高效且可靠的实验方法 体外 在培养的人胚胎肾细胞（HEK-293T）中表达重组电压门控离子通道并进行后续电生理记录
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摘要
摘要
该 体外 在培养的人胚肾细胞（HEK-293T）中表达重组电压门控离子通道并进行电生理记录是一种广泛使用的科研策略。为进行不受邻近细胞接触干扰的电生理记录，必须将HEK-293T细胞以足够低的密度接种于玻璃盖玻片上，使其彼此不发生接触。此外，转染的离子通道必须在细胞质膜上高效表达，以便在全细胞膜片钳记录中检测到显著高于噪声水平的电流信号。异源表达的离子通道通常需要在转染后于28°C下长时间孵育，才能实现足够的膜表达；然而，该温度下细胞与盖玻片的黏附性及膜稳定性会逐渐下降。为克服这一问题，我们开发了一种优化的HEK-293T细胞转染与接种策略。该方法要求细胞在相对较高的汇合度下进行转染，并在转染后于28°C孵育不同时间，以促进离子通道蛋白的充分表达。随后将转染后的细胞接种至玻璃盖玻片上，并在37°C孵育数小时，以实现细胞与盖玻片的牢固黏附及细胞膜的重新稳定。细胞接种后可立即进行记录，也可转移至28°C继续孵育。我们发现，转染后、接种前在28°C的初始孵育阶段，对于通常难以在质膜上高效表达的异源离子通道而言，是实现其高效表达的关键步骤。转染成功的培养细胞可通过共表达的eGFP进行识别，eGFP可由双顺反子载体（如pIRES2-EGFP）表达，该载体在内部核糖体进入位点及eGFP编码序列的上游含有重组离子通道的cDNA。全细胞膜片钳记录需要专用设备，以及使用硼硅酸盐玻璃拉制抛光的记录电极和L形接地电极。研究离子通道药理学时，药物可通过微量移液直接加入记录皿中，或通过微灌流或重力驱动流系统，使药物溶液持续流经被记录细胞。
方案
1. 细胞培养
- 人胚胎肾293T细胞（HEK-293T，Invitrogen）在含6 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；Sigma Aldrich）的透气式25 cm2 培养瓶（经组织培养处理；Cellstar；greiner bio-one）中以贴壁单层形式培养，培养基中添加10% v/v 胎牛血清（FBS；Sigma Aldrich）、1% 丙酮酸钠和250 μg/mL 青霉素/链霉素，于37°C、5% CO2 条件下培养。
细胞在设定为37°C或28°C的CO2 培养箱（5% CO2）中孵育。所有细胞操作均在超净工作台中进行。
- 细胞通常每两周传代一次，从约90%融合度开始，周一按1:8比例稀释传代，周四按1:12比例稀释传代。（参见图1，了解不同接种密度下HEK-293T细胞的图像）
- 传代时，通过抽吸去除培养瓶中的培养基，然后将1 mL预热至37°C的胰蛋白酶溶液（Sigma Aldrich）加入倒置的培养瓶中，使胰蛋白酶覆盖细胞层。轻轻手动摇动培养瓶数次，使胰蛋白酶充分作用于贴壁细胞。随后迅速抽吸去除胰蛋白酶，并用移液器向瓶内加入250 μL胰蛋白酶，再次轻轻摇动，使溶液均匀覆盖细胞表面。
- 将培养瓶....
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讨论
能够使用所述方案和溶液记录到全细胞电流，表明转染成功，且目标电压门控离子通道或离子通道复合物已在细胞膜上以可观的量存在。如果细胞呈阳性转染（即呈现绿色荧光），但无法记录到电流，则可能需要延长在28°C的孵育时间，以使通道蛋白得以正确组装并插入细胞膜。需注意，长时间在28°C孵育会导致细胞从盖玻片上脱落，细胞膜稳定性下降，并积累死亡细胞的碎片，从而增加膜片钳记录的难度。本方案中建议的所有时间参数均针对我们研究的特定通道进行了优化。其他通道及其亚基可能需要更长或更短的孵育时间，可根据实际情况进一步调整本方案。对于某些通道而言，较低的转染效率（即荧光细胞较少且单个细胞荧光强度较低）反而比高效转染、高荧光强度的细胞获得更好的实验结果。若细胞具有荧光但无法记录到电流，可能的问题包括：缺乏辅助蛋白；转染试剂混合不充分；记录溶液非最适条件；或通道或通道亚基的cDNA构建体发生突变或重组，导致蛋白错误折叠或无法表达。
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致谢
本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）向 JDS 提供的发现基金运营资助、NSERC 亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金（博士阶段）（授予 A. Senatore）以及心脏与中风基金会资助项目（资助号：NA#6284）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pIRES2-EGFP 质粒 | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| 圆形玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-80 | 圆片编号1——厚度0.13至0.17毫米，尺寸：12毫米 |
| 放大器 | Axon Instruments | Axopatch 200B 或 Multiclamp 700B | |
| 数据采集系统 | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| 电生理学软件 | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| 移液器操作器 | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| 倒置荧光显微镜 | 卡尔·蔡司股份公司 | Axiovert 40 CFL | |
| 前置放大器 | Axon Instruments | CV-7B | |
| 头端电极夹 | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| 显微镜–接地电极用的电极夹 | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| 电生理学毛细管 | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | 含细丝硼硅酸盐玻璃管，外径1.5 mm，外径0.86 mm，长15 cm |
| 弗拉明/布朗微电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 微移液管火焰抛光仪 | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| 微型药物灌注系统 | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| 药物灌注系统 | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 配备聚四氟乙烯阀门 |
参考文献
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D.
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