表达GFP的小鼠胚胎器官型切片培养用于外周神经突起实时成像

摘要

我们介绍一种制备中期妊娠小鼠胚胎的器官型切片的方法，用于外周神经突起的培养和延时成像。

摘要

出于多种目的，小鼠胚胎的培养 离体 作为器官型切片是可取的。例如，我们采用一种转基因小鼠品系（tauGFP) 其中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）特异性表达于发育中的中枢和周围神经系统的所有神经元中¹，从而能够对前肢的神经支配过程进行活体成像，并利用药理学和遗传学手段对该过程进行干预和调控²成功培养此类脑片培养物最关键的参数在于脑片的制备方法。经过对多种方法的广泛测试，我们发现，使用振动切片机（vibratome）是切割胚胎的最佳方式，该方法能够常规地获得可在数天内保持活性的培养物，更重要的是，组织能够以符合特定发育阶段的方式正常发育。对于中期妊娠胚胎而言，这包括脊神经从脊髓和背根神经节正常延伸至外周靶组织，以及骨骼和肌肉组织的正确分化。

本研究介绍了一种将胚胎发育第10至12天（E10至E12）的完整胚胎加工成300至400微米厚切片的方法，这些切片可在标准组织培养孵育箱中培养，并在切片制备后持续观察长达两天。该方法成功的关键在于使用振动切片机对包埋于琼脂糖中的胚胎进行切片。随后将切片置于Millipore培养膜插入物上，并使其接触少量培养基，从而实现界面培养技术。一窝平均7个胚胎通常可获得至少14个切片（每个胚胎可获得2至3个前肢区域切片），具体数量因胚胎年龄及切片厚度略有差异。约80%的培养切片可观察到神经突起生长，可在整个培养期间进行测量²。本文展示了利用tauGFP小鼠品系获得的代表性实验结果。

方案

第1部分：切片与培养的准备工作。

1. 准备10 cm组织培养皿，加入切片培养基（DMEM、25% 1×HBSS、25%胎牛血清、0.5%葡萄糖、1 mM谷氨酰胺、2.5 mM HEPES，pH 7.3），并放入3 cm Millicell-CM 0.4-μm培养膜插件，置于37°C、5% CO₂培养箱中备用。
2. 将4%低熔点琼脂糖在PBS中用微波炉加热溶解，随后置于加热板上保温，使其温度维持在约37°C。
3. 在10 cm细菌培养用培养皿中加入PBS（140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄），并置于冰上冷却。
4. 设置好切片机冷却装置，或确保缓冲液托盘和冷却元件已预先存放在冰箱中进行预冷。

第2部分：胚胎包埋。

1. 从子宫中分离胚胎，并使用倒置荧光显微镜观察胚胎以检测 GFP 表达情况。
2. 将胚胎置于倒置的 10 cm 培养皿中，并用 Whatman 滤纸条调整胚胎位置，以去除多余的 PBS。
3. 在胚胎上覆盖琼脂糖，使其固定在此位置，待琼脂糖凝固。
4. 用刀片切割周围区域，限定胚胎周围的范围。
5. 将包埋的胚胎翻转至另一侧。
6. 在胚胎组织上添加额外的琼脂糖，确保胚胎完全包埋。
7. 修整琼脂糖块使其边缘平整，然后使用 Loctite 406（一种类似于“Krazy Glue”的特殊胶水）将其固定在振动切片机的卡盘上。

第3部分：切片操作步骤。

1. 安装预冷的缓冲液托盘和冷却元件。
2. 插入带有粘附组织的样品头，并加入1×HBSS（无Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS，10 mM HEPES缓冲液，pH 7.3，500 U/ml青霉素/链霉素），直至完全覆盖组织。
3. 安装并固定已预先清洁（70%乙醇）的切片机刀片。
4. 制备350–450 μm的组织切片，并使用截短的玻璃巴斯德吸管将切片转移至置于冰上的组织培养板中。
5. 使用一对镊子小心地从每一片切片上去除琼脂糖，并将其转移至Millicell培养膜上。每个10 cm组织培养板中加入6 mL培养基，其上的一个培养膜可培养约4片切片。
6. 将切片在37°C和5% CO₂条件下孵育（培养基：DMEM，25% 1×HBSS，25%胎牛血清，0.5%葡萄糖，1 mM谷氨酰胺，2.5 mM HEPES，pH 7.3）。若进行延时成像系列实验，应保持培养基体积恒定。若仅进行短时间的定时成像，可维持原有培养基不变；对于较长时间的培养，建议在12–20小时后更换培养基。

第4部分：在显微镜下成像脊神经的轴突生长。

1. 将含有脊髓神经切片的Millipore培养膜置于10 cm的组织培养皿中，并将其放置在直立式荧光显微镜下，对脊髓神经进行成像。
2. 在显微镜载物台上标记Millipore培养膜的方向，以便在下一次成像时间点能够正确放置。
3. 使用4倍（数值孔径[NA] 0.1）、10倍（NA 0.3）或20倍（NA 0.5）物镜对脊髓神经的轴突发芽进行成像。

图1显示了在4倍和10倍物镜下培养20小时期间脊神经突起生长的成像序列。

图1 纯合tauGPF胚胎横切面中脊神经外延生长的成像序列。* = 脊髓腹侧的运动神经元，箭头 = 背根神经节（DRG）。图中显示了切片的背侧（D）-腹侧（V）轴。比例尺：200 μm。

讨论

在对制备中期妊娠小鼠胚胎（E10 - E12）脑片培养方法的广泛比较中，我们观察到，无论从整体培养物的存活率还是神经突起生长模式的可重复性来看，使用振动切片机（vibratome）均无疑能获得最可靠的结果。相比之下，采用McIlwain组织切片器制备的脑片完全无法存活³。我们最初曾使用一种斩切法⁴，即通过将钨丝依次缠绕在切割格栅上，同时对一整窝胚胎进行切片，以获得400-μm厚的切片¹。尽管该方法具有制备速度快的优点，但每个胚胎最多仅能得到一个可存活的切片，且神经突起生长参数存在较大变异。基于上述原因，我们认为尽管振动切片法制备耗时较长，但仍为更优选择。尽管该方法必须依赖振动切片机，但其结果远优于其他“低技术”手段，因此该设备的投入是合理的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HBSS 10倍浓缩液	GIBCO, by Life Technologies	14180
解剖工具	Fine Science Tools	多种
低熔点琼脂糖（L.M.P. agarose）	Invitrogen	15517-022
沃特曼滤纸（Whatmann paper）	Whatman, GE Healthcare	3030917
短头火焰抛光移液管
DMEM培养基	GIBCO, by Life Technologies	41966
胎牛血清（FBS）	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
青霉素-链霉素双抗溶液（Pen Strep）	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-谷氨酰胺 100倍浓缩液	GIBCO, by Life Technologies	25030
振动切片机（Vibratome）	Microm International	HM 650 V
荧光显微镜	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS 软件	Soft Imaging System
Millicell-CM 细胞培养小室插件	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm 细胞培养皿	Greiner Bio-One	633171
乐泰 406 瞬干胶（LOCTITE 406）	Henkel Corp	142580
剃须刀片	Thermo Fisher Scientific, Inc.	无
体视显微镜	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES 缓冲液	Carl Roth Gmbh	9105.2
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
×4 物镜	Olympus Corporation	PL 系列
×10 物镜	Olympus Corporation	UPLFL –PH 系列
滤光片	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD 相机	Soft Imaging System	SIS F-View II
加热培养室设备	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 和培养箱 S #11531171