优化的转染策略用于在HEK-293T细胞中表达及记录重组电压门控离子通道的电生理特性

摘要

高效且可靠的实验方法 体外 在培养的人胚胎肾细胞（HEK-293T）中表达重组电压门控离子通道并进行后续电生理记录

摘要

该 体外 在培养的人胚肾细胞（HEK-293T）中表达重组电压门控离子通道并进行电生理记录是一种广泛使用的科研策略。为进行不受邻近细胞接触干扰的电生理记录，必须将HEK-293T细胞以足够低的密度接种于玻璃盖玻片上，使其彼此不发生接触。此外，转染的离子通道必须在细胞质膜上高效表达，以便在全细胞膜片钳记录中检测到显著高于噪声水平的电流信号。异源表达的离子通道通常需要在转染后于28°C下长时间孵育，才能实现足够的膜表达；然而，该温度下细胞与盖玻片的黏附性及膜稳定性会逐渐下降。为克服这一问题，我们开发了一种优化的HEK-293T细胞转染与接种策略。该方法要求细胞在相对较高的汇合度下进行转染，并在转染后于28°C孵育不同时间，以促进离子通道蛋白的充分表达。随后将转染后的细胞接种至玻璃盖玻片上，并在37°C孵育数小时，以实现细胞与盖玻片的牢固黏附及细胞膜的重新稳定。细胞接种后可立即进行记录，也可转移至28°C继续孵育。我们发现，转染后、接种前在28°C的初始孵育阶段，对于通常难以在质膜上高效表达的异源离子通道而言，是实现其高效表达的关键步骤。转染成功的培养细胞可通过共表达的eGFP进行识别，eGFP可由双顺反子载体（如pIRES2-EGFP）表达，该载体在内部核糖体进入位点及eGFP编码序列的上游含有重组离子通道的cDNA。全细胞膜片钳记录需要专用设备，以及使用硼硅酸盐玻璃拉制抛光的记录电极和L形接地电极。研究离子通道药理学时，药物可通过微量移液直接加入记录皿中，或通过微灌流或重力驱动流系统，使药物溶液持续流经被记录细胞。

方案

1. 细胞培养

1. 人胚胎肾293T细胞（HEK-293T，Invitrogen）在含6 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；Sigma Aldrich）的透气式25 cm² 培养瓶（经组织培养处理；Cellstar；greiner bio-one）中以贴壁单层形式培养，培养基中添加10% v/v 胎牛血清（FBS；Sigma Aldrich）、1% 丙酮酸钠和250 μg/mL 青霉素/链霉素，于37°C、5% CO₂ 条件下培养。
   
   细胞在设定为37°C或28°C的CO₂ 培养箱（5% CO₂）中孵育。所有细胞操作均在超净工作台中进行。
   
   
2. 细胞通常每两周传代一次，从约90%融合度开始，周一按1:8比例稀释传代，周四按1:12比例稀释传代。（参见图1，了解不同接种密度下HEK-293T细胞的图像）
3. 传代时，通过抽吸去除培养瓶中的培养基，然后将1 mL预热至37°C的胰蛋白酶溶液（Sigma Aldrich）加入倒置的培养瓶中，使胰蛋白酶覆盖细胞层。轻轻手动摇动培养瓶数次，使胰蛋白酶充分作用于贴壁细胞。随后迅速抽吸去除胰蛋白酶，并用移液器向瓶内加入250 μL胰蛋白酶，再次轻轻摇动，使溶液均匀覆盖细胞表面。
4. 将培养瓶置于设定为37°C的CO₂ 培养箱中孵育3–5分钟，然后用移液管将细胞重悬于4 mL温热的完全DMEM培养基中。胰蛋白酶消化不完全或重悬不充分会导致细胞成团，可能引起细胞向上生长而非形成预期的单层。过度消化则可能损伤细胞。
5. 对于1:8传代，取500 μL细胞悬液加入含有5.5 mL DMEM的新培养瓶中；对于1:12传代（参见图1），取333 μL细胞悬液加入含有5.7 mL DMEM的新培养瓶中。轻轻混匀后，将培养瓶转移至37°C培养箱。传代后于37°C孵育3–4小时期间，细胞将逐渐沉降并贴附于瓶壁。细胞初始呈圆形，随后逐渐变扁平并伸出突起（伪足），贴附更加牢固（图1）。
   
   细胞应以可预测的方式形成贴壁单层生长。若细胞生长状态或形态异常或不一致，应考虑操作技术问题或污染（细菌/支原体）的可能性。成功的组织培养关键在于操作的一致性。
   
   

2. 使用重组离子通道 cDNA 转染 HEK-293T 细胞

1. 此处，各种离子通道的cDNA被克隆至pIRES2-EGFP质粒（BD Biosciences Clontech）中，该质粒可通过增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的荧光来识别成功转染的细胞。eGFP在转染细胞中由与克隆插入片段cDNA相同的转录本表达，翻译起始于插入cDNA下游、eGFP编码序列上游的内部核糖体进入位点（见图2）。图3展示了使用pIRES2-EGFP载体成功转染钙通道亚基的HEK-293T细胞的荧光图像。
2. 转染前，将完全汇合的培养瓶以1:4比例传代至新培养瓶中，并在37°C的CO₂培养箱中孵育3–4小时，使细胞贴壁（见图1）。
3. 细胞贴壁后，采用标准的磷酸钙转染方法（Cold Spring Harbor实验方案），将含有离子通道及其辅助亚基cDNA的构建体导入HEK细胞。通常每瓶/每次转染使用600 μL转染液中含有总共12 μg DNA。
4. 将转染液逐滴加入细胞后，将培养瓶置于37°C培养箱中过夜孵育。
5. 转染完成后，用预热的培养基或磷酸盐缓冲液（4–5 mL）小心清洗细胞三次：将洗涤液加入倒置的培养瓶中，然后缓慢将培养瓶翻转至直立位置，并轻轻摇晃，使洗涤液流过细胞表面。若操作不当，细胞可能脱落，三次洗涤后将所剩无几。重复洗涤两次后，向培养瓶中加入6 mL培养基，在37°C孵育2小时，随后转移至28°C培养箱中继续培养。
6. 转染后1至3天，可使用落射荧光显微镜确认pIRES2-EGFP构建体的转染是否成功。在紫外光照射下发出绿色荧光的细胞为成功转染细胞，应表达外源性离子通道蛋白和eGFP蛋白。

3. 为电生理记录准备转染的 HEK293T 细胞铺板

不同的离子通道在HEK细胞膜上的表达效率各不相同，因此本实验方案的后续步骤需要进行一定优化，以最大程度地提高通道在细胞表面的表达，从而实现成功的电生理记录。在HEK细胞中表达异源离子通道，特别是来源于非哺乳动物的通道，可能会面临一些挑战，包括：（1）蛋白质分子较大，翻译和定位至质膜所需时间较长；（2）通道蛋白上缺乏或存在与哺乳动物细胞系不匹配的折叠和靶向定位基序；（3）不同物种间密码子使用频率的差异。上述因素综合作用可能导致需要在28°C下长时间孵育，以确保外源蛋白的有效表达和膜表面定位，同时避免细胞分裂（细胞分裂会稀释外源cDNA和蛋白质）。然而，在28°C长时间孵育会导致细胞脱落和细胞膜稳定性下降，从而增加电生理记录的难度。因此，我们决定对传统的转染策略（参见Thomas和Smart，2005年综述）进行改进，以尽量减少记录前在28°C下的孵育时间，并最大化通道在细胞表面的表达。我们的方法要求细胞转染后，在28°C下孵育3至7天，随后通过胰酶消化使细胞脱离，重新接种到盖玻片上，并在37°C下孵育，以恢复膜稳定性并促进细胞牢固贴附于盖玻片。此后，细胞可立即用于记录，也可继续在28°C下额外孵育一段时间。我们发现，在该方法的后期阶段将细胞重新接种至盖玻片上，对于获得大量表达通道且彼此分离、贴附良好的细胞至关重要。

我们提出了两种替代策略：一种适用于不包含可能易受胰蛋白酶消化影响的大胞外域的离子通道及离子通道复合物（例如Cav3电压门控钙通道；Senatore和Spafford 2010）；另一种适用于包含大胞外域的离子通道（例如L型电压门控钙通道及其辅助亚基；Senatore, et al. 2010）。

1. 1. 细胞在28°C下孵育2至6天，以抑制细胞分裂并促进翻译蛋白的积累。每种离子通道的孵育时间需通过实验确定，因为表面表达水平依赖于内在因素，这些因素分别决定了通道新生mRNA和多肽序列与翻译机制及分泌途径的相互作用。
   2. 铺板前，将圆形玻璃盖玻片（Circles No. 1，厚度 0.13 至 0.17 mm；直径 12 mm，Fisher Scientific Canada，Ottawa，Ontario）用 Poly-_L-赖氨酸（Sigma），按照制造商说明书操作。
   3. 通过抽吸去除转染细胞的培养基，将1 mL 37°C的胰蛋白酶溶液（Sigma）用微量移液器加入倒置的培养瓶中（细胞面朝上）。轻轻将培养瓶翻转至直立位置，使胰蛋白酶流过细胞表面，再将培养瓶重新倒置，通过抽吸去除胰蛋白酶。随后，直接向细胞表面加入250 μL预热的胰蛋白酶，将培养瓶置于37°C孵育3–5分钟，直至细胞脱落。
   4. 同时，poly-_L将-赖氨酸包被的盖玻片放入6 mm培养皿中（每皿3-8片），并向每皿加入5 mL预热的培养基。
   5. 用移液管将胰蛋白酶消化后的细胞用4 mL预热的培养基轻轻吹打约6次，重悬细胞，然后取250–500 μL重悬细胞液，用微量移液器接种至含有盖玻片的培养皿中。在加入细胞前，先用微量移液器枪头轻压盖玻片，确保其位于培养皿底部。
   6. 将细胞在37°C孵育3小时，以使其贴附于盖玻片上，随后转移至28°C。此时细胞已准备好进行电生理记录，理想情况下应使用分离贴壁的细胞（图3展示了转染细胞在接种至盖玻片前后的状态）。若在37°C孵育时间过长，将导致细胞分裂。
2. 1. 表达具有大型胞外结构域的通道/通道复合物的细胞制备方法与上述基本相同，不同之处在于，在进行电生理记录之前，需将盖玻片在28°C下额外孵育2至4天。这一步骤有助于细胞经胰蛋白酶消化后，通道/通道复合物在细胞膜上的重新积聚。

4. 在 HEK-293T 细胞中对重组通道进行电生理记录

目前已有一些全面的资源，介绍了电生理记录的基本概念（例如 Ogden 和 Stanfield 1987；Molleman 2003）。

4.1 电生理设备

典型的电生理实验装置（图4）包括一个放大器（例如 Axopatch 200B 或 Multiclamp 700B 放大器；Axon Instruments，加利福尼亚州联合市）、一台配备 Digidata 1440A 模数转换器接口和 pClamp10.1 软件的 PC 计算机（Molecular Devices，加利福尼亚州桑尼维尔）、电动双移液器操纵器（MPC-385-2，Sutter Instrument Company）、落射荧光显微镜（Axiovert 40 CFL，Zeiss Canada，安大略省多伦多）以及灌流系统（图4和图5）。通过将设备安装在 TMC 63-500 系列减振台上（Technical Manufacturing Corporation，马萨诸塞州皮博迪），可有效减少振动干扰。使用一个高40英寸的II型法拉第笼（TMC）包围安装在减振台上的电子设备，以降低杂散电噪声。电子控制系统（如计算机和显示器、放大器、模数转换器、电动操纵器以及 Valvelink 灌流控制系统）安装在法拉第笼外的一个独立金属电气机架上（Hammond Manufacturing，安大略省圭尔夫）。所有电子设备均接地至一个铜质配电端子，并接入医用级隔离变压器（1800W，Tripp Lite UL60601-1），以提供线路隔离、稳定的接地和浪涌抑制。

4.2 膜片钳电极

将带丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径0.86 mm，长度15 cm；货号BF150-86-15；Sutter Instrument Company）切成两半，插入Flaming/Brown微电极拉制仪（P-97型，Sutter Instrument Company）。优化拉制程序，以稳定制备出电极对地电阻在2至5 MΩ之间的微电极（经火焰抛光后；图6）。每个微电极均单独进行火焰抛光，以平滑尖端表面，从而实现与细胞膜之间的紧密封接（Micro Forge MF-830；Narishige，日本；图6）。微电极使用专用支架（1-HL-U；Molecular Devices，加利福尼亚州森尼韦尔）安装在放大器头级上。

4.3 接地电极

用于制作膜片钳电极的硼硅酸盐玻璃管也可用于制备参比电极。将15厘米长的玻璃管切割成3段。用两把尖头镊子夹住玻璃管，在本生灯火焰中加热，直至玻璃变软，可将玻璃管弯成具有90°角的“L”形或“曲棍球杆”形。当玻璃管仍处于高温状态时，立即将一端浸入预热的含3M CsCl和1.5%琼脂糖的溶液中，溶液通过毛细作用被吸入管内。一旦参比电极完全充满溶液，即将其放入盛有冷水的烧杯中冷却。所有参比电极填充完毕后，逐个用Kimwipe纸巾轻轻擦拭，去除外壁多余的琼脂糖，并将其浸入3M CsCl溶液中保存。在进行电生理记录时，参比电极被固定在微电极夹持半电池（Microelectrode Holder Half-Cells，型号：Holder 90 F Pellet 1.5mm；货号：#MEH3RF15；World Precision Instruments Inc.，佛罗里达州萨拉索塔）中，且夹持器内需填充3M CsCl溶液。（参见图7，示意图显示接地电极置于浴液中）

4.4 电生理记录溶液

不同类型的电压门控离子通道根据离子通透性/选择性的差异，需要使用不同的记录溶液。对于电压门控钙通道，细胞通常浸浴在含有不同浓度钡离子或钙离子的外部溶液中。例如，对无脊椎动物Cav3型电压门控钙通道（LCav3）进行电生理记录时，可使用含5 mM CaCl₂的外部溶液进行记录。₂，166 mM 四乙基氯化铵（TEA-Cl）、10 mM HEPES，用 TEA-OH 调节 pH 至 7.4。膜片钳电极内充以含 125 mM CsCl、10 mM EGTA、2 mM CaCl 的内液₂，1 mM MgCl₂，4 mM MgATP，0.3 mM Tris-GTP 和 10 mM HEPES，pH 值为 7.2（Senatore 和 Spafford，2010）。可使用含钡离子作为电荷载体的外液记录无脊椎动物L型电压门控钙通道（LCav1）（15 mM BaCl₂，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES，pH 7.4）₂，10 mM HEPES、40 mM TEA-Cl、72.5 mM CsCl、10 mM 葡萄糖，用 TEA-OH 调节 pH 至 7.2）以及含 108 mM 钙甲烷磺酸盐、4 mM MgCl₂ 的内液₂，9 mM EGTA，9 mM HEPES，用CsOH调节pH至7.2（Senatore 等, 2010).

4.5 全细胞记录

1. 将含有转染细胞（表达异源离子通道或离子通道复合物）的盖玻片转移至一个含有约 3 mL 外部记录液的 35 mm 塑料培养皿中。在进行需要通过微量移液器向培养皿中添加已知量药物的药物实验时，必须准确测量记录液的体积。电生理记录通常在室温下进行，但研究人员可根据实验需求调整温度。
2. 通过落射荧光显微镜观察细胞，并将视野中央的一个孤立、转染阳性且贴壁的绿色细胞居中定位。
3. 使用显微操作器将膜片钳电极移入浴液中，从而完成膜片钳电极内电极与参考电极之间的电路连接。在浴液模式下，pClamp10.1 软件会驱动放大器在电极与参考电极之间产生微小的重复电压阶跃，并将产生的电流以方波轨迹形式显示（图 8A）。在对细胞进行封接前，必须使用放大器上的电极偏移调节功能将该方波轨迹调零。pClamp10.1 软件测量电极电阻，其值应在 2–5 MΩ 范围内。
4. 在浴液模式下，将电极移至靠近细胞的位置，此时可在方波轨迹上观察到快速波动；随后对膜片钳电极施加轻微吸力，以在电极与细胞膜之间形成吉欧姆封接（表现为方波轨迹完全变为一条直线；图 8B）。
5. 随后将程序切换至膜片模式，并使用放大器上的电极电容补偿功能，对电极电容（表现为平坦电流轨迹前沿和后沿出现的小电流尖峰；图 8B）进行补偿。
6. 施加短暂而锐利的吸力，以破裂膜片中的细胞膜，使电极进入细胞内部。成功的膜破裂表现为电流轨迹前沿和后沿出现较大的电容瞬变（图 8C）。一旦破膜成功，即将程序切换至细胞模式，并调节放大器上的全细胞电容补偿，以消除电容瞬变。记录前需等待数分钟，以使细胞内记录液在细胞内充分平衡。
7. 使用配备 Digidata 1440A 模数转换接口的计算机，结合 pClamp10.1 软件生成电压指令并采集数据。针对每个实验设计特定的电压钳制方案，用于记录转染细胞中的离子通道电流。图 9 展示了在表达无脊椎动物 LCav3 电压门控钙通道的 HEK-293T 细胞中记录到的钙电流。细胞钳制在 -110 mV 电压下，并施加从 -70 mV 到 +20 mV 的逐步去极化脉冲，以诱发内向钙电流。
8. 记录到的电流使用低通贝塞尔滤波器在 10 kHz 条件下滤波，并以 2 kHz 的采样频率进行数字化。仅选用漏电流极小（<10%）的记录数据进行分析，离线漏电流扣除使用 Clampfit 10.1 软件完成。

4.6 记录细胞的药物研究

药物可直接用移液器加入正在记录的培养皿中。如果已知所加药物的体积和灌流液的体积，即可计算药物浓度。对于昂贵或用量有限的药物，也可通过多通道歧管聚酰亚胺灌流笔（带可拆卸的250微米尖端）进行微灌流给药，灌流系统可选用八通道Smartsquirt加压微灌流系统（AutoMate Scientific），或通过特氟龙阀门和Valvelink8阀门控制器（AutoMate Scientific）操作的重力灌流系统（灌流系统设置见图5）。微灌流系统的流速设定为每分钟0.1 mL，灌流笔出口距离记录细胞400微米。灌流笔尖端与记录电极尖端之间的距离应在每次封接之间保持一致；图10展示了在40倍放大倍数下建议的距离。适当的流速可确保对记录细胞实现充分饱和的灌流。在使用微灌流进行药物实验前，需先用对照灌流液持续微灌流使细胞达到平衡状态。实验过程中应尽量减少对灌流液流的中断，通过快速切换控制灌流液、药物溶液或洗脱液来实现。可在记录皿边缘安装吸液装置，通过注射器手动抽吸或使用蠕动泵驱动装置（例如MINISTAR微型直流蠕动泵，World Precision Instruments）去除多余的液体。需格外注意，过快的灌流速度会产生剪切力，可能改变钙电流（Peng et al. 2005），导致记录的细胞被冲走，并过快耗尽药物储备。

直接移液至培养皿与灌流系统的比较

	直接移液	微灌注系统	重力流灌注系统
所需药物体积	中等	低	高
技术要求	低	中等	中等
设备成本	低	较高	较高
每日设置与清理所需时间	无需	20分钟以上	20分钟以上
设备污染风险	无	有	有
故障排查	容易	复杂	复杂
能否确保药物进入培养皿	是	否	否
加药时是否会导致细胞丢失	是	是	是
通过换液大幅降低药物浓度的难易程度	困难	直接简便	直接简便
进行多剂量反应曲线实验的便捷性	不够理想	直接简便	直接简便
结果的可重复性	一般 — 依赖于移液位置	良好	良好

讨论

能够使用所述方案和溶液记录到全细胞电流，表明转染成功，且目标电压门控离子通道或离子通道复合物已在细胞膜上以可观的量存在。如果细胞呈阳性转染（即呈现绿色荧光），但无法记录到电流，则可能需要延长在28°C的孵育时间，以使通道蛋白得以正确组装并插入细胞膜。需注意，长时间在28°C孵育会导致细胞从盖玻片上脱落，细胞膜稳定性下降，并积累死亡细胞的碎片，从而增加膜片钳记录的难度。本方案中建议的所有时间参数均针对我们研究的特定通道进行了优化。其他通道及其亚基可能需要更长或更短的孵育时间，可根据实际情况进一步调整本方案。对于某些通道而言，较低的转染效率（即荧光细胞较少且单个细胞荧光强度较低）反而比高效转染、高荧光强度的细胞获得更好的实验结果。若细胞具有荧光但无法记录到电流，可能的问题包括：缺乏辅助蛋白；转染试剂混合不充分；记录溶液非最适条件；或通道或通道亚基的cDNA构建体发生突变或重组，导致蛋白错误折叠或无法表达。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pIRES2-EGFP 质粒	Clontech Laboratories	6029-1
圆形玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-80	圆片编号1——厚度0.13至0.17毫米，尺寸：12毫米
放大器	Axon Instruments	Axopatch 200B 或 Multiclamp 700B
数据采集系统	Axon Instruments	Digidata 1440A
电生理学软件	Axon Instruments	pClamp10.1
移液器操作器	Sutter Instrument Co.	MPC-385-2
倒置荧光显微镜	卡尔·蔡司股份公司	Axiovert 40 CFL
前置放大器	Axon Instruments	CV-7B
头端电极夹	Axon Instruments	1-HL-U
显微镜–接地电极用的电极夹	World Precision Instruments, Inc.	MEH3RF 15
电生理学毛细管	Sutter Instrument Co.	BF-150-86-15	含细丝硼硅酸盐玻璃管，外径1.5 mm，外径0.86 mm，长15 cm
弗拉明/布朗微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
微移液管火焰抛光仪	Narishige International	Micro Forge MF-830
微型药物灌注系统	AutoMate Scientific, Inc.	SmartSquirt8 Valvelink8.2
药物灌注系统	AutoMate Scientific, Inc.	Valvelink8.2 配备聚四氟乙烯阀门