本文介绍了利用活细胞成像技术测定白细胞对特定配体的趋化反应，并鉴定细胞表面受体与胞质蛋白之间相互作用的方法。
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摘要
摘要
G蛋白偶联受体（GPCRs）属于七次跨膜蛋白家族，可介导细胞外信号向细胞内反应的转导。GPCRs通过异源三聚体G蛋白以配体依赖的方式调控多种生物学功能，如趋化性、细胞内钙释放和基因调控1-2。配体结合会引发一系列构象变化，导致异源三聚体G蛋白活化，进而调节环磷酸腺苷（cAMP）、三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG）等第二信使的水平。在受体活化的同时，配体结合也启动一系列事件，通过脱敏、隔离和/或内化来减弱受体信号传导。GPCRs的脱敏过程主要通过G蛋白偶联受体激酶（GRKs）介导的受体磷酸化以及随后β-阻遏蛋白（β-arrestins）的结合来实现3。β-阻遏蛋白是胞质蛋白，在GPCR活化后转位至细胞膜，结合磷酸化的受体（多数情况下），从而促进受体内化4-6。
白三烯B4（LTB4）是一种来源于花生四烯酸通路的促炎性脂质分子，通过G蛋白偶联受体（GPCR）——白三烯B4受体1（BLT1，高亲和力受体）和白三烯B4受体2（BLT2，低亲和力受体）介导其生物学作用7-9。研究表明，LTB4-BLT1信号通路在多种炎症性疾病中发挥关键作用，包括哮喘、关节炎和动脉粥样硬化10-17。本文描述了利用显微成像技术在活细胞中监测LTB4诱导的白细胞迁移、BLT1与β-阻遏蛋白的相互作用以及受体转位过程的方法学18-19。
从小鼠C57BL/6骨髓中分离并培养树突状细胞，方法如前所述20-21。这些细胞通过活细胞成像技术检测，以展示LTB4诱导的细胞迁移。将人源BLT1受体C末端标记红色荧光蛋白（BLT1-RFP），β-阻遏蛋白1（β-arrestin1）标记绿色荧光蛋白（β-arr-GFP），并将两种质粒共转染至大鼠嗜碱性白血病（RBL-2H3）细胞系中18-19。利用活细胞视频显微镜监测这些蛋白之间的相互作用动力学及其定位变化。本文所述方法介绍了如何使用显微技术研究活细胞中G蛋白偶联受体的功能反应，同时还描述了使用Metamorph软件定量荧光强度，以确定受体与胞质蛋白相互作用的动力学过程。
方案
方法
显微镜描述
使用连接于尼康倒置显微镜Eclipse TE300的TE-FM落射荧光系统进行活细胞成像实验。显微镜配备有加热载物台。一台Cool Snap HQ数字黑白CCD相机（Roper Scientific）和LAMDA 10-2光学滤光轮（Sutter仪器公司）连接在显微镜上。激发和发射波长通过滤光轮进行控制，并由Lamba 10-2滤光轮控制器（Sutter Instruments Co.）调节。500 ms的曝光时间足以观察活细胞中的RFP或GFP。硬件控制与图像采集由Metamorph软件完成。本研究所选用的滤光片组合分别为：GFP使用S480/20x、S525/40m，RFP使用S565/25x、S620/60m；双通道EGFP/DsRed二向色镜来自Chroma Technology。该滤光轮最多可容纳六组滤光片。显微镜配备Prior Proscan带操纵杆的载物台控制器。所有这些硬件组件均可通过Metamorph软件进行控制。显微镜还连接有微操作器，用于固定微移液管。
A. 白三烯B4诱导的树突状细胞迁移的测定
使用上述显微镜设置，我们建立了实时追踪配体导向树突状细胞迁移的方法。将两台微操作仪（Narishige）连接至显微镜。小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）向LTB....
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讨论
活细胞成像是一种强大的工具，可用于实时展示特定蛋白质的功能及其相互作用。本论文中描述的方法明确表明LTB4 可诱导树突状细胞的快速迁移。这些方法不仅拓展了LTB的研究层面4 功能多样化的细胞类型，使得类似方法可应用于多种其他趋化因子，并检测其作为趋化剂对不同白细胞亚群的作用效果。该系统中的荧光成像技术可实现对信号转导事件的实时监测。此外，这些方法还可进一步拓展用于研究分子间的紧密相互作用 体内 通过使用带有合适荧光染料标记的分子，检测荧光共振能量转移（FRET）。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院基金 AI-52381、CA138623、肯塔基州肺癌研究委员会以及詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心的机构支持资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠嗜碱性白血病细胞系（RBL-2H3）或HEK293细胞。 | ATCC | CRL-2256 | |
| 德博尔梅’s 改良伊格尔’DMEM培养基 | Invitrogen | 11995 | |
| 无酚红 RPMI 或 DMEM | Invitrogen | 11835-030 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Invitrogen | 25030 | |
| 青霉素-链霉素（10000 U/mL） | Invitrogen | 15140 | |
| 0.05%（1X）含EDTA 4Na液体胰蛋白酶 | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen | 15630 | |
| 35 mm 无菌玻璃盖玻片底荧光培养皿（0.17 mm 厚）（WillCo-dish） | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| 无菌基因脉冲电击杯（0.4 cm 电极间隙）（Bio-Rad） | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II 电穿孔仪 | 伯乐（Bio-Rad） | ||
| 尼康倒置显微镜Eclipse TE300配备的TE-FM落射荧光系统 | 尼康仪器公司 | ||
| Metamorph 软件 | 通用成像 | ||
| 垂直微移液管拉制仪 | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| 液压显微操作器 MO-188NE | Narishige International | ||
| 粗调手动操作器，MN-188NE | Narishige International | ||
| <强>cDNA 构建体： | |||
| C末端带红色荧光蛋白标签的G蛋白偶联受体cDNA（hBLT1-RFP） | Jala 等，2005 | ||
| 带有GFP标签的细胞质蛋白的cDNA（β-arrestin1-GFP 在本研究中） | Jala 等，2005 |
参考文献
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved i....
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