冈比亚按蚊成蚊RNAi实验方案

摘要

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了Dimopoulos实验室用于将dsRNA注入冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的一种方法，该蚊种可携带疟原虫。本技术详细演示了注射装置的操作以及将dsRNA注入蚊子胸部的过程。

摘要

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了迪莫普洛斯实验室用于将dsRNA注射到携带疟原虫的冈比亚按蚊中的方法。该技术包括注射装置的操作以及将dsRNA注射至蚊子胸部的过程。

方案

在蚊子中进行RNAi介导的基因沉默需要预先制备和纯化针对目的基因的特异性dsRNA。对于dsRNA合成，我们推荐使用Ambion Megascript试剂盒，该试剂盒利用T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应。对于dsRNA纯化，我们推荐使用Qiagen RNeasy试剂盒。dsRNA样品应定量并用水调整至3 μg/μL。您还需要以下材料：尖头镊子、载玻片、玻璃微量移液针、显微注射仪（我们使用Drummond的Nanoject II）、安装在冷台上的一台体视显微镜、带盖的玻璃培养皿、纸巾和一桶冰。此外，您还需要一种收集蚊子的方法，以及适合容纳蚊子的容器和食物来源，例如浸有10%蔗糖的棉球。

1. 收集蚊子. 使用电池供电的吸蚊器收集需要注射的蚊子。用纸巾或棉花堵住吸嘴，防止蚊子逃逸，然后取下储液管。由于低温可使蚊子麻醉，将储液管埋入装有冰块的桶中，静置5–10分钟，直至蚊子停止活动。也可通过将储液管置于低温室或冰箱中，或使用CO₂实现麻醉。在等待的5–10分钟内，可继续进行下一步操作。
   
   
2. 准备操作区域. 将平板式冷台设置为2°C，并在其上放置一块载玻片，用于放置待注射的蚊子。将玻璃针头连接至显微注射仪，并使用镊子将针尖折断至所需宽度。针尖宽度应足够大，以保证液体以合理速度流出，同时又足够细，以尽量减少注射时造成的创伤。理想的针尖应细到可轻微弯曲但不会断裂。根据实验需求设定注射设备的输出体积（RNAi实验中我们使用69 nL）。按照制造商说明，将针尖浸入样品中，吸取液体样本。液体样本可以是dsRNA溶液、细菌悬液或其他类型，注射流程对所有样本均相同。将玻璃培养皿嵌入冰桶中，确保皿底完全接触冰面，用于暂时存放待注射的蚊子。
   
   
3. 准备蚊子. 将50–100只蚊子从储液管转移至玻璃培养皿中。使用镊子将其铺成单层，确保大多数蚊子与冰冷的皿底接触以维持麻醉状态。不使用时，用培养皿盖覆盖蚊子。将储液管放回冰桶中，以保持其余蚊子处于麻醉状态。
   
   
4. 将蚊子置于冷台上. 使用尖头镊子在体视显微镜下，将蚊子逐个从培养皿转移至安装在冷台上的载玻片上。操作时应轻柔，最好夹住蚊子的腿部。在载玻片上并排排列最多30只蚊子，确保每只蚊子均能被显微注射仪触及，并与冷载玻片充分接触。排列时应保持有序，以便在注射过程中清楚识别已注射和未注射的个体。其余蚊子应继续覆盖并存放于冷藏的培养皿中。
   
   
5. 注射第一组蚊子. 一手持尖头镊子，另一手像握笔一样握住显微注射仪。使用镊子根据需要移动蚊子（避免夹伤，应夹住腿部），并在注射时固定蚊子。最佳操作方式是用镊子支撑蚊子的一侧，从另一侧进行注射。小心地将针尖仅插入蚊子的胸部。应选择外骨骼紧绷但较薄的区域注射，以减少损伤。同时避免插入过深；仅需针尖进入胸腔即可，过深注射会造成更大创伤，影响存活率。当针尖到位后，踩下并释放显微注射仪的脚踏开关，即可注入预设体积的dsRNA。等待一至两秒后，将针头从蚊子体内抽出。若伤口处出现液滴，应等待数秒，使其被吸收。若数秒内未被吸收，则丢弃该蚊子并重新尝试。继续完成载玻片上所有蚊子的注射。
   
   
6. 存放蚊子. 操作完成后，将已注射的蚊子放入标记好的容器中（我们推荐使用1品脱容量、内衬蜡纸的纸杯，顶部覆盖网状纱布，并用橡皮筋和纸板盖固定）。
   
   
7. 继续注射直至完成. 持续将蚊子置于载玻片上，完成注射后转移至纸杯，直至达到所需样本量。需考虑部分死亡情况——初学者因注射创伤可能导致较多蚊子死亡。随着操作熟练，存活率将逐步提高，最终几乎可达100%。
   
   
8. 操作结束后，在纸杯上覆盖一张折叠的湿纸巾，并提供食物来源，再用保鲜膜或塑料培养皿盖等材料覆盖杯口以保持湿度。已注射的蚊子容易脱水，湿纸巾提供的水分及塑料覆盖物的保湿作用有助于防止此问题。
   
   
9. 将蚊子置于环境可控的培养箱中进行孵育。

注意：基因沉默效率具有高度变异性，取决于多种因素，包括转录本和蛋白质的周转速率，以及细胞和器官对dsRNA的摄取效率。我们发现，沉默效应最早可在注射后1天开始，并可持续至注射后6天。建议使用定量PCR和蛋白质印迹等转录本和蛋白质检测方法来验证沉默效果。

注意：蚊子注射及RNAi介导的基因沉默技术的多个步骤存在多种变异方法。其中一些变异方法在Boisson, et al. (2006) 和 Blandin, et al.(2002) 中有描述。

讨论

基因沉默的效率具有高度变异性，取决于多种因素，包括转录本和蛋白质的周转速率，以及细胞和器官对dsRNA的摄取效率。我们发现，沉默效应最早可在注射后1天开始，并可持续长达注射后6天。应采用转录本和蛋白质检测方法（如定量PCR和蛋白质印迹）来验证沉默效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Megascript	试剂盒	Ambion		用于合成双链RNA；通过T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应
RNeasy		Qiagen		用于纯化双链RNA
dsRNA				应定量并用水调整至 3 μg/ μL
细尖镊子
载玻片
玻璃微量毛细管针
微量注射器		Drummond Scientific	Nanoject II
光学显微镜				安装在冷台上
培养皿				带盖，玻璃材质
纸巾
10% 蔗糖	食物
A. gambiae	动物			蚊子