基于胶带黏附取样与荧光技术的联用方法 原位 杂交法用于快速检测 沙门氏菌 在新鲜农产品上

摘要

本方案描述了一种基于胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后进行完整的细胞快速检测 沙门氏菌 使用荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）

摘要

本方案描述了一种基于粘性胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后在胶带上进行荧光检测 原位 杂交（FISH）用于快速无需培养的检测 沙门氏菌 spp. 细胞负载胶带也可在检测前倒置贴于选择性琼脂表面，进行固相富集。或者，可在胶带表面使用非选择性肉汤进行小体积液体富集（液面微量培养），随后进行荧光原位杂交（FISH）并结合流式细胞术分析。实验开始时，将无菌粘性胶带与新鲜农产品表面接触，施加轻柔压力后揭下，从而物理性提取存在于这些表面的微生物。将胶带粘性面向上固定于玻璃载玻片上，样品细胞用10%甲醛固定（30分钟），并用梯度乙醇溶液（50%、80%和95%；每个浓度3分钟）脱水。随后，在细胞负载胶带上滴加含有探针的缓冲液 沙门氏菌靶向DNA探针混合物在55°C下杂交15至30分钟，随后用洗涤缓冲液短暂漂洗以去除未结合的探针。贴壁的FISH标记细胞用DNA染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染，结果通过荧光显微镜观察。对于固相富集，将带有细胞的胶带正面朝下放置于合适的选择性琼脂表面，并进行培养以允许 原位 生长 沙门氏菌 微菌落，随后按照上述方法进行FISH和显微镜检测。对于液体表面微型培养，将带有细胞的胶带粘性面朝上放置，并安装硅胶灌注室，使胶带与载玻片共同构成一个密闭培养腔的底部，向其中加入少量液体（≤ 500 μL）胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。密封进样口后，在35–37°C条件下孵育，以实现胶带所捕获微生物的基于生长的扩增。孵育结束后，打开进样口，通过反复剧烈吹打使细胞脱离并混匀，离心收集细胞后用10%中性缓冲甲醛固定。最后，样品经杂交处理并通过流式细胞术检测，以揭示目标微生物的存在 沙门氏菌 spp. 如下所述，我们的“tape-FISH”方法可实现简单快速的取样与检测 沙门氏菌 在番茄表面。我们还使用该方法对其他类型的生鲜农产品进行取样，包括菠菜和哈拉佩尼奥辣椒。

方案

1. 使用无菌粘性胶带进行表面取样

1. 选择一种用于取样的胶带。市面上可购买的 Fungi-Tape 或 Con-Tact-It 取样胶带为无菌包装，使用方便。然而，我们发现普通的透明（光学清晰）办公胶带也可使用。
2. 使用永久性记号笔在一段 10 cm 长的粘性胶带非粘性面绘制 1 cm² 的方格（可使用纸质模板）。这将作为视觉参考，用于标记胶带上用于取样食品或环境表面的具体区域。
3. 将胶带弯成“C”形环状，使粘性面朝向待取样表面。操作时，用拇指和中指捏住胶带两端的粘性部分，并将食指抵在胶带背面（非粘性面）所绘制的方格位置上（图 1）。
4. 将胶带贴至待取样表面，轻压标记区域使其与表面接触。在不松开胶带边缘的前提下，用食指确保胶带的粘性面完全贴合样品表面，避免产生气泡。
5. 以均匀的动作缓慢将胶带从样品表面揭下，从而物理性地提取附着于表面的微生物。使用普通透明办公胶带将已附着细胞的胶带（粘性面向上）固定于玻璃显微镜载玻片上。确保胶带张力/拉伸适当，形成平整、无皱褶的表面，以减少后续杂交过程中加热时胶带变形或卷曲的问题。

2. 固相富集与液体表面微培养

1. 通过将胶带采样面朝下放置于木糖-赖氨酸-特吉托尔4（XLT-4）琼脂平板上，使所采集的细胞直接接触琼脂表面，从而实现固相富集。将胶带上带有模板/样本接触区域平整贴合于琼脂表面，....

讨论

在农产品表面快速、简便地检测病原体的方法有助于通过提供及时且可操作的数据来减轻食源性疾病。自20世纪50年代以来，基于粘性胶带的采样方法已广泛应用于环境、临床和食品微生物学领域，其操作包括将“透明胶带”类胶带按压至表面以采集微生物，随后进行直接显微镜检查，或将附着的微生物转移至固体培养基进行培养（Barnetson）。 & Milne，1973；Edwards & 哈特曼，1952；埃文乔 等，2001；Fung 等，1980；Lakshmanan & Schaffner，2005；Langvad，1980）。最近的一项改进描述了基于胶带的采样与荧光技术的结合 原位 杂交（FISH）技术用于无培养条件下分析定植于石质纪念碑表面的微生物（La Cono & C. Urzì，2003）。我们已采用类似方法用于快速采样和检测 沙门氏菌 存在于新鲜农产品上，包括番茄、菠菜和哈拉佩尼奥辣椒（Bisha 和 Brehm-Stecher，2009a）。可使用粘性胶带从这些食品上剥离细胞，随后对样品进行荧光原位杂交处理，并通过荧光显微镜观察。通过这种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
真菌-胶带采样胶带	科学仪器实验室	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It 采样胶带	Birko 公司，丹佛，科罗拉多州		http://www.birkocorp.com/
透明办公胶带，通用	各种		应为光学透明，且具有低自发荧光
食品表面	本地杂货店		番茄–s（红色番茄）–藤上成熟的（未打蜡或涂油）果实，此处使用
胰蛋白胨大豆肉汤	Difco 实验室	211768	用于非选择性液体表面微培养富集
木糖-赖氨酸-吐温40琼脂基础	Difco 实验室	223420	对于 沙门氏菌选择性琼脂（XLT-4）
木糖-赖氨酸-吐温40琼脂补充剂	Difco Laboratories	235310	对于 沙门氏菌-选择性琼脂（XLT-4）
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	HT5011	10% 溶液，中性，缓冲（细胞固定剂）
无水乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	分子生物学级（杂交前脱水）
1.5 ml 微量离心管	各种		无RNase和DNase
显微镜载玻片和盖玻片	赛默飞世尔科技公司
NaCl 溶液	Sigma-Aldrich	S5150	分子生物学级，5 M 溶液（杂交缓冲液组分）
Tris-EDTA缓冲液（100倍浓缩液）	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0]，0.1M EDTA（杂交缓冲液组分）
十二烷基硫酸钠溶液	Sigma-Aldrich	L4522	18兆欧水中的10%溶液（杂交缓冲液组分）
Sal3 和 Salm-63 寡核苷酸探针	Integrated DNA Technologies		5’用6-羧基荧光素（FAM）或德克萨斯红（Texas Red，用于显微镜）或Cy5（用于流式细胞术）标记，经HPLC纯化
可变速度微型离心机	各种		使用转子直径计算达到方案中所述相对离心力（RCF）值所需的转速（RPM）
CoverWell 灌注室	Grace Bio-Lab 公司	PC1R-2.0	非无菌
凝胶上样移液器吸头（FS MultiFlex）	赛默飞世尔科技公司	05-408-151	细长探头，便于轻松进入小型采样口，并可在腔室内灵活操作
铝制加热块或精密控温加热站	各种		Eppendorf Thermomixer R 干式温控振荡混匀仪
Bambino mini 杂交炉	Boekel Scientific	Model 230300	载玻片置于50 ml聚丙烯离心管中进行杂交，采用间接传热而非直接加热
滑动式护城河杂交仪	Boekel Scientific	Model 240000	通过玻片快速直接传递热量
Vectashield H-1200 封片剂，含 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Vector Laboratories	H-1200	最大限度减少显微镜观察过程中荧光的淬灭，提供 DAPI 复染
荧光显微镜	各种		此处使用的 Leitz Laborlux S
数码相机	各种		此处使用的佳能 PowerShot A640 相机
图像采集软件	各种		使用 Axiovision 软件 v. 4.6 (Carl Zeiss)
Adobe Photoshop	Adobe		用于图像的最小化处理（不同通道拍摄图像的叠加）
流式细胞仪	各种		FACSCanto 流式细胞仪（BD Biosciences，美国加州圣何塞），使用红色（647 nm）激发光
流式细胞术分析软件	各种		使用 FlowJo 软件 v. 8.7.1（Tree Star, Inc.）