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方法文章

白三烯B4介导的细胞迁移及BLT1与β-arrestin相互作用的实时成像

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DOI：

10.3791/2315

⸱

2010年12月23日

 , 
1Microbiology and Immunology, James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville

本文内容

摘要

本文介绍了利用活细胞成像技术测定白细胞对特定配体的趋化反应，并鉴定细胞表面受体与胞质蛋白之间相互作用的方法。

摘要

G蛋白偶联受体（GPCRs）属于七次跨膜蛋白家族，可介导细胞外信号向细胞内反应的转导。GPCRs通过异源三聚体G蛋白以配体依赖的方式调控多种生物学功能，如趋化性、细胞内钙释放和基因调控1-2。配体结合会引发一系列构象变化，导致异源三聚体G蛋白活化，进而调节环磷酸腺苷（cAMP）、三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG）等第二信使的水平。在受体活化的同时，配体结合也启动一系列事件，通过脱敏、隔离和/或内化来减弱受体信号传导。GPCRs的脱敏过程主要通过G蛋白偶联受体激酶（GRKs）介导的受体磷酸化以及随后β-阻遏蛋白（β-arrestins）的结合来实现3。β-阻遏蛋白是胞质蛋白，在GPCR活化后转位至细胞膜，结合磷酸化的受体（多数情况下），从而促进受体内化4-6。

白三烯B4（LTB4）是一种来源于花生四烯酸通路的促炎性脂质分子，通过G蛋白偶联受体（GPCR）——白三烯B4受体1（BLT1，高亲和力受体）和白三烯B4受体2（BLT2，低亲和力受体）介导其生物学作用7-9。研究表明，LTB4-BLT1信号通路在多种炎症性疾病中发挥关键作用，包括哮喘、关节炎和动脉粥样硬化10-17。本文描述了利用显微成像技术在活细胞中监测LTB4诱导的白细胞迁移、BLT1与β-阻遏蛋白的相互作用以及受体转位过程的方法学18-19。

从小鼠C57BL/6骨髓中分离并培养树突状细胞，方法如前所述20-21。这些细胞通过活细胞成像技术检测，以展示LTB4诱导的细胞迁移。将人源BLT1受体C末端标记红色荧光蛋白（BLT1-RFP），β-阻遏蛋白1（β-arrestin1）标记绿色荧光蛋白（β-arr-GFP），并将两种质粒共转染至大鼠嗜碱性白血病（RBL-2H3）细胞系中18-19。利用活细胞视频显微镜监测这些蛋白之间的相互作用动力学及其定位变化。本文所述方法介绍了如何使用显微技术研究活细胞中G蛋白偶联受体的功能反应，同时还描述了使用Metamorph软件定量荧光强度，以确定受体与胞质蛋白相互作用的动力学过程。

方案

方法

显微镜描述

使用连接于尼康倒置显微镜Eclipse TE300的TE-FM落射荧光系统进行活细胞成像实验。显微镜配备有加热载物台。一台Cool Snap HQ数字黑白CCD相机（Roper Scientific）和LAMDA 10-2光学滤光轮（Sutter仪器公司）连接在显微镜上。激发和发射波长通过滤光轮进行控制，并由Lamba 10-2滤光轮控制器（Sutter Instruments Co.）调节。500 ms的曝光时间足以观察活细胞中的RFP或GFP。硬件控制与图像采集由Metamorph软件完成。本研究所选用的滤光片组合分别为：GFP使用S480/20x、S525/40m，RFP使用S565/25x、S620/60m；双通道EGFP/DsRed二向色镜来自Chroma Technology。该滤光轮最多可容纳六组滤光片。显微镜配备Prior Proscan带操纵杆的载物台控制器。所有这些硬件组件均可通过Metamorph软件进行控制。显微镜还连接有微操作器，用于固定微移液管。

A. 白三烯B4诱导的树突状细胞迁移的测定

使用上述显微镜设置，我们建立了实时追踪配体导向树突状细胞迁移的方法。将两台微操作仪（Narishige）连接至显微镜。小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）向LTB4 记录了浓度梯度。本文描述了使用微电极拉制仪制备微移液管、将配体载入微移液管，以及在显微镜加热载物台上建立趋化实验以监测细胞定向迁移的方法。该方法可用于检测不同趋化因子诱导细胞迁移的有效性，以及趋化抑制剂对活细胞的作用。骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的分离21 来自小鼠的研究已在包括JoVE在内的多篇出版物中有所描述22.

1. 骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的制备

  1. 将培养10天后的BMDC接种至盖玻片底荧光培养皿中，实验前继续培养16小时。
  2. 用3 mL 1×PBS洗涤细胞至少2次（每次加入3 mL 1×PBS，随后吸出缓冲液）。
  3. 向培养皿中加入2 mL 1×PBS。细胞现已准备好进行实验。实验前将细胞置于37 °C培养箱中保存。

配体负载微移液管的制备：

  1. 将玻璃毛细管（Glass standard，0.75 mm × 0.4 mm；6英寸，货号 625500，A.M. Systems, INC）固定在垂直毛细管拉制仪（Narishige International USA, Inc）上。
  2. 保持温度为 52 °C，使玻璃熔化并拉断，形成尖锐的管尖。
  3. 将毛细管固定在显微注射器持针器上。
  4. 在显微镜下观察，使用微电极抛光仪（Micro forge M-900，Narishige International USA, Inc）修整微电极的粗糙边缘。
  5. 每次实验至少准备 10–20 根毛细管。 注意：微电极也可从 World Precision Instruments 公司购买（μ TIP，T1801TW1F）。
  6. 取所需浓度的配体（本实验中为 500 μL 的 100 nM LTB4）加入 1 mL 离心管中，将微电极尖端浸入溶液中，使溶液通过反向填充进入微电极内部。
  7. 取 1 mL 配体溶液注入注射器（1 cc 结核菌素注射器），并通过 Micro-Fill 针头（MF 28G-5，World Precision Instruments）从顶部缓慢将配体注入微电极中。
  8. 将与毛细管紧密贴合的导管连接至已装有配体的 1 mL 注射器上的针头（21 G 11/2），并连接毛细管。
  9. 现在，小心地将装有配体的微电极移至显微镜载物台上，并固定在显微操作器上。
  10. 从注射器施加轻微压力，确保配体从尖端缓慢释放。
  11. 将培养有未成熟骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的培养板移至显微镜下，并置于加热载物台（37 °C）上。
  12. 移除荧光培养皿的盖子。
  13. 使用油浸 60X 物镜聚焦细胞。
  14. 使用“粗调手动操作器 MN-188NE”小心地将装载配体的微电极下降至细胞附近。
  15. 使用“液压精细显微操作器 MN-188 NE”对微电极进行精细聚焦。
  16. 从注射器施加轻微压力，确保配体正在释放到培养皿中。
  17. 使用 Metamorph 软件设置图像采集参数：每 15 秒采集一次明场图像（曝光时间 10 ms），持续 2 小时。
  18. 每 30 分钟观察一次细胞向配体迁移的进展情况。
  19. 若细胞在微电极尖端聚集，应更换尖端在培养板中的位置，以继续实验中的迁移过程。

B. 活细胞中 GPCR（BLT1）与胞质蛋白（β-arrestin）相互作用及转位的测定

1. 质粒DNA构建体的制备

DNA质粒构建体的详细信息见Jala 等（2005）18。

2. 将人源 BLT1-RFP 和 β-阻遏蛋白-GFP 转染入 RBL-2H3 细胞

  1. 在 T75 培养瓶中，使用生长培养基（DMEM 添加 15% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素），于 37 °C、95% 空气与 5% CO2 的湿化环境中，以单层培养方式维持大鼠嗜碱性白血病细胞（RBL-2H3）（细胞融合度为 60% 至 70%）。
  2. 使用 6 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA）处理培养皿/培养瓶中的细胞，在 37 °C、95% 空气与 5% CO2 的湿化环境中孵育 5 分钟，使细胞脱落。轻轻摇动培养瓶以观察细胞脱落程度。
  3. 向含有 6 mL 胰蛋白酶-EDTA 的培养瓶中加入 6 mL 生长培养基，通过反复吹打混匀以收集细胞，并将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
  4. 使用血细胞计数板计数细胞，并取 4 × 106 个细胞转移至 15 mL 离心管中，以 480g rpm 离心 3 分钟，随后重悬于 200 μL 转染培养基（DMEM，20% FBS，50 mM HEPES）中。若计划进行 3 次转染，应相应增加细胞数量和转染培养基体积。
  5. 将待转染的质粒配制至浓度不低于 1.5 μg/μL。我们使用 QIAGEN 大提质粒试剂盒制备 DNA 质粒。将编码人 BLT1-RFP（25 μg）和 β-arrestin1-GFP（15 μg）的单个或双质粒 DNA 加入无菌电穿孔比色皿（Bio-Rad # 16552088，电极间隙为 0.4 cm）中。
  6. 取上述重悬细胞 200 μL，加入含有 hBLT1-RFP 或 β-arrestin1-GFP 或两者共存的电穿孔比色皿中，用 1 mL 无菌移液枪轻轻混匀。
  7. 将上述比色皿于室温放置 10 分钟。
  8. 使用 Gene Pulser II 电穿孔仪对细胞进行电穿孔，设定电压为 250 V，电容为 500 μF。
  9. 电穿孔完成后，将细胞在室温下继续静置 10 分钟。
  10. 取 1 mL 常规生长培养基，加入电穿孔后的比色皿中与细胞混合。
  11. 将 300 μL 上述混合液接种至含有 2 mL 常规生长培养基的 35 mm 玻璃底组织培养皿（Fluoro dish，World Precision Instruments）中，于 37 °C、95% 空气与 5% CO2 的湿化环境中孵育 1 小时，使细胞贴壁。
  12. 孵育 1 小时后更换为常规生长培养基，继续在 37 °C、95% 空气与 5% CO2 的湿化培养箱中培养 18–24 小时。

3. 活细胞成像

图像采集

  1. 孵育 18–24 小时后，用 2 mL 温热的不含酚红的 RPMI 培养基（含 10 mM HEPES，pH 7.55）洗涤细胞 2 至 3 次（直接向培养板中加入 2 mL 温热培养基，随后吸除。重复 2 至 3 次）。然后加入 1.8 mL 温热的不含酚红的 RPMI 培养基（含 10 mM HEPES）。
  2. 将转染了 hBLT1-RFP 和 β-arrestin1-GFP 的 RBL-2H3 细胞接种于 30 mm 玻璃底培养皿中，并置于加热的显微镜载物台上（37 °C）。
  3. 使用 Nikon Plan Apo 60X/1.4 数值孔径油浸物镜（本显微镜系统配备），在 600 倍放大倍数下采集细胞图像。
  4. 在 60 倍物镜上滴加一滴浸油，通过透射明场照明并轻触培养皿底部对细胞进行调焦。
  5. 为监测转染蛋白的荧光信号，将光源从明场（透射光）切换至荧光滤光片（若需观察受体则使用 RFP 滤光片，若需观察 β-arrestin1 则使用 GFP 滤光片）。
  6. 选择表达 hBLT1-RFP 且状态良好、荧光明亮的细胞，使用 RFP 滤光片观察并采集图像。
  7. 随后切换至 GFP 滤光片，确认 β-arrestin-GFP 在细胞质中的表达并采集图像。在采集延时活细胞成像前，对两幅图像进行伪彩着色，以确保 RFP 与 GFP 之间无荧光串色。
  8. 选定目标细胞后，根据实验目的通过软件（本实验使用 Metamorph 软件）设置采集参数。
  9. 在本实验中，使用相机 1×1 binning 模式，结合 Nikon Plan Apo 60X/1.4 数值孔径油浸物镜，采集 16 位图像。
  10. 通过 Metamorph 软件控制滤光轮，以 30 秒时间间隔同步采集 RFP 和 GFP 荧光染料的荧光图像（若转位/相互作用过程较快，可缩短时间间隔）。
  11. RFP 和 GFP 的相机曝光时间均设置为 1000 毫秒（可根据 RFP 和 GFP 的实际荧光强度调整具体曝光时间）。
  12. 首先在未添加配体的情况下采集 1 分钟的图像，作为 0 时间点。
  13. 1 分钟后，向培养体系中加入 200 μL 配体（由 10 μM 储液稀释至终浓度 1 μM），操作时避免扰动培养皿或细胞位置。
  14. 添加配体后，继续采集 60 分钟的荧光图像，并按文件名递增顺序保存为 TIFF 格式图像。
  15. 所有图像文件可通过软件合并为带有时间戳的堆栈文件，用于单独或合并分析荧光图像。

蛋白质荧光图像处理与定位分析

  1. 使用不含细胞的普通培养基，通过RFP和GFP荧光滤光片获取图像，并将其保存为背景图像。使用这些图像从上述获得的实际数据图像中进行减除。
  2. 分别对RFP和GFP图像制备图像堆栈。
  3. 选择/定义不同区域（表面与胞质），以测量RFP和GFP的荧光强度（BLT1和β-arrestin的转位）。
  4. 绘制荧光强度随时间变化的曲线图。该图将提供有关特定分子转位动力学的信息。

代表性结果

A. 测定白三烯B4诱导的树突状细胞迁移

本方案中所述方法用于测定树突状细胞向白三烯B4的迁移能力（图1及附带视频1）21。我们可采用类似方法测定活细胞对特定配体的趋化能力。

实验装置中显微注射针进行细胞注射过程的显微镜图像。
图1. 小鼠骨髓来源树突状细胞向100 nM LTB4的迁移。

视频 1. BMDCs 向 LTB4 的活细胞迁移。 点击此处观看视频。

B. 在活细胞中测量 GPCR（BLT1）与胞质蛋白（β-arrestin）的相互作用及转位

完成此操作后，可获得 GPCR 信号转导事件中的以下信息。

  1. GPCR、胞质蛋白与细胞核的定位（图 2）。
  2. 配体诱导的细胞表面 GPCR（本例中为 BLT1）与胞质蛋白（本例中为 β-arrestin）的相互作用（图 3）。
  3. 受体内吞及 β-arrestin 向细胞膜转位并随受体共同内吞的动力学过程（图 4）（Jala et al. 2005）18。
  4. 可在活细胞中测定配体依赖性受体激活状态（见视频 2）并确定受体激活过程中涉及的关键基序或过程（Jala et al. 2005）18。

荧光显微镜示意图；细胞上的红色、绿色、蓝色染料；蛋白质定位研究。
图 2. BLT1-RFP（A）、β-arrestin-GFP（B）、pNuc-CFP（C）在 RBL-2H3 细胞中的表达。颜色叠加图像显示于 D 图。

细胞荧光衰减；线扫描分析；时间推移成像；灰度强度图。
图3. 配体诱导的受体与β-阻遏蛋白转位。图中显示了细胞中荧光强度的线扫描结果。

30分钟内hBLT1的延时荧光显微镜图像及轨迹图、荧光衰减分析、细胞定位研究。
图4. 加入1 μM LTB4后受体内化和β-阻遏蛋白转位的动力学。荧光强度在细胞膜和胞质区域随时间变化进行测定。

视频 2 加入 1 μM LTB4 后，表达 BLT1-RFP 和 β-阻遏蛋白-GFP 的细胞的活体成像。点击此处观看视频

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讨论

活细胞成像是一种强大的工具，可用于实时展示特定蛋白质的功能及其相互作用。本论文中描述的方法明确表明LTB4 可诱导树突状细胞的快速迁移。这些方法不仅拓展了LTB的研究层面4 功能多样化的细胞类型，使得类似方法可应用于多种其他趋化因子，并检测其作为趋化剂对不同白细胞亚群的作用效果。该系统中的荧光成像技术可实现对信号转导事件的实时监测。此外，这些方法还可进一步拓展用于研究分子间的紧密相互作用 体内 通过使用带有合适荧光染料标记的分子，检测荧光共振能量转移（FRET）。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院基金 AI-52381、CA138623、肯塔基州肺癌研究委员会以及詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心的机构支持资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
大鼠嗜碱性白血病细胞系（RBL-2H3）或HEK293细胞。ATCCCRL-2256
德博尔梅’s 改良伊格尔’DMEM培养基Invitrogen11995
无酚红 RPMI 或 DMEMInvitrogen11835-030
胎牛血清Invitrogen16000-044
L-谷氨酰胺（200 mM）Invitrogen25030
青霉素-链霉素（10000 U/mL）Invitrogen15140
0.05%（1X）含EDTA 4Na液体胰蛋白酶Invitrogen25300
HEPES (1 M)Invitrogen15630
35 mm 无菌玻璃盖玻片底荧光培养皿（0.17 mm 厚）（WillCo-dish）World Precision Instruments, Inc.FD35-100
无菌基因脉冲电击杯（0.4 cm 电极间隙）（Bio-Rad）Bio-Rad16552088
Gene Pulser II 电穿孔仪 伯乐（Bio-Rad）
尼康倒置显微镜Eclipse TE300配备的TE-FM落射荧光系统尼康仪器公司
Metamorph 软件通用成像
垂直微移液管拉制仪Narishige International
Micro-Forge M-900Narishige International
液压显微操作器 MO-188NENarishige International
粗调手动操作器，MN-188NENarishige International
<强>cDNA 构建体：
C末端带红色荧光蛋白标签的G蛋白偶联受体cDNA（hBLT1-RFP）Jala 等，2005
带有GFP标签的细胞质蛋白的cDNA（β-arrestin1-GFP 在本研究中）Jala 等，2005

参考文献

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