胶粘剂基于磁带的采样和荧光组合原位杂交快速检测沙门氏菌新鲜农产品

Summary

本协议描述了简单的基于磁带的粘合剂为番茄等新鲜农产品表面取样的方法，全细胞快速检测沙门氏菌用荧光原位杂交（FISH）。

Abstract

本协议描述了一个简单的基于磁带的粘合剂番茄等新鲜农产品表面取样的方法，沙门氏菌快速培养独立检测原位杂交（FISH） 技术在磁带上的荧光。细胞收取磁带也可以正面朝下放置在选择性琼脂固相富集前检测。另外，小批量的液体浓缩（液体表面miniculture）上可以执行的磁带表面，其次是鱼，并通过流式细胞仪分析，在非选择性的肉汤。首先，无菌胶带带来接触到新鲜农产品，应用温和的压力，并删除磁带，身体中提取这些表面上的微生物。磁带安装到玻璃显微镜玻片上粘端和采样细胞固定，10％的福尔马林（30分钟），脱水梯度乙醇系列（50，80，和95％;每个浓度3分钟）。下一步，细胞电磁带发现含有沙门氏菌针对性的DNA探针鸡尾酒缓冲区和杂交为15 - 30分钟，在55℃，其次是在洗涤液去除未结合的探针的一个简短的冲洗。贴壁，鱼标记的细胞，然后counterstained DNA染料4',6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI）的结果与用荧光显微镜观看。固相浓缩，细胞带电磁带正面朝下放置在一个合适的选择性琼脂表面，培养沙门氏菌 microcolonies鱼和显微镜如上所述，允许在原位生长。液体表面miniculture，细胞带电磁带放置粘边和硅胶灌注室应用，使磁带和显微镜幻灯片的形式融入其中一个防水室底部的胰酪胨大豆体积小（≤500微升）肉汤（TSB）的介绍。密封进气道和商会孵育在35 - 37℃，允许的磁带中提取的微生物的增长为基础的放大。潜伏期之后，进气道被启封，细胞分离和混合大力回来回移液，通过离心收获并固定在10％中性缓冲福尔马林。最后，样品杂交，并通过流式细胞仪检测， 以揭示沙门氏菌的存在。这里描述的，我们的"大盘鱼"的做法可以提供番茄表面的简单和快速采样和检测沙门氏菌。我们也用这种方法进行取样其他类型的新鲜蔬菜，包括菠菜和墨西哥辣椒。

Protocol

1。表面取样用无菌胶带

1. 选择磁带使用采样。市售真菌磁带或Con轻触采样磁带无菌和易用性，特殊包装。然而，我们发现也可用于透明（透明）通用办公磁带。
2. 使用永久性记号笔画出1厘米²广场上的胶带10厘米的片（一纸模板可用于）非粘性的一面。这将作为一个注意到的磁带部分已用于样品的食物或环境表面的视觉引导。
3. 形成一个"C"形循环的磁带，粘方面临的表面进行采样。要做到这一点，对磁带的背面（非粘性的一面）（图1）的正方形，用拇指和中指和食指的位置举行的粘性末端。
4. 放置在磁带表面进行采样，并轻轻按压表面对标记的区域。不释放磁带的边缘，用食指，以确保磁带的粘端与样品表面的充分接触，避免气泡。
5. 使用更议案，慢慢拉磁带远离样品，身体表面结合的微生物提取。法尔胜细胞电胶带，粘边，使用通用透明办公磁带到玻璃显微镜幻灯片。确保适当的张力磁带/伸展，平坦，不皱面，使创建。这将有助于减少变形/磁带卷曲在随后的加热过程中杂交问题。

2。固相浓缩和液体表面Miniculture

1. 固相富集朝下放置磁带木糖赖氨酸TERGITOL 4（XLT - 4）琼脂平板上，使采样细胞在琼脂表面的直接接触。磁带的接触部分模板/样本被置于与琼脂表面和磁带的一端平齐的是松散地坚持培养皿的侧墙，以方便磁带容易去除琼脂表面以下浓缩。
2. 倒板（以避免水汽凝结），孵育35 - 37 ° C至允许沙门氏菌足够的增长。需要丰富的细胞可检测水平的潜伏期的长短将取决于最初的沙门氏菌污染水平。我们观察到从低初始接种后8小时浓缩优秀microcolony形成。
3. 所需的浓缩铀期后，开放的琼脂平板上。磁带将保留其孵化过程中的粘性。轻轻按下磁带对琼脂，用食指，以确保在磁带琼脂界面形成microcolonies的最大恢复。从附着到培养皿壁的边缘抓住磁带和一个缓慢的，甚至动议删除。装载到载玻片的细胞收取的胶带，粘边，上文第1.5节所述。继续以"固定和脱水"一步。
4. 对于液体的表面miniculture，开始固定到载玻片采样上文第1.5节所述使用的磁带。下一步，包括磁带的模板/样本接触与非无菌硅胶灌注室（Coverwell，格雷斯生物实验室公司）的部分，形成一个密封腔，其底部是由细胞电磁带，朝上。牢固，但轻轻按入到位室，以确保防水密封。
5. 使用灵活的凝胶装载枪头，转移≤500μL胰酪胨大豆肉汤或其他合适的浓缩液通过商会的小进气道。透明办公胶带密封两个端口，以防止蒸发和孵化的幻灯片，在35 -37 ° C的需要足够的浓缩铀。虽然所有操作应根据良好的采样和处理方法，不育的端口密封胶带或灌注井不需要在液体表面miniculture。鱼和流式细胞仪的结合，将使沙门氏菌明确的歧视。从非目标细菌可能存在与预期来自样品本身的非目标植物的贡献最大，。继续以"固定和脱水"一步。

3。固定和脱水

1. 对于直接表面取样或固相富集沙门氏菌 。 XLT - 4琼脂培养基上，进行磁带上的细胞固定在25分钟30 °彗星样本的接触面积覆盖500μL，10％中性福尔马林。
2. 丢弃到一个密封的容器（下化学罩，以尽量减少接触刺激性/有毒蒸气）的固定液。
3. 脱水乙醇（50％，80％和95％;每个浓度300μL/ 3分钟）。继续进行"杂交"的步骤下面。
4. 500μL液体表面miniculture样品固定S，灌注商会启封，和一个灵活的凝胶装枪头是用来提取enrichate。用于快速向上和向下吹打，以帮助确保有效去除任何剩余磁带绑定细胞。
5. 接下来，整个500μLminiculture量转移到离心管和纺2,000 XG（5分钟）。丢弃上清液，沉淀振荡大力30-60小号，然后悬浮在同等体积的10％中性缓冲福尔马林。细胞是固定的25 ° C时为30分钟
6. 接下来，固定液和样品悬浮细胞存储缓冲区，如下所示。该样本是2,000 XG（5分钟，25 ° C）被丢弃上清液，沉淀是振荡30大力 - 60秒，在同等体积的50％的非变性乙醇50％的重悬于磷酸盐降速，缓冲液。固定细胞，可以无限期地储存在-20 ° C（年）注:每当液体被改变（例如，当引入固定液或不同的缓冲区），重要的是彻底重悬（震荡）在一个最小的部分的细胞沉淀（约10 - 20μL）"传出"液体系统。这将有助于防止结块，并确保获得，甚至单个细胞悬浮液。继续进行"杂交"的步骤下面。

4。杂交

1. 准备杂交/洗涤缓冲液使用的商业分子生物学级解决方案在材料表中注明。最后的缓冲组件的浓度为0.7 M氯化钠，0.1中号的TRIS pH值8.0，10 mM的EDTA，0.1％十二烷基硫酸钠，分子级的水和使用0.22微米的注射器或一杯过滤筛选，最终所需的量。使用相同的缓冲区，没有探头（见下文）此外，作为洗涤液。预热杂交和洗涤缓冲液至55 ° C。
2. 加入荧光标记的Sal3（Nordentoft 等，1997; 5' -亚洲空运中心CAC TTC ACC交咨会的GTG - 3'）的Salm - 63（Kutter 等，2006; 5' - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3" ）寡核苷酸探针（材料表）预热杂交缓冲。一个5毫微微升^-1的总探针浓度（如2.5毫微^微升 -1每个探头;碧沙和布雷姆-施特彻，2009A） 。
3. 对于直接到磁带和固相浓缩样本，覆盖300μL杂交缓冲区包含探头鸡尾酒磁带的模板样本的接触面积，并在潮湿，密封的孵化室设置为55 ° C杂交磁带势必细胞如果直接接触的孵化器如幻灯片护城河仪器（材料表）用于杂交，样品为15分钟，可以同时处理> 20张幻灯片。如果一个小孩的仪器（材料表），如旋转式杂交炉，幻灯片置于50 mL聚丙烯离心管中进行杂交，每管幻灯片。由于不是直接传热，这些样品是杂交更长的时间（最多30分钟）。
4. 杂交之后，被删除的幻灯片和含探针的杂交缓冲覆盖被丢弃。幻灯片然后预热洗涤液覆盖或预热洗涤液冲洗简单地，轻轻地吹打在一个倾斜的幻灯片（3 300μL，每冲洗）体积小的缓冲，或正式洗净（最多30分钟）浸泡在含有预热洗涤液50 mL聚丙烯离心管。根据我们的经验，虽然正式洗会提供更好的结果（未结合的探针阴霾），一个简单的冲洗是足够明确的检测沙门氏菌 。下一步，幻灯片移动到下面的"检测"步骤之前，空气干燥。
5. 纺纱2000 XG 5分钟的样品（新鲜固定或存储缓冲区保存在-20 ° C）是由液体表面miniculture样品的杂交，大力振荡的沉淀和再悬浮在100μL预热的杂交含有缓冲区探头的鸡尾酒。样品进行杂交，在55 ° C为30分钟加500μL预热的洗涤液，在热块或其他合适的孵化站（材料表）。用胶带绑定的样品，这些样品可能是正式洗进一步孵化到30分钟，55 °在这个间歇振荡的洗涤缓冲液，C。此外，样品可能会彻底振荡后加入500μL预热的洗涤液，立即进行分析收获（下图）。
6. 在沙门氏菌检测的准备。通过流式细胞仪，液体表面miniculture样品纺在2000 XG 5分钟，取上清液丢弃，样品重悬于300μL室温（〜25 ° C）PBS。如果样品需要运输到遥远的设施，或延迟预期之间的杂交和分析，样品可冷藏或冰面上举行前以ANA裂解。此外，样品可能会转移到细胞储存的缓冲液（50:50 PBS和无水乙醇混合），在-20 ° C，没有明显的损失探头一个星期举行，赋予荧光（碧沙和布雷姆 - 施特彻，2009b） 。

5。检测

1. 磁带上的沙门氏菌的检测。通过荧光显微镜，直接到磁带或固体阶段浓缩样本覆盖〜10μLVectashield的H - 1200安装含有核染液4的媒介",6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI）的安装，盖玻片，然后在10分钟的黑暗孵育。
2. 浸油放在盖玻片，使用高倍率的油浸物镜（63X或100X）和样品检验。的DAPI过滤器是用来将成为关注的焦点样品，然后切换到适当的过滤器（绿色或红色，取决于结束标签的探头使用的染料）和沙门氏菌细胞显微镜取得视觉根据其荧光（图2和3）。
3. 液体表面miniculture样品的流式细胞仪检测，各种仪器可以使用，这取决于当地的可用性。在我们的实验室，PBS暂停样品转移到5 mL圆底采样管（BD猎鹰），并用一个FACSCanto流式细胞仪在647纳米（材料表）的激发。对于丰富的样品含有高数量的细菌总数，使用"低流量"设置（10μL ^分钟-1）和5,000-50,000事件收集。数据分析使用FlowJo软件（版本8.8.6，树星公司，亚什兰，或）或其他合适的分析软件（图4，面板A和B）。

6。代表性的成果

图1。胶带使用沙门氏菌抽样。从表面人为污染的番茄。

图2。直接到磁带的采样和一个西红柿的表面（100 ×油浸物镜）鱼鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028检测的典型结果。得克萨斯的两个探头鸡尾酒红色标记的探针（Sal3/Salm-63）标签，这些细胞。

图3。鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 Microcolonies木糖赖氨酸TERGITOL - 4（XLT - 4）琼脂表面上形成初始接种后8小时的磁带上浓缩在37 ° C是从人为污染的西红柿的表面采样。固相浓缩，增加检测细胞的数目，也增强了细胞的rRNA的内容。

图4。胶带使用S 的采样鼠伤寒沙门从表面通过鱼类和流式细胞仪（A组）或5 h的非选择性液体的表面，在与500μL，胰酪胨大豆肉汤（B组填补了灌注腔miniculture浓缩后直接分析，人为污染的番茄）。

Discussion

检测产生表面上的病原体的简单快速的方法可以帮助减轻食源性疾病，提供及时的和可操作的数据。胶粘剂基于磁带的抽样方法已用于环境，临床和食品微生物学自1950年以来涉及按下"苏格兰"式磁带的表面去除的微生物，由直接的微观考试或附着的微生物为固体介质转移增长（Barnetson和米尔恩，1973年，爱德华兹和哈特曼，1952年; Evancho等，2001;丰等，1980; Lakshmanan提供夏弗纳，2005年; Langvad，1980年） 。最近修改描述为独立的文化殖民石碑（香格里拉Cono＆C. Urzì，2003）表面的微生物分析相结合的基于磁带的采样与荧光原位杂交（FISH ）。我们有适用于快速采样和检测沙门氏菌的新鲜蔬菜，包括西红柿，菠菜和墨西哥辣椒（碧沙和布雷姆-施特彻，2009A）上的一个类似的方法。胶带可用于从这些食物样品中删除的单元格，然后可以处理鱼和通过荧光显微镜下观察。在这种方法可以检测，尽可能少的为10 ³ CFU厘米^-2 沙门氏菌 （显微镜为基础的方法检测限）〜...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
真菌胶带 采样胶带	科学设备实验室	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It 采样胶带	Birko Corporation， Denver， CO		http://www.birkocorp.com/
透明办公胶带，通用	各种		应光学透明，具有低固有荧光
食品表面	当地杂货店		托马特–s （红色 tomat–在藤蔓上，未打蜡或上油）此处使用
胰蛋白酶大豆肉汤	Difco Laboratories	211768	用于非选择性液体表面微型培养富
木糖-赖氨酸-Tergitol 4 琼脂基础	Difco Laboratories	223420	用于 沙门氏菌 选择性琼脂 （XLT-4）
木糖-赖氨酸-Tergitol 4 琼脂补充剂	Difco Laboratories	235310	For 沙门氏菌选择性琼脂 （XLT-4）
福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT5011	10% 溶液，中性，缓冲（细胞固定剂）
无水乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	分子生物学级（预杂交脱水）
1.5 ml 微量离心管	不含 RNase 和 DNase	的
显微镜载玻片和盖玻片	赛默飞世尔科技公司
NaCl 溶液	Sigma-Aldrich	S5150	分子生物学级，5M 溶液（杂交缓冲液组分）
Tris-EDTA 缓冲溶液（100X 浓缩液）	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0]，0.1M EDTA（杂交缓冲液组分）
十二烷基硫酸钠溶液	Sigma-Aldrich	L4522	10% 溶于 18 兆欧水中（杂交缓冲液）组分）
Sal3 和 Salm-63 寡核苷酸探针	集成 DNA 技术		用 6-羧基荧光素 （FAM） 或德克萨斯红（用于显微镜检查）或 Cy5（用于细胞分析）标记的 5'，HPLC 纯化
变速微量离心机	各种		使用转子直径计算方案中描述的 RCF 值所需的 RPM
CoverWell 灌注室	Grace Bio-Lab， Inc.	PC1R-2.0	非无菌
凝胶上样移液器吸头 （FS MultiFlex）	Thermo Fisher Scientific， Inc.	05-408-151	长而细的尖端，便于访问小采样端口和腔室内的可作
性 铝制加热块或精确控制的加热站	各种		Eppendorf Thermomixer R 干块加热和冷却摇床
Bambino 迷你杂交炉	Boekel Scientific	型号 230300	载玻片放入 50 ml 聚丙烯离心管中进行杂交，不传热直接
载玻片护城河载玻片杂交器	Boekel Scientific	Model 240000	通过载玻片提供快速、直接的热量传递
Vectashield H-1200 封固剂含 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）	Vector Laboratories	H-1200	最大限度地减少显微镜检查过程中的荧光淬灭，提供 DAPI 复染
荧光显微镜	各种		这里使用的 Leitz Laborlux S
相机	这里使用的各种		佳能 PowerShot A640 相机 图像
采集软件	各种		Axiovision 软件 v. 4.6 （Carl Zeiss） 使用
Adobe Photoshop	Adobe		用于图像的最小处理（在不同通道中拍摄的图像叠加）
流式细胞仪	各种		使用红色（647 nm）激发的FACSCanto流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA）
式细胞术分析软件	各种		FlowJo软件v.8.7.1（Tree Star，Inc.）