液、血液、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏中检测到大量细菌。细菌的定性分析显示，典型的肠道细菌（如大肠杆菌 E. coli、拟杆菌属、肠球菌属等）引起了全身性感染（图3）。

CASP诱导的脓毒症表现为局部以及全身性促炎性和抗炎性细胞因子及趋化因子的释放。CASP术后12小时，通过ELISA可在血液以及器官悬液（如肝脏、肺、脾脏、肾脏）的上清液中检测到显著水平的TNF、IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1及其他因子（图4）。

在实验室建立CASP模型时，应将存活率、细菌学和细胞因子释放作为评估CASP操作是否正确的控制参数。此后，这些参数可作为所有实验条件下标准的检测指标系统。

图1a：CASP术后生存率。CASP手术后的生存率取决于所插入支架的直径。14G CASP的死亡率为100%，16G CASP的死亡率为70%，18G CASP的死亡率为50%。假手术组（Sham CASP）的生存率为100%。每组n=20。B： CASPI手术后的生存率取决于支架取出时间。在14G CASP术后3小时取出支架，死亡率为55%；术后5小时取出支架，死亡率为90%；术后9小时取出支架，死亡率为100%。假手术组（Sham CASPI，5小时）的生存率为100%。每组n=10（假手术组；CASPI 9小时组），每组n=20（CASPI 3小时组；CASPI 5小时组）。

图2：CASP术后24小时的腹部解剖情况。分别在16G CASP或假手术CASP后24小时切除腹壁。假手术小鼠的腹部解剖结构呈现生理状态。相比之下，CASP术后出现水肿、充血、肠管扩张以及派尔集合淋巴结的边界清晰可见，提示存在严重的腹膜炎。

图3：细菌学。CASP术后12小时内，肠道细菌可导致多个腔室和器官发生严重感染。细菌数量分别以每毫升菌落形成单位（cfu）表示。假手术小鼠的细菌培养完全无菌（未显示）。16G CASP，每组n=5。

图 4：细胞因子。CASP 可触发全身性免疫反应，多种细胞因子和趋化因子可在血浆及器官上清液中被检测到。该图示例性地展示了促炎性细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-6（IL-6），以及主要具有抗炎作用的 IL-10。CASP 术后 12 小时，血浆、肝脏、肺和脾脏中均可检测到显著水平的上述细胞因子。然而，CASP 术后在肺和脾脏中无法检测到 IL-10。假手术组未引起任何细胞因子分泌（未显示）。16G CASP，每组 n=5。

讨论

CASP 是一种多微生物性腹腔脓毒症模型，符合有价值脓毒症模型的大多数标准：CASP 可在小型动物中实施，具有高度可重复性，可通过标准参数轻松监测，提供良好的检测读出可能性，并且能高度模拟临床腹腔脓毒症的情况。在一项比较研究中，我们已证明 CASP 会导致弥漫性腹膜炎，并伴随早期出现且持续加重的全身感染和炎症（全身炎症反应综合征）；而盲肠结扎穿刺术（CLP）则表现为一种腹腔内脓肿形成的模型，其全身炎症反应持续但较轻微（1）。CASP 技术的改进版本（CASPI）能够模拟腹膜炎的临床病程，并可连续进行手术病灶清除，后者是人类治疗中最关键的治疗原则。CASP 可用于研究脓毒症或腹膜炎相关的所有问题，因此适用于所有涉及脓毒症研究的学科，例如免疫学、药理学、外科学、重症医学等。以下列出了一些应用 CASP 模型研究脓毒症不同主题的部分出版物（1-14）。

刚开始进行CASP操作时，应注意需要一定的练习才能准确且快速地完成手术。具备外科经验可能有所帮助，但并非必需。我们建议将致死率作为评估CASP操作是否正确的参数。初学者应从14G CASP开始，因为较粗的支架比更细的支架更容易操作。一名熟练的CASP外科操作人员可在10分钟内完成一只小鼠的手术。在开始任何实验之前，应确保自己已接近这一操作时间。当您积累了一定的手术操作经验后，应进行一次生存动力学检测以评估您的操作技能。14G CASP应达到100%的致死率。我们实验室的初学者必须证明其能够使用14G CASP实现100%致死率后，方可开始正式实验。此外，应进行细菌学检测和细胞因子测定，以确认脓毒症模型的建立。 如果在CASP显微外科步骤的初期遇到困难，使用放大镜或手术显微镜可能会有所帮助。但原则上，CASP无需这些设备也能顺利完成。为了重现我们的生存率结果，必须使用相同的材料，尤其是支架（BD Venflon，见下文）。否则，结果可能出现显著差异。此外，我们提示结果可能因例如操作者个体差异等因素而有所不同。然而，此类因素的影响应当较小。

总之，CASP 是一种切实可行、简单、可重复且有价值的脓毒症模型，能紧密模拟腹腔脓毒症的临床情况，因此适用于所有脓毒症研究领域。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉液			将0.5 mL Rompun与4.0 mL Ketanest混合，再加入5.5 mL生理盐水（0.9%）。为实现完全麻醉，按10 μL/g体重剂量腹腔注射
Rompun（20 mg/mL 塞拉嗪）	Bayer AG
Ketanest（25 mg/mL 乙氯胺酮）	Pfizer Pharma GmbH	647028001E
BD Venflon 18GA（1.2×45 mm，80 mL/min）	BD Biosciences	391457
BD Venflon 16GA（1.7×45 mm，180 mL/min）	BD Biosciences	391455
BD Venflon 14GA（2.0×45 mm，270 mL/min）	BD Biosciences	391456
白色4/0聚酯肠线，不可吸收	Catgut GmbH	17218113
黑色7/0 Mariderm，不可吸收	Catgut GmbH	18104900