冈比亚按蚊成蚊RNAi实验方案

摘要

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了Dimopoulos实验室用于将dsRNA注入冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的一种方法，该蚊种可携带疟原虫。本技术详细演示了注射装置的操作以及将dsRNA注入蚊子胸部的过程。

摘要

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了迪莫普洛斯实验室用于将dsRNA注射到携带疟原虫的冈比亚按蚊中的方法。该技术包括注射装置的操作以及将dsRNA注射至蚊子胸部的过程。

方案

在蚊子中进行RNAi介导的基因沉默需要预先制备和纯化针对目的基因的特异性dsRNA。对于dsRNA合成，我们推荐使用Ambion Megascript试剂盒，该试剂盒利用T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应。对于dsRNA纯化，我们推荐使用Qiagen RNeasy试剂盒。dsRNA样品应定量并用水调整至3 μg/μL。您还需要以下材料：尖头镊子、载玻片、玻璃微量移液针、显微注射仪（我们使用Drummond的Nanoject II）、安装在冷台上的一台体视显微镜、带盖的玻璃培养皿、纸巾和一桶冰。此外，您还需要一种收集蚊子的方法，以及适合容纳蚊子的容器和食物来源，例如浸有10%蔗糖的棉球。

1. 收集蚊子. 使用电池供电的吸蚊器收集需要注射的蚊子。用纸巾或棉花堵住吸嘴，防止蚊子逃逸，然后取下储液管。由于低温可使蚊子麻醉，将储液管埋入装有冰块的桶中，静置5–10分钟，直至蚊子停止活动。也可通过将储液管置于低温室或冰箱中，或使用CO₂实现麻醉。在等待的5–10分钟内，可继续进行下一步操作。
   
   
2. 准备操作区域. 将平板式冷台设置为2°C，并在其上放置一块载玻片，用于放置待注射的蚊子。将玻璃针头连接至显微注射仪，并使用镊子将针尖折断至所需宽度。针尖宽度应足够大，以保证液体以合理速度流出，同时又足够细，以尽量减少注射时造成的创伤。理想的针尖应细....

讨论

基因沉默的效率具有高度变异性，取决于多种因素，包括转录本和蛋白质的周转速率，以及细胞和器官对dsRNA的摄取效率。我们发现，沉默效应最早可在注射后1天开始，并可持续长达注射后6天。应采用转录本和蛋白质检测方法（如定量PCR和蛋白质印迹）来验证沉默效果。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Megascript	试剂盒	Ambion		用于合成双链RNA；通过T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应
RNeasy		Qiagen		用于纯化双链RNA
dsRNA				应定量并用水调整至 3 μg/ μL
细尖镊子
载玻片
玻璃微量毛细管针
微量注射器		Drummond Scientific	Nanoject II
光学显微镜				安装在冷台上
培养皿				带盖，玻璃材质
纸巾
10% 蔗糖	食物
A. gambiae	动物			蚊子