本方案描述了一种基于胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后进行完整的细胞快速检测 沙门氏菌 使用荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）
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摘要
摘要
本方案描述了一种基于粘性胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后在胶带上进行荧光检测 原位 杂交（FISH）用于快速无需培养的检测 沙门氏菌 spp. 细胞负载胶带也可在检测前倒置贴于选择性琼脂表面，进行固相富集。或者，可在胶带表面使用非选择性肉汤进行小体积液体富集（液面微量培养），随后进行荧光原位杂交（FISH）并结合流式细胞术分析。实验开始时，将无菌粘性胶带与新鲜农产品表面接触，施加轻柔压力后揭下，从而物理性提取存在于这些表面的微生物。将胶带粘性面向上固定于玻璃载玻片上，样品细胞用10%甲醛固定（30分钟），并用梯度乙醇溶液（50%、80%和95%；每个浓度3分钟）脱水。随后，在细胞负载胶带上滴加含有探针的缓冲液 沙门氏菌靶向DNA探针混合物在55°C下杂交15至30分钟，随后用洗涤缓冲液短暂漂洗以去除未结合的探针。贴壁的FISH标记细胞用DNA染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染，结果通过荧光显微镜观察。对于固相富集，将带有细胞的胶带正面朝下放置于合适的选择性琼脂表面，并进行培养以允许 原位 生长 沙门氏菌 微菌落，随后按照上述方法进行FISH和显微镜检测。对于液体表面微型培养，将带有细胞的胶带粘性面朝上放置，并安装硅胶灌注室，使胶带与载玻片共同构成一个密闭培养腔的底部，向其中加入少量液体（≤ 500 μL）胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。密封进样口后，在35–37°C条件下孵育，以实现胶带所捕获微生物的基于生长的扩增。孵育结束后，打开进样口，通过反复剧烈吹打使细胞脱离并混匀，离心收集细胞后用10%中性缓冲甲醛固定。最后，样品经杂交处理并通过流式细胞术检测，以揭示目标微生物的存在 沙门氏菌 spp. 如下所述，我们的“tape-FISH”方法可实现简单快速的取样与检测 沙门氏菌 在番茄表面。我们还使用该方法对其他类型的生鲜农产品进行取样，包括菠菜和哈拉佩尼奥辣椒。
方案
1. 使用无菌粘性胶带进行表面取样
- 选择一种用于取样的胶带。市面上可购买的 Fungi-Tape 或 Con-Tact-It 取样胶带为无菌包装，使用方便。然而，我们发现普通的透明（光学清晰）办公胶带也可使用。
- 使用永久性记号笔在一段 10 cm 长的粘性胶带非粘性面绘制 1 cm2 的方格（可使用纸质模板）。这将作为视觉参考，用于标记胶带上用于取样食品或环境表面的具体区域。
- 将胶带弯成“C”形环状，使粘性面朝向待取样表面。操作时，用拇指和中指捏住胶带两端的粘性部分，并将食指抵在胶带背面（非粘性面）所绘制的方格位置上（图 1）。
- 将胶带贴至待取样表面，轻压标记区域使其与表面接触。在不松开胶带边缘的前提下，用食指确保胶带的粘性面完全贴合样品表面，避免产生气泡。
- 以均匀的动作缓慢将胶带从样品表面揭下，从而物理性地提取附着于表面的微生物。使用普通透明办公胶带将已附着细胞的胶带（粘性面向上）固定于玻璃显微镜载玻片上。确保胶带张力/拉伸适当，形成平整、无皱褶的表面，以减少后续杂交过程中加热时胶带变形或卷曲的问题。
2. 固相富集与液体表面微培养
- 通过将胶带采样面朝下放置于木糖-赖氨酸-特吉托尔4（XLT-4）琼脂平板上，使所采集的细胞直接接触琼脂表面，从而实现固相富集。将胶带上带有模板/样本接触区域平整贴合于琼脂表面，并将胶带一端松散地粘附在培养皿侧壁上，以便在富集完成后易于从琼脂表面取下胶带。
- 将平板倒置（以避免冷凝），在35 - 37°C下培养，以促进 Salmonella spp. 的充分生长。所需培养时间取决于初始 Salmonella 污染水平。我们观察到，在低初始接种量条件下，经过8小时富集后可获得良好的微菌落形成。
- 在完成所需富集时间后，打开琼脂平板。胶带在培养过程中仍保持粘性。使用食指轻轻按压胶带，使其与琼脂充分接触，以最大限度回收在胶带-琼脂界面形成的微菌落。从粘附于培养皿壁边缘处抓住胶带，以缓慢而均匀的动作将其取下。按照上文第1.5节所述方法，将带有细胞的胶带（粘性面向上）固定于显微镜载玻片上。随后进行下文“固定与脱水”步骤。
- 对于液体表面微培养，首先按照上文第1.5节所述方法，将用于采样的胶带固定在显微镜载玻片上。接着，用一个非无菌的硅胶灌流室（Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.）覆盖胶带上带有模板/样本接触区域，形成一个密封腔室，其底部由朝上的带细胞胶带构成。用力但轻柔地压紧灌流室，确保形成防水密封。
- 使用柔性凝胶加样枪头，通过灌流室的一个小进样口转移 ≤ 500 μL 胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soy Broth）或其他合适的富集培养基。用透明办公胶带密封两个进样口，防止蒸发，并根据需要在35 - 37°C下培养载玻片。尽管所有操作均应遵循良好的采样与处理规范，但在液体表面微培养过程中，进样口密封胶带或灌流室无需无菌。结合荧光原位杂交（FISH）与流式细胞术，可有效区分样本中存在的 Salmonella spp. 与非目标细菌，其中非目标菌群的主要来源预期为样本本身。随后进行下文“固定与脱水”步骤。
3. 固定与脱水
- 对于在XLT-4琼脂上对Salmonella spp.进行直接表面取样或固相富集，将500 μL 10%中性缓冲甲醛溶液覆盖于样品接触区域，在25°C条件下进行30分钟的膜上细胞固定。
- 将固定液弃入可密封容器中（在化学通风橱内操作，以尽量减少接触刺激性/有毒蒸气）。
- 用乙醇梯度（50%、80% 和 95%；每种浓度各300 μL，3分钟）进行脱水。随后进行下文的“杂交”步骤。
- 对于500 μL液体表面微培养样品的固定，打开灌流室密封，使用柔性加样凝胶移液吸头提取富集液。通过快速反复吹打，以确保有效去除残留于膜上的细胞。
- 接着，将全部500 μL微培养液转移至微量离心管中，在2,000 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，剧烈涡旋振荡沉淀30–60秒，然后用等体积的10%中性缓冲甲醛溶液重悬。细胞在25°C条件下固定30分钟。
- 随后，去除固定液，并按以下步骤将样品重悬于细胞保存缓冲液中：将样品在2,000 × g条件下离心5分钟（25°C），弃去上清液，剧烈涡旋振荡沉淀30–60秒，然后用等体积的50%未变性乙醇-50%磷酸盐缓冲液重悬。固定后的细胞可在-20°C下长期保存（数年）。注意：每次更换液体（例如加入固定液或不同缓冲液）时，务必用少量“即将移除”的液体系统（约10–20 μL）充分重悬（通过涡旋）细胞沉淀，这有助于防止细胞聚集，确保获得均匀的单细胞悬浮液。随后进行下文的“杂交”步骤。
4. 杂交
- 使用材料表中注明的商用分子生物学级溶液配制杂交/洗涤缓冲液。缓冲液终浓度为 0.7 M NaCl、0.1 M TRIS [pH 8.0]、10 mM EDTA、0.1% 十二烷基硫酸钠，用分子级水定容至所需体积，并通过一个 0.22 μm 注射器或杯状滤器。使用不含探针的相同缓冲液（见下文）作为洗涤缓冲液。将杂交和洗涤缓冲液预热至 55°C.
- 加入荧光标记的 Sal3（Nordentoft） 等，1997；5'- AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3') 和 Salm-63 (Kutter 等，2006；5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3'）寡核苷酸探针（材料表）加入预热的杂交缓冲液中。探针总浓度为 5 ng μL-1 用于（例如 2.5 ng） μL-1 每种探针；Bisha 和 Brehm-Stecher，2009a)
- 对于直接上样至胶带和固相富集样品，将模板化样品的胶带接触区域覆盖 300 μL 含探针混合物的杂交缓冲液，并将带有细胞的胶带置于湿润、密封的孵育 chamber 中孵育，温度设定为 55°C若使用直接接触式孵育仪（如Slide Moat仪器，见材料表），样本孵育15分钟 >可同时处理20张载玻片。若使用旋转式杂交炉（如Bambino仪器，见材料表），则将载玻片置于50 mL聚丙烯离心管中进行杂交，每管放置一张载玻片。由于热量传递非直接接触，此类样品需延长杂交时间（最长可达30分钟）。
- 杂交完成后，取出玻片，弃去含有探针的杂交缓冲液覆盖层。随后，将预热的洗涤缓冲液少量滴加在倾斜的玻片表面，轻轻快速冲洗玻片（共冲洗3次，每次 300 μL 每个），或用预热的洗涤缓冲液覆盖进行正式洗涤（最长30分钟），或将样本浸入含有预热洗涤缓冲液的50 mL聚丙烯离心管中进行正式洗涤。根据我们的经验，尽管正式洗涤可获得更佳结果（减少未结合探针造成的背景模糊），但简单的冲洗已足以清晰检测到目标信号 沙门氏菌 spp. 接着，将玻片晾干，然后进入下述“检测”步骤。
- 液态表面微培养样品的杂交通过离心样品（ freshly-fixed 或保存于 -80 °C 储存缓冲液中的样品）进行20°C) 2,000 × g 离心 5 分钟，随后剧烈涡旋振荡沉淀，并重新悬浮于 100 μL 预热的杂交缓冲液（含探针混合物）中。样品在 55°C 在加热模块或其他合适的孵育装置（材料表）上孵育30分钟，随后加入 500 μL 预热的洗涤缓冲液。与使用胶带固定的样本一样，这些样本可进一步在其中正式洗涤长达30分钟，并继续孵育。 55°C 在此洗涤缓冲液中，间歇性涡旋振荡。或者，可在加入后对样品进行充分涡旋振荡。 500 μL 预热的洗涤缓冲液洗涤，随后立即收集用于分析（见下文）。
- 在进行检测之前 沙门氏菌 spp. 通过流式细胞术检测时，将液体表面微培养样品在2,000 × g离心5分钟，弃去上清液，将样品重悬于 300 μL 室温（~25°C) PBS。如果样本需要运送到较远的设施，或预计杂交与分析之间存在延迟，则可在分析前将样本冷藏或置于冰上保存。或者，可将样本转移至细胞保存缓冲液（PBS与无水乙醇按50:50体积比混合）中，并在-20°C 长达一周时间内，探针赋予的荧光信号无明显损失（Bisha 和 Brehm-Stecher，2009b）。
5. 检测
- 通过荧光显微镜对胶带上的 Salmonella spp. 进行检测时，将直接上样至胶带或固相富集后的样本覆盖约 10 μL 含有核复染剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 Vectashield H-1200 封片介质，加盖盖玻片后避光孵育 10 分钟。
- 在盖玻片上滴加镜油，使用高倍油镜（63x 或 100x）观察样本。先用 DAPI 滤光片将样本调至焦点，然后切换至相应滤光片（绿色或红色，取决于探针末端标记所用染料），根据荧光信号在显微镜下目视判读 Salmonella 细胞（图 2 和图 3）。
- 对于液体表面微培养样本的流式细胞检测，可根据本地设备条件选择不同仪器。在本实验室中，将 PBS 悬浮的样本转移至 5 mL 圆底流式管（BD Falcon），使用激发波长为 647 nm 的 FACSCanto 流式细胞仪进行检测（材料表）。对于含有大量总细菌的富集样本，采用“低流速”模式（10 μL min-1），采集 5,000–50,000 个事件。数据使用 FlowJo 软件（版本 8.8.6，Tree Star, Inc., Ashland, OR）或其他合适的分析软件进行分析（图 4，A 和 B 面板）。
6. 代表性结果
图1. 使用胶带从人工污染的番茄表面采样沙门氏菌属（Salmonella spp.）。
图2. 直接采样至胶带及FISH检测的典型结果 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 在番茄表面的图像（100倍油镜物镜）。 使用两种探针混合物（Sal3/Salm-63，均用Texas Red标记）对这些细胞进行标记。
图3. 微菌落的 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028在XLT-4琼脂表面经8小时原位富集后形成 37°C. 初始接种物取自人工污染的番茄表面。固相富集可增加可用于检测的细胞数量，同时增强细胞的rRNA含量。
图4. 使用胶带进行取样 S. enterica 血清型Typhimurium从人工污染的番茄表面分离，随后通过FISH和流式细胞术直接分析（图A），或在灌流室中经5 h非选择性液体表面微培养增菌后分析 500 μL 胰蛋白胨大豆肉汤（B组）
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讨论
在农产品表面快速、简便地检测病原体的方法有助于通过提供及时且可操作的数据来减轻食源性疾病。自20世纪50年代以来，基于粘性胶带的采样方法已广泛应用于环境、临床和食品微生物学领域，其操作包括将“透明胶带”类胶带按压至表面以采集微生物，随后进行直接显微镜检查，或将附着的微生物转移至固体培养基进行培养（Barnetson）。 & Milne，1973；Edwards & 哈特曼，1952；埃文乔 等，2001；Fung 等，1980；Lakshmanan & Schaffner，2005；Langvad，1980）。最近的一项改进描述了基于胶带的采样与荧光技术的结合 原位 杂交（FISH）技术用于无培养条件下分析定植于石质纪念碑表面的微生物（La Cono & C. Urzì，2003）。我们已采用类似方法用于快速采样和检测 沙门氏菌 存在于新鲜农产品上，包括番茄、菠菜和哈拉佩尼奥辣椒（Bisha 和 Brehm-Stecher，2009a）。可使用粘性胶带从这些食品上剥离细胞，随后对样品进行荧光原位杂交处理，并通过荧光显微镜观察。通过这种...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作的经费由授予BFBS的爱荷华州发展基金提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 真菌-胶带采样胶带 | 科学仪器实验室 | 745 | http://www.scientificdevice.com/ |
| Con-Tact-It 采样胶带 | Birko 公司，丹佛，科罗拉多州 | http://www.birkocorp.com/ | |
| 透明办公胶带，通用 | 各种 | 应为光学透明，且具有低自发荧光 | |
| 食品表面 | 本地杂货店 | 番茄–s（红色番茄）–藤上成熟的（未打蜡或涂油）果实，此处使用 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Difco 实验室 | 211768 | 用于非选择性液体表面微培养富集 |
| 木糖-赖氨酸-吐温40琼脂基础 | Difco 实验室 | 223420 | 对于 沙门氏菌选择性琼脂（XLT-4） |
| 木糖-赖氨酸-吐温40琼脂补充剂 | Difco Laboratories | 235310 | 对于 沙门氏菌-选择性琼脂（XLT-4） |
| 甲醛溶液 | Sigma-Aldrich | HT5011 | 10% 溶液，中性，缓冲（细胞固定剂） |
| 无水乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 分子生物学级（杂交前脱水） |
| 1.5 ml 微量离心管 | 各种 | 无RNase和DNase | |
| 显微镜载玻片和盖玻片 | 赛默飞世尔科技公司 | ||
| NaCl 溶液 | Sigma-Aldrich | S5150 | 分子生物学级，5 M 溶液（杂交缓冲液组分） |
| Tris-EDTA缓冲液（100倍浓缩液） | Sigma-Aldrich | T9285 | 1M Tris [pH 8.0]，0.1M EDTA（杂交缓冲液组分） |
| 十二烷基硫酸钠溶液 | Sigma-Aldrich | L4522 | 18兆欧水中的10%溶液（杂交缓冲液组分） |
| Sal3 和 Salm-63 寡核苷酸探针 | Integrated DNA Technologies | 5’用6-羧基荧光素（FAM）或德克萨斯红（Texas Red，用于显微镜）或Cy5（用于流式细胞术）标记，经HPLC纯化 | |
| 可变速度微型离心机 | 各种 | 使用转子直径计算达到方案中所述相对离心力（RCF）值所需的转速（RPM） | |
| CoverWell 灌注室 | Grace Bio-Lab 公司 | PC1R-2.0 | 非无菌 |
| 凝胶上样移液器吸头（FS MultiFlex） | 赛默飞世尔科技公司 | 05-408-151 | 细长探头，便于轻松进入小型采样口，并可在腔室内灵活操作 |
| 铝制加热块或精密控温加热站 | 各种 | Eppendorf Thermomixer R 干式温控振荡混匀仪 | |
| Bambino mini 杂交炉 | Boekel Scientific | Model 230300 | 载玻片置于50 ml聚丙烯离心管中进行杂交，采用间接传热而非直接加热 |
| 滑动式护城河杂交仪 | Boekel Scientific | Model 240000 | 通过玻片快速直接传递热量 |
| Vectashield H-1200 封片剂，含 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Vector Laboratories | H-1200 | 最大限度减少显微镜观察过程中荧光的淬灭，提供 DAPI 复染 |
| 荧光显微镜 | 各种 | 此处使用的 Leitz Laborlux S | |
| 数码相机 | 各种 | 此处使用的佳能 PowerShot A640 相机 | |
| 图像采集软件 | 各种 | 使用 Axiovision 软件 v. 4.6 (Carl Zeiss) | |
| Adobe Photoshop | Adobe | 用于图像的最小化处理（不同通道拍摄图像的叠加） | |
| 流式细胞仪 | 各种 | FACSCanto 流式细胞仪（BD Biosciences，美国加州圣何塞），使用红色（647 nm）激发光 | |
| 流式细胞术分析软件 | 各种 | 使用 FlowJo 软件 v. 8.7.1（Tree Star, Inc.） |
参考文献
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
- Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.
- Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
- Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
- Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Pouch Downes, F., Ito, K. , 4th edition, American Public Health Association. Washington, D.C. (2001).
- Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
- Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
- La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
- Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
- Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
- Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).
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